饲料中两种二氢查耳酮含量的同时分离检测方法

摘要

本发明公开了饲料中两种二氢查耳酮含量的同时分离检测方法，所述的两种二氢查耳酮为新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮,方法包括如下步骤：(1)制备混合标准储备液和混合标准工作液；(2)制备待测样品溶液；(3)高效液相色谱分析条件；(4)建立标准工作曲线；(5)结果分析;本方法建立了饲料中新橙皮苷二氢查耳酮（NHDC）和柚皮苷二氢查耳酮（Naringin DC）的固相萃取‑高效液相色谱法。

说明书

技术领域

本发明涉及饲料领域，尤其涉及二氢查耳酮类甜味剂含量的检测方法，具体是指饲料中新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮的固相萃取-高效液相色谱同时分离检测方法。

背景技术

二氢查耳酮衍生物具有甜度高，持续时间长，稳定性好等优点，在饲料工业中有着良好的应用。其作为调味剂加入饲料中能产生持久的新鲜甜味效应，与其他甜味剂复配能起协同作用，可增进仔猪食欲，促进生长，改善母猪产后进食，缩短产后恢复时间。此外，由于其极佳的苦味掩蔽和增香作用，能大大改善饲料本身的风味和适口性，掩盖饲料中添加药物或甜味剂诸如糖精、甜菊糖等带来的苦味。欧盟法规（EU）2015/264已批准新橙皮苷二氢查耳酮可作为调味剂加入鱼、羊、狗、小牛和某些类别的猪饲料中，中国《饲料添加剂安全使用规范（2017年修订版）》允许其作为猪饲料甜味剂使用，上述法规规定最高限量均不得超过35 mg/kg。

目前，柚皮苷二氢查耳酮的检测方法尚未见报道，新橙皮苷二氢查耳酮的测定方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）^[14-21]、毛细管区带电泳法（CZE）、电化学传感器法等。高效液相色谱-串联质谱法质谱仪器仪器昂贵，检测成本较高，难以普及应用；毛细管电泳法重现性较差、检测灵敏度较低；电化学传感器稳定性较差，仪器使用寿命较短导致检测成本提高；因此有必要进行改革创新。

发明内容

本发明的目的在于提供一种饲料中两种二氢查耳酮含量的同时分离检测方法，为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

该方法是一种能够实现饲料中两种二氢查耳酮含量的同时分离检测方法，其主要特点是，所述的两种二氢查耳酮为新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮，所述的检测方法包括：

本发明的饲料中两种二氢查耳酮含量的同时分离检测方法，其包括如下步骤：

（1）制备混合标准储备液和混合标准工作液，所述混合标准储备液均为980 mg/L的混标储备液，混合标准工作液为将二氢查耳酮的标准储备液采用逐级稀释法用50%甲醇溶液配制浓度为0.196 mg/L、0.490 mg/L、0.980 mg/L、4.90 mg/L、9.80 mg/L、49.0 mg/L的系列标准工作溶液；

（2）制备待测样品溶液：饲料样品加入70 mL甲醇溶液，置于超声波振荡器中超声萃取30 min，转移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线并混匀。提取液于10000 r/min下离心3 min，取上清液10 mL于50 mL鸡心瓶中，旋转蒸发仪上于40 ℃下旋至近干，用2 mL 50%甲醇溶液分两次涡旋溶解后转移至50 mL离心管中，加入8 mL纯水，于10000 r/min下离心3min，过HLB固相萃取小柱净化。净化液氮吹至0.5 mL，加入50%甲醇溶液定容至1.0 mL，混匀，以尼龙66有机滤膜过滤，滤液供分析用。

（3）所用仪器为高效液相色谱仪，检测器为光电二极管阵列检测器。色谱柱为反相C18柱，柱温为35±1 ℃，检测波长282nm。流动相A为甲醇，流动相B为纯水；洗脱梯度程序:0～ 15.0 min，43% A；15.0 ～ 15.5 min，43% ～ 90% A；15.5 ～ 20.0 min，90% A；20.0～ 20.5 min，90% ～ 43% A；20.5 ～ 25.0 min，43% A。流速1.0 mL / min；进样量25 μL。

（4）标准曲线的绘制：将两种二氢查耳酮类甜味剂的系列混合标准工作溶液注入高效液相色谱仪中，在步骤（3）的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，以保留时间定性，根据各浓度所测峰面积的大小与其浓度的对应关系绘制标准曲线。

（5）结果分析：取步骤（2）中滤液注入高效液相色谱仪中，在步骤（3）的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，测得滤液中各目标物的峰面积，以保留时间定性，根据步骤（4）中制作的标准曲线定量，计算出待测样品中各新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮的含量。

与现有技术相比较，本发明具有以下突出优点：

1.本发明填补了饲料中二氢查耳酮类甜味剂含量检测领域空白，考虑到新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮最大吸收波长几乎相同，选择C18柱为固定相，不断优化流动相组成和比例，研究得出适合本发明新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮含量分离的色谱条件，使得各目标物能够完全分离，同时获得最佳峰型和灵敏度。

2.本发明采用了一系列的操作以保证该检测方法具有极高的检测灵敏度满足饲料企业在饲料中的新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮添加要求，包括为了实现较大的进样量体积来保证高灵敏度，将标准溶液的配制溶液由甲醇溶液改成50%的甲醇溶液，以减低溶剂效应的影响；同时采取较大的饲料样品称样克数；此外还采取了浓缩的办法，将检测灵敏度提高10倍。

3.本发明采用固相萃取法对复杂的饲料样品进行了净化，有效避免了更多干扰成分的带入，抗干扰能力强，这对于复杂基质中低含量二氢查尔酮类甜味剂物质的检测尤为重要。

4.本发明具有极高的检测灵敏度，定量限低至0.016mg/kg，远低于欧盟所采用的检测方法（定量限为0.8 mg/kg）和相关法规对二氢查尔酮类甜味剂的最高限量要求（35mg/kg），同时抗干扰能力强，完全能够满足饲料中二氢查耳酮类甜味剂的日常监测和监管需要。

5.本发明所使用的分析仪器为高效液相色谱仪配备光电二极管阵列检测器，相对于液质联用仪等造价高昂的仪器，更加易于方法普及和推广应用。同时又能克服毛细管电泳法、电化学传感器稳定性、重现性较差等缺点。

附图说明

图1为本发明的饲料中新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮含量的同时分离检测方法的混合标准溶液高效液相色谱分离图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细实施方式和具体的操作过程，来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

实施例1

1 试剂和材料

除特别说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。

1.1 甲醇：色谱纯。

1.2 HLB固相萃取柱：60 mg/ 3mL。

1.3 标准品：新橙皮苷二氢查耳酮（NHDC，纯度≥98.0%, 中国上海麦克林公司）；柚皮苷二氢查耳酮（Naringin DC，纯度≥98.0%, 美国阿拉丁公司）。。

1.4 标准储备液的配制：准确称取新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮标准品各0.1000g，用甲醇溶液溶解并定容至100 mL，配制得浓度均为980 mg/L的标准储备液。0℃ ~ 4 ℃保存，可使用3个月。

1.5 标准工作溶液的配制：将新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮的标准储备液采用逐级稀释法用50%甲醇溶液配制浓度为0.196 mg/L、0.490 mg/L、0.980 mg/L、4.90 mg/L、9.80 mg/L、49.0 mg/L的系列标准工作溶液。所有标准工作溶液置于冰箱中于0℃ ~ 4 ℃温度下保存，可使用1个月。

2 仪器和设备

2.1高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器。

2.2分析天平：感量0.0001 g和感量0.01 g。

2.4超声波发生器：功率大于180 W。

2.5离心机：转速不低于10000 r/min；。

2.6 尼龙66有机滤膜：0.45 μm。

3 方法

3.1 高效液相色谱条件

a) 色谱柱：XB-C18柱，5 μm，150 mm×4.6 mm；

b）流动相：流动相A为甲醇，流动相B为纯水；洗脱梯度程序:0.0～ 15.0 min，43% A；15.0 ～ 15.5 min，43% ～ 90% A；15.5 ～ 20.0 min，90% A；20.0 ～ 20.5 min，90% ～43% A；20.5 ～ 25.0 min，43% A。流速1.0 mL / min；

c）流速：1.0 mL/min；

d）柱温：35 ℃；

e) 进样量：25 μL；

f）光电二极管阵列检测器的检测条件：检测波长282nm

3.2 标准曲线绘制

分别取混合标准工作溶液（1.5），按照3.1的色谱条件进行色谱测定。以各分析物的峰面积（Y）对相应的质量浓度（X，mg /L） 进行线性回归绘制标准曲线，得到线性回归方程。

4 样品测试步骤

4.1样品前处理

称取饲料样品10 g（精确至0.01 g）于100 mL具塞锥形瓶中，加入70 mL甲醇溶液，置于超声波振荡器中超声萃取30 min，转移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度线并混匀。提取液于10000 r/min下离心3 min，取上清液10 mL于50 mL鸡心瓶中，旋转蒸发仪上于40 ℃下旋至近干，用2 mL 50%甲醇溶液分两次涡旋溶解后转移至50 mL离心管中，加入8 mL纯水，于10000 r/min下离心3 min，待净化。先后用3 mL甲醇和3 mL纯水淋洗HLB小柱，将上述溶液转移至HLB小柱，保持流出液流速1~2 d/min，待上柱液全部流出后，5 mL 10%甲醇溶液淋洗，5 mL 60%甲醇溶液洗脱，洗脱氮吹至0.5 mL，加入50%甲醇溶液定容至1.0 mL，混匀，以尼龙66有机滤膜过滤，滤液供分析用。

4.2 试液测定

在相同色谱条件下，将制备的试样溶液进行色谱测定，以保留时间定性，以外标法定量。

5 分析结果的表述

试样中新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮的含量按下式（1）计算：

X>＝（1）

式中：

X——试样中新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

C_i——试液的进样浓度，单位为毫克每升（mg/L）；

V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；

m——试样质量，单位为克（g）。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

6方法学考察，其中包括线性、检测限、定量限、回收率、精密度。

6.1线性、检测限、定量限：配制两种二氢查耳酮浓度为0.196 mg/L到49.0 mg/L之间的系列混合标准工作溶液，以峰面积对浓度进行线性回归，线性方程、相关系数、检出限及定量限见表1。结果表明，新橙皮苷二氢查耳酮和柚皮苷二氢查耳酮在0.2 mg/L ~ 49.0mg/L内具有很好的线性关系，相关系数r均大于0.999，定量限分别为0.011>

y: 峰面积; x:质量浓度, mg/L.

6.2回收率和精密度：在优化后的检测条件下，取饲料样品进行加标回收率测试，加标水平分别为0.98 mg/kg，4.7 mg/kg，9.80 mg/kg，每个水平重复分析3次，结果见表2。从表2中可知，该方法的加标回收率范围为86.2 ~ 105.0%，相对标准偏差RSD范围为1.0 ~ 6.3%，结果表明，该方法适用于饲料中两种二氢查耳酮的日常分析检测。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

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