基于不育表型对大豆雄性不育基因进行的快速鉴定和遗传定位的体系化方法

摘要

本发明公开了一种基于不育表型对大豆雄性不育基因进行的快速鉴定和遗传定位的体系化方法，包含如下步骤：A、表型观察：对田间观察发现豆荚不育或豆荚败育的大豆植株；B、花粉观察：对重点植株进行花粉形态显微观察；C、遗传分析：分析不育突变体的不育类型；D、初定位分析；F、遗传定位及等位性分析。利用本发明的方法能够基于田间大豆的不育表型，对大豆雄性不育基因进行快速鉴定和遗传定位，同时，本发明研究开发了一套适用于花粉败育型大豆雄性不育基因的dCAPS标记开发方法；本发明具有重要的技术创新性和良好的实用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种快速的、体系化的基因鉴定遗传定位方法。

背景技术

大豆育性主要分为三种类型，雌雄均不育、雄性不育雌性可育、质核互作不育。雌雄均不育因不能获得后代在大豆育种中应用意义不大，质核互作不育在大豆杂种优势利用中得到了广泛的应用，雄性不育雌性可育在大豆轮回选择中发挥了重要的作用。到目前为止，以发现12个雄性不育雌性可育基因，Gm02中含有四个，分别为ms3、ms4、msMOS、msp；Gm03中ms9基因；Gm07中含有ms8基因；Gm09中含有ms7基因；Gm10中含有ms2基因；Gm11中含有ms5基因；Gm13中含有三个不育基因，分别为ms1、ms6、st5。

大豆杂交种可以提高大豆产量，研究表明，大豆产量优势可超双亲平均的42%。大豆是一种自花授粉作物，如果想获得杂交种子，需要进行人工杂交，此方法不仅费时费力，而且不可能获得大量的杂交种子，如果大豆是雄性不育、雌性可育则省去了人工去雄步骤，使获得大量杂交种子成为可能。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于不育表型对大豆雄性不育基因进行的快速鉴定和遗传定位的体系化方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

基于不育表型对大豆雄性不育基因进行的快速鉴定和遗传定位的体系化方法，该方法包含如下步骤：

A、表型观察：对田间观察发现豆荚不育或豆荚败育的大豆植株，观察分析株荚发育停滞的时期，记录重点植株；

B、花粉观察：对于在步骤A中发现的重点植株进行花粉形态显微观察；

B-1、首先，利用染色方法对花苞状态的花粉进行观察，记录与正常植株相比，待测植株的的花粉粒是否能够被正常着色，如果不能正常着色，记录为异常花粉；

B-2、进一步，利用扫描电镜细致观察异常花粉的外形态，记录花粉形态是否饱满圆润或皱缩干瘪，如果为皱缩干瘪，记录为异常花粉；

B-3、进一步，对花粉粒数和直径进行统计，待测植株的花粉粒数高于或低于正常植株的花粉粒数时，或者待测植株的花粉平均直径高于或低于正常植株的花粉平均直径时，均记录为异常花粉；

C、遗传分析：对于在步骤B中有任一项记录为异常花粉的植株，进一步分析不育突变体的不育类型；

C-1、利用正反交和回交的方法分析雌蕊、花粉、细胞质对育性的影响；

C-2、对待测植株与正常植株的衍生后代进行遗传分析，经卡方检验记录育性分离比例；

D、初定位分析：对于步骤C中经遗传分析认定为“雌蕊正常、花粉败育”的植株，进行高世代近等基因系初定位分析：为初步明确待测不育基因在染色体上的位置，根据后代家系育性表现，连续筛选出现育性分离的家系至F_5:6代；根据F_6:7代表型，将所有不育单株DNA和完全可育植株的DNA分别形成两个混池，利用重测序的方法对两个混池间SNP和Indel变异进行分析，初步确定待测不育基因在染色体的上的物理区间；

F、遗传定位及等位性分析：在步骤E的基础上，为进一步明确和验证不育基因的位置，利用F₂单株、SSR标记、dCAPs标记对不育基因进行遗传定位分析，并根据已知基因的位置分布数据在染色体上进行基因的整合及等位性分析，完成对大豆雄性不育基因的快速鉴定和遗传定位。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤A中，所述重点植株是指能够在R3时期可以形成株荚的不育植株。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B-1中，所述染色方法是指碘化钾染色。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B-3中，待测植株的花粉粒数高于或低于正常植株花粉粒数的20％时，或者待测植株的花粉平均直径高于或低于正常植株花粉平均直径的20％时，均记录为异常花粉。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤F中，所述dCAPS标记的开发方法为：在对可育和不育材料样本进行全基因组重测序的基础上，以公共大豆基因组Wm82.a2.v1为参考基因组，在SNP富集区进行SNP位点的预测，选取测序深度＞10且测序质量高的位点，将该位点上下游各30或29bp的序列以wild type WT和Mutant type MT的形式列出，首先预测该位点是否能够引起酶切位点的出现或缺失，如何能够引起变异，即在该位点上下游各150bp左右设计上下游引物形成CAPs标记引物进行利用；如果SNP位点不直接引起酶切位点的变异，在设计引物时，对SNP位点相邻的1-2个碱基引入突变，引入突变后仅使WT或MT其中之一产生一种类型的酶切位点，而保证另外一种没有，且引起变异引物的长度控制在25-40bp之间，PCR产物长度在150bp-250bp之间。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤F中，所述SSR引物的筛选方法为：在不育材料测序基因的SNP富集区进行进行SSR引物筛选，并从中找出扩增产物单一的差异引物。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤C-2之后，采用正常植株为母本与获得的F1进行回交试验，对获得的果荚，每个果荚取一粒种子进行后续遗传分析试验，以进一步判断待测不育基因的遗传方式是否受细胞质遗传影响；如果不受细胞质遗传影响，则进入步骤D的分析。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：

①参见下文的实施例，利用本发明的方法能够基于田间大豆的不育表型，对大豆雄性不育基因进行快速鉴定和遗传定位。

②本发明另一个突出的创新之处在于，研究并开发了一套适用于花粉败育型大豆雄性不育基因的dCAPS标记开发方法，并给出了各项具体参数，具有重要的技术创新性和良好的实用价值。

附图说明

图1：不育突变体植株和花粉表型。a, b图分别是可育和不育单株在R7时期表型；c,d图分别是可育和不育植株花粉经由碘化钾染色后在100倍显微镜下的表型；e, f图分别是可育和不育植株花粉在扫描电镜下表型。

图2：不育和可育单株花粉个数与直径。a 图是可育和不育植株的单个花中含有花粉粒的个数；b图表示可育和不育植株花粉的直径。

图3：近等基因系间变异分析.将染色体上SNP和Indel变异数目利用颜色进行表示，颜色越深表示单位长度内变异越多。

图4：不育基因遗传定位和图谱整合.1,2分别是ms1和ms6的遗传图谱(Yang etal. 2014)；3是st5的遗传图谱(Speth et al. 2015)；4是本研究中mst-M的遗传图谱;Integrated-map-F是将已有研究结果根据标记进行整合后的遗传图谱。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。本发明涉及的实验方法均为常规试验方法，包括：碘化钾染色方法； 扫描电镜方法，花粉数目统计方法，花粉直径统计方法；遗传分析计算方法；重测序方法描述；Joinmap构建遗传图谱方法；dCAPs标记开发方法，SSR标记方法，dCAPs方法。

以下的实施例给出了利用本发明快速鉴定和定位一个大豆不育基因的流程方法。

实施例1、大豆不育植株表型鉴定。

对田间发现的不育材料，命名为St-M，进行观察发现，结果发现在苗期（V1）至初荚期（R3）不育材料与可育材料表型无显著差异；但在R4时期不育植株荚的发育出现停滞，并且整个植株生育阶段持续维持在R3-R4时期，直至植株死亡（图1，a-b）。

由于St-M在R3时期可以形成荚，表明St-M的雌蕊正常，因此推测不育可能是由于花粉败育引起。为进一步证明此推论，利用碘化钾染色和扫描电镜两种方法对St-M花苞状态的花粉进行观察，结果显示（图1，c-f）St-M的花粉粒不能被正常着色，而对照可育植株则可以被正常染色，结果表明St-M的花粉出现异常；为细致观察异常花粉外形态，利用扫描电镜进行观察，发现正常花粉在电镜下呈现饱满圆润的状态，而不育的花粉则出现皱缩、干瘪的形态，初步判断St-M的花粉形态异常。

此外，在对St-M的花粉进行观察的时候发现不育植株花粉粒数偏少，单个花粉直径偏大，为进一步量化二则差异，对花粉粒数和直径进行统计。结果显示(图2)，正常可育花的花粉粒数在580个左右，直径在24微米左右，而St-M的单个花苞的花粉粒数仅为150个左右，约为正常花的1/4，直径在40微米左右，为正常花粉粒的2倍左右，结果表明St-M在花粉粒数和直径上均出现了异常。

实施例2、大豆不育性状的遗传分析。

为进一步分析大豆不育突变体St-M的不育类型，利用正反交和回交的方法分析雌蕊，花粉及细胞质对育性的影响。JD12为正常可育品种，利用人工去雄授粉的方式将JD12与突变体St-M进行正反交实验。结果显示，以St-M为母本，JD12为父本，对共计252朵进行独立去雄和授粉试验，最终获得32个果荚，杂交成功率为12.7%；同时以JD12为母本进行杂交试验，共对339朵进行去雄和授粉试验，未获得果荚。结果表明（见下表），St-M雌蕊正常，花粉败育。与花粉观察结果一致。

S-M（♂）JD12（♂）F₁^#>(♂）St-M（♀）-32/252JD12（♀）0/339-22/243

注：♀表示母本，♂表示父本，F1为St-M♀×JD12♂衍生后代。

进一步，对St-M和JD12及其衍生后代进行遗传分析，结果如下表所示：

FertilitySegSterilityTotalExpected Ratioχ2PSt-M（♀）1212F₁1212F₂3161024183:10.050.82F_2:311220403161:2:00.630.73JD12（♂）2222BCF₁(JD12♀×F1♂)2222BCF_1:2139221:10.410.52BCF₂-Seg*3781094873:011.640.20

注：BCF₁为JD12为母本衍生；BCF₂-Seg为9个育性发生分离的BCF_1:2组成的F2群体。

结果显示，12个F₁全表现为可育，F₂群体可育与不育单株数分别为316和102，经卡方检验符合3（可育）:1（不育）的分离比例，对316个F_2:3家系进行观察发现，其中112个家系表现为全可育，204个家系出现育性分离，经卡方检测符合1（全可育）：2（分离）：0（全不育）的分离比例，结果表明St-M突变体的不育性状有单隐性基因控制，在此将其命名male-sterile>

为进一步判断mst-M 基因的遗传方式是否受细胞质遗传影响，以JD12为母本与获得的F₁进行回交试验，共获得了22个果荚，每个果荚取一粒种子进行后续遗传分析试验。结果显示，22个BCF₁均表现可育，13个BCF_1:2表现为全可育，9个表现为育性分离，经卡方检测符合1（全可育）：1（分离）的分离比例，进一步对由9个发生分离的BCF_1:2构成的BCF₂-Seg群体进行分析，结果显示378棵单株表现为可育，109棵单株表现为不育，经卡方检测符合3（可育）:1（不育）的分离比例，结果表明mst-M基因符合单隐性基因遗传规律，说明细胞质对育性的遗传方式无显著影响。

实施例3、利用高世代近等基因系对mst-M进行初定位分析。

为初步明确mst-M基因在染色体上的位置，根据后代家系育性表现，连续筛选出现育性分离的家系至F_5:6代。根据F_6:7代表型，将所有不育单株DNA和完全可育植株的DNA分别形成两个混池，利用重测序的方法对两个混池间SNP和Indel变异进行分析。结果显示（图3），90%以上纯合的SNP和Indel变异富集在13号染色体20-22M的位置，表明mst-M基因可能位于该物理区间内。

实施例4、遗传定位及等位性分析。

为明确和验证不育基因mst-M的位置，利用1138个F₂单株和3对SSR标记（见下表），3对dCAPs标记（见下表）和一个形态学花色标记W1对mst-M进行遗传定位分析。结果显示（图.4）将mst-M基因定位在形态学标记W1和dCAPs-1之间，遗传距离分别为0.6和1.8厘摩。已知在大豆13号染色体上存在3个不育基因，分别为ms1，ms6和st5，根据已发表结果对13号染色体上不育基因进行整合。从整合后的遗传图谱结果分析，本mst-M与以往结果均不在同一个位置，表明mst-M属于一个新的不育基因。

SSR标记和dCAPs标记（见下表）

综合以上4个实施例可见，利用本发明的方法不育材料中定位到新基因mst-M，该基因位于Gm13染色体上，此染色体上还有ms1、ms6、st5三个不育基因，该基因与花色基因遗传距离更近，仅为0.6cm。该基因与花色的紧密连锁更有利于轮回群体选择中可育株的早期去除。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

序列表

<110>河北省农林科学院粮油作物研究所

<120>基于不育表型对大豆雄性不育基因进行的快速鉴定和遗传定位的体系化方法

<160>12

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(artificial sequence)

<400>1

taaagcaata tcttccccaa aacaaaaccc 30

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(artificial sequence)

<400>2

gatgggaaac tgaatcatag20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(artificial sequence)

<400>3

atgcctttga tgcttttgtc20

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(artificial sequence)

<400>4

agaataattc caagaaaaca cgtgttat 28

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(artificial sequence)

<400>5

agctttgcct ttttcttcag20

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列(artificial sequence)

<400>6

gaatctgagg atgagtatcc cattccgat29

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(artificial sequence)

<400>7

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<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(artificial sequence)

<400>8

gcgccgttcc tctttacttt at 22

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(artificial sequence)

<400>9

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<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(artificial sequence)

<400>10

gtggtggtgg tgaaaactat tagaa25

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(artificial sequence)

<400>11

ttgcacattc tttttggtaa acagtcataa 30

<210>12

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(artificial sequence)

<400>12

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