基于太赫兹衰减全反射技术的transwell检测装置及方法

摘要

本发明涉及一种基于太赫兹衰减全反射技术的transwell检测装置及方法，可用于对transwell实验小室下层的细胞进行快速、无标记定量检测。该检测装置包括：太赫兹信号发生单元，包括飞秒激光光源、激光分束器、超半球硅透镜Ⅰ和光电导天线Ⅰ；全反射棱镜检测单元，由上而下包括transwell小室和全反射棱镜，transwell小室的底部设有通透性多孔薄膜，多孔薄膜的下方附着单细胞层，单细胞层与全反射棱镜紧密接触；太赫兹信号接收单元，包括光电导天线Ⅱ；时间延迟控制系统，包括时间延迟器；信号处理单元。

说明书

技术领域

本发明属于太赫兹检测技术领域，涉及基于太赫兹衰减全反射技术的transwell检测装置及方法。

背景技术

细胞和组织培养技术是基础生命科学领域的重要部分。以滤膜作为细胞培养支撑介质最早来源于Grobstein(Natrue,172:860-872；1953)关于后肾滤膜诱导的相关研究。显然，相较坚固的细胞培养皿和培养瓶，通透性支撑界面有利于细胞从其基底面和顶面分泌和吸收分子，可以更自然、更接近在体条件下进行新陈代谢。因而，具有通透性薄膜底层的杯状装置，即transwell小室(transwell chamber)，在研究细胞的相互作用、迁移及侵袭性能力方面具有不可替代的重要作用。

Transwell实验结果判读，特别是在评估细胞迁移、侵袭能力时，主要依赖于对transwell小室下层细胞的计数，从而获得细胞迁移率等数据。目前下室细胞计数方法主要分为直接计数法和间接计数法。直接计数法通过去除基质胶和上室细胞层，使用诸如结晶紫、台盼蓝、苏木精等对下室附着细胞进行染色，然后使用显微镜随机选取若干视野进行计数；根据单位视野细胞分布情况及总体接种细胞数量，计算出细胞的迁移率。该方法较多依赖于研究者主观选择确定、计数分析，有较大偏倚，难以整体评估细胞分布密度。间接计数法则通过将下室细胞染色，读取细胞裂解液的对应吸光度值，评估细胞的迁移情况。该方法为有标记检测，较为繁琐，难以有效满足无标记、原位检测的需求。

太赫兹(Terahertz，THz)波是频率在0.1～10THz(对应波长范围为30μm-3mm)的电磁波，介于微波和红外波段之间，处于宏观电子学向微观光子学过渡的波段，具备无标记检测的物理特征和独特指纹图谱优势。同时，其具有较高的时间和空间分辨率，光子能量较小(1THz处光子能量约为4meV),不会对被测物质产生破坏作用。然而，活细胞的太赫兹波谱检测往往受到液相环境强吸收干扰和太赫兹检测波长与单细胞层厚度失匹配的制约，无法准确进行定量和定性的评估。具体表现为：基于透射模式的太赫兹时域光谱系统受限于培养基溶液的强烈吸收，无法准确获取液相溶液中Transwell小室中单细胞层信号，更无法实现对细胞密度分布的评估。基于谐振环的超材料增强技术，需要使细胞生长粘附于谐振环表面，并拭去细胞胞外水进行检测，无法满足活细胞的高通量检测需求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于太赫兹衰减全反射技术的transwell检测装置及方法，可用于对transwell实验小室下层的细胞进行快速、无标记定量检测。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

基于太赫兹衰减全反射技术的transwell细胞实验检测装置，包括：

太赫兹信号发生单元，包括飞秒激光光源、激光分束器、超半球硅透镜Ⅰ和光电导天线Ⅰ，飞秒激光光源发射激光在激光分束器作用下分为泵浦光束和探测光束，泵浦光束经过超半球硅透镜Ⅰ聚焦、准直可激发光电导天线Ⅰ向全反射棱镜检测单元发射太赫兹波；

全反射棱镜检测单元，由上而下包括transwell小室和全反射棱镜，transwell小室的底部设有通透性多孔薄膜，多孔薄膜的下方附着单细胞层，单细胞层与全反射棱镜紧密接触，用于同全反射棱镜表面发生全反射产生的垂直方向分布的倏逝波充分相互作用，调制反射太赫兹波；

太赫兹信号接收单元，包括光电导天线Ⅱ，用于接收全反射棱镜检测单元反射的携带贴壁单细胞层信息的太赫兹波；

时间延迟控制系统，包括时间延迟器，其设置于激光分束器与光电导天线Ⅰ之间，用于控制太赫兹信号发生单元产生和发射太赫兹波；

信号处理单元，包括计算机，用于采集和分析太赫兹信号接收单元获得的太赫兹波，完成transwell细胞实验检测。

上述检测装置的检测频率范围在0.1～4THz，光路环境湿度在3％以下。

作为优选的技术方案之一，所述飞秒激光光源为掺钛蓝宝石飞秒激光器。

作为优选的技术方案之一，所述太赫兹信号接收单元还包括超半球硅透镜Ⅱ，用于准直和聚焦探测光束，激发光电导天线Ⅱ接收的携带单细胞层信息的太赫兹波。

作为优选的技术方案之一，transwell小室选用太赫兹吸收较低的8μm微孔聚碳酸酯膜、聚四氟乙烯膜或聚酯膜，进一步优选为聚碳酸酯膜。

作为优选的技术方案之一，太赫兹信号发生单元向全反射棱镜的表面发射太赫兹波。

作为优选的技术方案之一，在transwell小室的上方设有可控压力夹具。

作为进一步优选的技术方案之一，所述可控压力夹具为弹簧式可控压力夹具。

作为进一步优选的技术方案之一，所述可控压力夹具由夹具支架固定，全反射棱镜由棱镜固定架固定，夹具支架和棱镜固定架的材质要求：硬度高，耐腐蚀，形变小，优选为不锈钢材质。

作为更进一步优选的技术方案之一，棱镜固定架的两侧设有圆孔，以供太赫兹波正常入射和出射。

作为进一步优选的技术方案之一，所述可控压力夹具的底部设有可拆卸式圆形压板，其与transwell小室的顶部接触。

作为优选的技术方案之一，所述太赫兹信号发生单元为太赫兹发生器，太赫兹信号接收单元为太赫兹接收器。

作为优选的技术方案之一，所述全反射棱镜的材质应选取在太赫兹波段内高透过、高折射，进一步优选为硅或锗，更进一步优选为硅。

作为优选的技术方案之一，所述信号处理单元采用Picometrix时域太赫兹系统T-ray 5000自带的信号处理单元。

利用上述装置实现的基于太赫兹衰减全反射技术的transwell细胞实验检测方法，具体步骤如下：

1)将底部附着单细胞层的transwell小室置于全反射棱镜上，使得单细胞层与全反射棱镜的表面紧密接触；

2)太赫兹信号发生单元向全反射棱镜检测单元发射太赫兹波；

3)太赫兹波在全反射棱镜表面发生全反射并形成沿全反射棱镜表面垂直向上分布的倏逝波，与紧密贴合的单细胞层相互作用，调制反射太赫兹波；

4)太赫兹信号接收单元接收反射太赫兹波，时间延迟控制系统调节太赫兹波发生和探测光路，信号处理单元采集与分析单细胞层的太赫兹信号，完成transwell细胞实验检测。

作为优选的技术方案之一，步骤1)中，底部附着单细胞层的transwell小室是通过以下方法得到的：transwell小室的底部设有通透性多孔薄膜，以多孔薄膜为界，transwell小室分为上层和下层，上层加入基质胶和细胞悬液，下层充入细胞培养基，多孔薄膜完全浸入细胞培养基内，完成细胞培养后，取出transwell小室，擦去上层的基质胶和细胞并清洗，吸取下层的水分即可。

作为更进一步优选的技术方案之一，具体方法如下：向上层滴加基质胶，无菌条件下过夜，确保基质胶完全聚合，加入细胞悬液，向下层充入细胞培养基，经细胞培养后取出transwell小室，用棉签头擦去基质胶以及上层的细胞后，PBS缓冲液清洗3次，用无菌滤纸轻轻吸取下层的水分即可。

作为优选的技术方案之一，步骤1)中，利用可控压力夹具施加压力使得单细胞层与全反射棱镜的表面紧密接触。

作为优选的技术方案之一，步骤4)中，由公式(1)可得在棱镜表面处由入射太赫兹波在发生全反射时产生倏逝波的趋肤深度与细胞层厚度相匹配，故出射太赫兹波可完整携带棱镜表面贴壁介电物质的响应信号；

其中，d_p为倏逝波的趋肤深度，λ为入射太赫兹波的波长，n_Si为全反射棱镜的折射率，θ为太赫兹波在棱镜表面的入射角，n_em为棱镜表面待检样本(即贴壁单细胞层)的折射率；

根据等效介质理论的二元简化介电模型，如公式(2)，由出射太赫兹信号所获取的棱镜界面处物质等效复介电常数ε_eff与培养基和细胞的空间体积分数有关，即在确定ε_medium和ε_cell情况下，可以通过测量ε_eff的信号，获取transwell小室下层的细胞密度分布情况，进而实现对细胞数量的无标记检测；

其中，ε_eff为出射太赫兹信号所获取的棱镜界面处物质等效复介电常数，ε_cell为细胞的复介电常数，V_cell为检测区域的细胞层体积，ε_medium为培养基复介电常数，V_medium为检测区域培养基的体积。

本发明的有益效果在于：

太赫兹波衰减全反射技术为活细胞无标记检测提供可靠支撑，其利用太赫兹波在棱镜内部发生全反射时产生的倏逝波，获取棱镜表面数十微米范围内物质的太赫兹波谱信息；倏逝波穿透深度与细胞层厚度相匹配，有效排除液相环境的信号干扰，获取单细胞层的太赫兹波谱特征，以应用于研究细胞特有的亚皮秒尺度水化动力学参数、胞膜渗透性改变响应及氧化应激诱导凋亡过程。相关结果显示，太赫兹衰减全反射平台可有效区分培养基和单细胞层的复介电常数特征，特别是复介电常数的虚部；可对单细胞层含水量及生存状态产生敏感响应。因而，transwell小室薄膜下部细胞分布密度可简化为具有不同复介电常数特征的细胞和培养基二元混合物，进而可通过太赫兹衰减全反射平台实现准确评估分析。

本发明建立集成弹簧式可控压力夹具的太赫兹衰减全反射平台，首次应用于transwell实验薄膜下层细胞分布密度的定量检测分析，创新性将细胞层生长于太赫兹吸收率较低的通透性薄膜上，以解决现有太赫兹细胞检测需要在传感界面(超材料表面或衰减全反射棱镜表面)生长单细胞层所面临培养耗时过长、检测样本单一的难题，可满足高通量太赫兹细胞分析的需求。该装置结构简单，易于整合，操作便捷，检测快速。

Transwell细胞侵袭性或迁移能力评估即为观察细胞通过模拟的基底膜(通透性支撑薄膜)的运动分布情况，区别于常规细胞悬液生长和贴壁细胞生长，且相较现有计数分析方法具备以下优势：

1、无需任何染料标记，衰减全反射平台倏逝波趋肤深度与细胞层厚度相匹配，且细胞层和培养基具有明显的太赫兹吸收波谱差异；

2、快速检测，单个样本获得稳定太赫兹光谱耗时在1分钟以内，远小于直接或间接定量法所需染色时间；

3、活细胞原位探测，细胞不需要经过脱水固定，在存活状态下进行检测，可方便后续收集开展其他实验。

4、透射模式下的太赫兹时域光谱系统，难以在培养基溶液存在情况下实现对单细胞层的信号。太赫兹衰减全反射技术是当前细胞层检测的可靠方法，其利用太赫兹波在棱镜界面发生全反射时产生趋肤深度在数十微米范围内并垂直向上呈指数衰减的倏逝波进行贴壁细胞层的探测，可以排除细胞层上部培养基吸收的干扰，获取单细胞层复介电常数信息。

5、本发明针对现有太赫兹细胞检测需将单细胞层生长于传感界面(超材料表面或衰减全反射棱镜表面)时所面临培养耗时过长、检测样本单一的难题，创新性将细胞层生长于太赫兹吸收率较低的通透性薄膜上，通过大批量细胞培养，可满足高通量太赫兹细胞分析的需求。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为集成弹簧式可控压力夹具的太赫兹衰减全反射平台示意图；

图2为基于太赫兹衰减全反射技术进行transwell细胞计数的检测原理图；

图3为不同药物浓度处理后transwell小室下层细胞的太赫兹信号值；

图4为在1.0THz处不同药物浓度处理后小室下层细胞的归一化太赫兹信号值；

图5为太赫兹衰减全反射信号强度值与MTT实验吸光度值变化趋势拟合图；

其中，1为可控压力夹具，2为夹具支架，3为可拆卸式圆形压板，4为全反射棱镜，5为棱镜固定架，6为transwell小室，7为单细胞层，8为多孔薄膜。

图2左侧的虚线框表示细胞培养基，实线箭头表示入射太赫兹波，虚线箭头表示出射太赫兹波，右侧波形表示倏逝波。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例：

如图1和图2所示，基于太赫兹衰减全反射技术的transwell细胞实验检测装置，包括：

太赫兹信号发生单元，包括飞秒激光光源、激光分束器、超半球硅透镜Ⅰ和光电导天线Ⅰ，飞秒激光光源发射激光在激光分束器作用下分为泵浦光束和探测光束，泵浦光束经过超半球硅透镜Ⅰ聚焦、准直可激发光电导天线Ⅰ向全反射棱镜检测单元发射太赫兹波；

全反射棱镜检测单元，由上而下包括transwell小室6和全反射棱镜4，transwell小室6的底部设有通透性多孔薄膜8，多孔薄膜8的下方附着单细胞层7，单细胞层7与全反射棱镜4紧密接触，用于同全反射棱镜4表面发生全反射产生的垂直方向分布的倏逝波充分相互作用，调制反射太赫兹波；

太赫兹信号接收单元，包括光电导天线Ⅱ，用于接收全反射棱镜检测单元反射的携带贴壁单细胞层信息的太赫兹波；

时间延迟控制系统，包括时间延迟器，其设置于激光分束器与光电导天线Ⅰ之间，用于控制太赫兹信号发生单元产生和发射太赫兹波；

信号处理单元，包括计算机，用于采集和分析太赫兹信号接收单元获得的太赫兹波，完成transwell细胞实验检测。

上述检测装置的检测频率范围在0.1～4THz，光路环境湿度在3％以下。

太赫兹信号发生单元中的飞秒激光光源为掺钛蓝宝石飞秒激光器。

太赫兹信号接收单元还包括超半球硅透镜Ⅱ，用于准直和聚焦探测光束，激发光电导天线Ⅱ接收的携带单细胞层信息的太赫兹波。

transwell小室6选用太赫兹吸收较低的8μm微孔聚碳酸酯膜。

太赫兹信号发生单元向全反射棱镜4的表面发射太赫兹波。

在transwell小室6的上方设有可控压力夹具。

可控压力夹具1为弹簧式可控压力夹具。

可控压力夹具1由夹具支架2固定，全反射棱镜4由棱镜固定架5固定，夹具支架2和棱镜固定架5为不锈钢材质。

棱镜固定架5的两侧设有圆孔，以供太赫兹波正常入射和出射。

可控压力夹具1的底部设有可拆卸式圆形压板3，其与transwell小室6的顶部接触。

太赫兹信号发生单元为太赫兹发生器，太赫兹信号接收单元为太赫兹接收器。

全反射棱镜4的材质为硅。

利用上述装置实现的基于太赫兹衰减全反射技术的transwell细胞实验检测方法，具体步骤如下：

1)将底部附着单细胞层7的transwell小室6置于全反射棱镜4上，使得单细胞层7与全反射棱镜4的表面紧密接触；

2)太赫兹信号发生单元向全反射棱镜检测单元发射太赫兹波；

3)太赫兹波在全反射棱镜4表面发生全反射并形成沿全反射棱镜4表面垂直向上分布的倏逝波，与紧密贴合的单细胞层7相互作用，调制反射太赫兹波；

4)太赫兹信号接收单元接收反射太赫兹波，时间延迟控制系统调节太赫兹波发生和探测光路，信号处理单元采集与分析单细胞层7的太赫兹信号，完成transwell细胞实验检测。

步骤1)中，底部附着单细胞层7的transwell小室6是通过以下方法得到的：transwell小室6的底部设有通透性多孔薄膜8，以多孔薄膜8为界，transwell小室6分为上层和下层，上层加入基质胶和细胞悬液，下层充入细胞培养基，多孔薄膜8完全浸入细胞培养基内，完成细胞培养后，取出transwell小室6，擦去上层的基质胶和细胞并清洗，吸取下层的水分即可。

具体方法如下：向上层滴加基质胶，无菌条件下过夜，确保基质胶完全聚合，加入细胞悬液，向下层充入细胞培养基，经细胞培养后取出transwell小室，用棉签头擦去基质胶以及上层的细胞后，PBS缓冲液清洗3次，用无菌滤纸轻轻吸取下层的水分即可。

步骤1)中，利用可控压力夹具1施加压力使得单细胞层7与全反射棱镜4的表面紧密接触。

步骤4)中，由公式(1)可得在棱镜表面处由入射太赫兹波在发生全反射时产生倏逝波的趋肤深度与细胞层厚度相匹配，故出射太赫兹波可完整携带棱镜表面贴壁介电物质的响应信号；

其中，d_p为倏逝波的趋肤深度，λ为入射太赫兹波的波长，n_Si为全反射棱镜的折射率，θ为太赫兹波在棱镜表面的入射角，n_em为棱镜表面待检样本(即贴壁单细胞层)的折射率；

根据等效介质理论的二元简化介电模型，如公式(2)，由出射太赫兹信号所获取的棱镜界面处物质等效复介电常数ε_eff与培养基和细胞的空间体积分数有关，即在确定ε_medium和ε_cell情况下，可以通过测量ε_eff的信号，获取transwell小室下层的细胞密度分布情况，进而实现对细胞数量的无标记检测；

其中，ε_eff为出射太赫兹信号所获取的棱镜界面处物质等效复介电常数，ε_cell为细胞的复介电常数，V_cell为检测区域的细胞层体积，ε_medium为培养基复介电常数，V_medium为检测区域培养基的体积。

试验例

以环氧合酶-2抑制剂塞来昔布对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞(HTB-26^TM)侵袭能力影响评估为例，使用太赫兹衰减全反射平台检测transwell小室下层细胞密度分布，其应用还可扩展至细胞迁移实验或其他结果统计依赖于检测transwell小室下层细胞数量的实验，检测具体步骤如下：

1、细胞培养：使用含体积占比百分数10％胎牛血清、链霉素(100μg/mL)及青霉素(100U/mL)的高糖DMEM完全培养基，将MDA-MB-231细胞放置于37℃、二氧化碳体积分数为5％的细胞培养箱中，待25cm²培养瓶中细胞融合度达到85％左右时，以1mL0.25％胰蛋白酶-EDTA消化传代，次日换液，每隔3-4天传代一次。

2、接种细胞：使用DMSO稀释塞来昔布，用DMEM完全培养基稀释为0、50、100μmol/L，确保DMSO终浓度低于0.1％。将不含胎牛血清的DMEM培养基与Matrigel(50mg/L)胶按3:1比例进行稀释；在Transwell小室上层滴加300μL稀释好的Matrigel胶，无菌条件下过夜，确保胶完全聚合。离心收集经过0、50、100、150μmol/L塞来昔布分别处理24小时后的MDA-MB-231细胞，用不含胎牛血清的DMEM培养基调整细胞悬液浓度为2×10⁵个细胞/mL，每孔加入400μL细胞悬液于小室上层，并使用不含胎牛血清的DMEM培养基补充至1mL；下室充入DMEM完全培养基。在细胞培养箱中培养约24小时后，用于太赫兹衰减全反射平台的检测。

3、太赫兹检测：用丙酮、无水乙醇及超纯水依次清洗全反射棱镜表面，氮气吹干后；太赫兹检测系统提前1小时开机，并充入干燥空气，保持湿度在3％以下，平均2048次采集并保存背景信号的光谱。从培养板中小心取出transwell小室，用棉签头擦去Matrigel胶以及上层的细胞后，PBS缓冲液清洗3次。用无菌滤纸轻轻吸取小室下层的水分。将小室放置于全反射棱镜表面中间区域，使其完全覆盖太赫兹波入射聚焦区域；调整检测模块的弹簧式压力可控夹具至合适位置，使小室下层紧贴棱镜表面并且小室的塑料框架不发生形变。此时向小室上层加入500μL DMEM完全培养基，而后采集并保存该样本的太赫兹光谱(平均2048次)；放置样本及采集光谱耗时小于1分钟。重复上述方法获得以上每个样本及DMEM完全培养基的太赫兹衰减全反射信号值。

4、MTT法检测：此处为验证结果的可靠性，同时使用传统间接计数法检测太赫兹测量过后的样本。12孔板中每孔加入1mL含5g/L MTT完全培养基，将小室放置于其中，使下层膜完全浸入其中，在细胞培养箱中放置4h后取出。每孔加入1mL DMSO，将小室浸泡其中，震荡10min使MTT充分溶解。取出小室，以DMEM完全培养基作为空白对照，在酶标仪上检测洗脱液的OD值。

5、结果分析：提取不同浓度药物作用组的太赫兹衰减全反射信号(ATR log[dB])，如图3所示，由于培养基的复介电常数虚部高于细胞层，即培养基吸收大于细胞层吸收，故其衰减全反射信号强度值最低。塞来昔布会对MDA-MB-231体外侵袭能力产生较强抑制作用，并呈现剂量依赖性。故随着药物浓度增加，细胞侵袭能力下降，在小室下层的细胞密度会明显减少、培养基体积分数上升。衰减全反射信号强度值随着药物浓度上升，小室下层细胞密度降低呈现逐渐下降趋势。将各组样本衰减全反射信号值(ATR log[dB])同DMEM完全培养基信号值相减，可获得该组样本经过对应浓度药物组处理后信号变化情况，如图4所示，信号强度值改变趋势即可用于该浓度药物对细胞侵袭能力影响的评估。同样方式处理MTT实验所获得吸光度值信号，将两种检测方法的信号值变化趋势进行拟合，如图5所示，基于太赫兹衰减全反射平台的transwell细胞定量检测方法与传统MTT法的线性相关系数为0.996，相关性较好，且本平台具备快速、无标记、活细胞原位检测的优势。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。