一种基于胶乳免疫比浊法检测人体液样本中溶菌酶含量的试剂盒

摘要

本发明属于生物医药服务技术领域，具体涉及一种基于胶乳免疫比浊法检测人体液样本中溶菌酶(Lysozyme)含量的试剂盒，该试剂盒包含试剂1和试剂2,其中试剂1为反应缓冲液，具体为含有体积百分比为0.1％(V/V)的TWEEN‑20的100mM pH7.2‑7.4的PBS缓冲液,试剂2为连接了人溶菌酶抗体的固相载体，具体为聚苯乙烯微球。本发明是可以辅助临床诊断，显著提高溶菌酶(Lysozyme)含量的检测灵敏度，简化临床关于溶菌酶(Lysozyme)含量的检测方法。

说明书

发明领域

本发明属于生物医药检测技术领域，具体涉及一种基于胶乳免疫比浊法检测人体液样本中溶菌酶含量的试剂盒。

发明背景

肽聚糖是细菌细胞壁的主要组成，主要是由NAM、NAG通过β-1,4糖苷键相连，NAG的肽“尾”则是通过D-乳酰羧基连在NAM的第3位碳原子上，肽尾之间通过肽“桥”，即肽键或少数几个氨基酸连接，NAM、NAG、肽“尾”与肽“桥”共同组成了细菌细胞壁肽聚糖的多层网状结构，作为细胞壁的骨架，上述结构中的任何化学键断裂，皆能导致细菌细胞壁的损伤。

溶菌酶(lysozyme)是一种分子量约为15000，由大约129个氨基酸构成的能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。溶菌酶(lysozyme)最早在1922年由Fleming在鸡卵清中分离得到。其等电点pI约为11.0，广泛分布于人体各组织和体液中。其主要是能够水解细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解，故而又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，并且溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。人血清中的溶菌酶主要来源于嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、肾脏近曲小管细胞的溶酶体，但由于近曲小管细胞对溶菌酶有吸收作用，正常人尿液中溶菌酶含量极低。

当发生肾小管疾病、慢性肾炎、慢性肾衰竭，炎症、中毒、尿路感染和急性单核细胞白血病时，血清或尿液的溶菌酶含量均会有明显的变化，故而定量检测溶菌酶含量对临床诊断具有一定的辅助作用。

目前，检测溶菌酶含量主要有三种方法：溶菌环法，透射比浊法，和ELISA。溶菌环法是一种传统的检测溶菌酶含量的方法；当光线通过一个浑浊介质溶液时，由于溶液中存在混浊颗粒，光线被吸收一部分，吸收的多少与混浊颗粒的量成正比，这种测定光吸收量的方法称为透射比浊法；酶联免疫吸附测定enzyme linked immunosorbent assay(简写ELISA)指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法；其中溶菌环法和透射比浊法主要是利用溶菌酶水解细菌细胞壁特性，检测溶菌环直径大小和溶液中吸光度的浊度变化；而ELISA主要是利用免疫学双抗体夹心法检测抗原抗体复合物的含量，如中国专利201710253923.1公开了一种检测鸡蛋清中溶菌酶的方法，该方法包括如下步骤：用单克隆抗体包被ELISA板过夜，PBST洗涤并加入脱脂奶粉溶液封闭，再用PBST洗涤并加入系列稀释的溶菌酶标准品溶液等孵育，加入TMB底物溶液，加入3M硫酸终止反应并计算待检样品中鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量，此发明的溶菌酶的检测方法可用于制备快速、有效、低成本的抗原检测试剂盒；

但这三种方法操作均较为繁琐，耗费时间，不利于大规模高通量测定。此外，还有人采用脱氧核糖核酸循环放大荧光信号的方法用于检测溶菌酶，如中国专利201410750845.2公布了一种检测溶菌酶的试剂盒，本发明检测的要点为采用一锅煮的方式，以溶菌酶的适体识别印发，自发进行的脱氧核糖核酸杂交，脱氧核糖核酸靶替换聚合反应，通过脱氧核糖核酸循环技术对溶菌酶的检测提供显著的放大效应。但此方法同样需要耗费大量时间，在实际应用中，检测速度不够快的检测方法将很快被淘汰。

现代，越来越多的产品采用胶乳免疫比浊法用于临床检测，其基本的原理为：当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适时，通常的情况下为抗体过量，形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中在高分子促聚剂的作用下，聚合析出颗粒，使反应液出现浊度。当入射光照射不同浊度的反应液时可被不同程度的吸收、反射和折射，通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可得出待测样品中抗原的含量。

鉴于以上原因，研发一种基于胶乳免疫比浊法检测人体液样本中溶菌酶含量的试剂盒很有必要，以便于在全自动生化分析仪上使用，灵敏度高，重复性好，操作简便，可实现短时高通量测定。

发明内容

针对现有技术的不足，研发一种基于胶乳免疫比浊法检测人体液样本中溶菌酶含量的试剂盒非常有实际意义，以便于在全自动生化分析仪上使用，准确性和灵敏度高，重复性好，操作简便，可实现短时高通量测定。

为实现本发明的目的，本发明提供一种基于胶乳免疫比浊法检测人体液样本中溶菌酶含量的试剂盒，该试剂盒包含试剂1和试剂2；所述试剂1为反应缓冲液，所述的反应缓冲液为100mM pH7.2-7.4的PBS缓冲液，其中含有体积百分比为0.1％(V/V)的TWEEN-20。

所述试剂2为连接了人溶菌酶抗体的固相载体，所述的固相载体为聚苯乙烯微球，且聚苯乙烯微球的粒径为80-500nm，其中人溶菌酶抗体和聚苯乙烯微球的连接方式为物理吸附或化学交联中的一种或多种；

作为优选，所述的聚苯乙烯微球的粒径为200-350nm。

更优选的，所述的聚苯乙烯微球的粒径为250-300nm。

本发明的试剂盒还包括人溶菌酶标准品，所述的人溶菌酶标准品的制备方法为：

1)在PBS缓冲液中加入10％(W/V)BSA，0.1％(V/V)TWEEN-20，充分搅拌后再用0.22μm微孔滤膜过滤，制成校准品稀释液；

2)用校准品稀释液溶解人溶菌酶即可得到人溶菌酶校准品。

本发明的试剂盒中试剂1的制备方法为：在100mM pH7.2-7.4PBS缓冲液中加入0.1％(V/V)TWEEN-20，再0.22μm微孔滤膜过滤。

本发明的试剂盒中试剂2的制备方法为：(1)人溶菌酶抗体的制备；(2)将人溶菌酶抗体与固相载体连接。

所述的人溶菌酶抗体的制备具体包括以下步骤：

1)将人溶菌酶核酸序列制备成cDNA，并利用基因工程技术转入酵母等真核工程菌表达系统中；

2)将工程菌在适宜的条件下发酵，制得含人溶菌酶的发酵液粗品，并将人溶菌酶粗品与树脂混合，搅拌吸附并静置，倾去上清液，然后将树脂离心并再次倾去上清液,用去离子水反复清洗树脂，重复本步骤2-4次；

3)将树脂装柱，用缓冲液清洗树脂，再用硫酸铵溶液对树脂进行洗脱并收集洗脱液；

4)在搅拌条件下，向洗脱液中加入固体硫酸铵，使之浓度达到40％，并伴有白色固体生成，静置12小时后将固体抽滤，用缓冲液溶解沉淀；

5)将溶液装入透析袋中，在去离子水中透析24小时后用盐酸将透析液pH值调整至5.0，冷冻干燥即制得人溶菌酶；

6)将步骤5)中制得的人溶菌酶免疫动物，并制备得人溶菌酶单克隆抗体或多克隆抗体；

其中，所述的树脂为724树脂；

其中，所述的缓冲液为磷酸盐，碳酸盐或其他具备缓冲能力的溶液一种或多种，pH值为4.0-10.0；

其中，所述的硫酸铵溶液的重量百分比为10％。

所述的将人溶菌酶抗体与固相载体连接具体为物理吸附法或化学交联法中的一种或多种。

所述的物理吸附法具体包括以下步骤：

1)取一定量的聚苯乙烯微球，用1×CB缓冲液将制得的人溶菌酶抗体与活化的聚苯乙烯微球混合，将人溶菌酶抗体标记于聚苯乙烯微球载体上；

2)将标记后的聚苯乙烯微球离心并弃上清，分离得到连接了人溶菌酶抗体的聚苯乙烯微球；

3)重复步骤2，用去离子水清洗连接了人溶菌酶抗体的聚苯乙烯微球1-2次；

4)将连接了人溶菌酶抗体的聚苯乙烯微球用保存液溶解，并冰水浴超声10min，即制得连接了人溶菌酶抗体的固相载体；

其中，步骤1)中所述的标记的温度为2-8℃，标记的时间为12小时；

其中，步骤2)中所述的离心的转速为8000-16000rpm，时间为1-4小时；

其中，步骤4)中所述的保存液的配制方法为：在容器中依次加入800mL的50mM pH8.0HEPES缓冲液，50g BSA搅拌溶解，9g NaCl，1g脱脂奶粉，1mL TWEEN-20，1g麦芽糖，0.8-1.2mL PEG 8000，加入各成分的同时伴随搅拌，再用50mM pH 8.0HEPES缓冲液定容至1000mL，再将溶液用0.22μm微孔滤膜过滤即得胶乳保存液。

所述的化学交联法具体包括以下步骤：

1)取一定量的聚苯乙烯微球，用EDC和NHS将聚苯乙烯微球活化；

2)用将制得的人溶菌酶抗体与活化的聚苯乙烯微球混合，将人溶菌酶抗体标记于聚苯乙烯微球载体上；

3)将标记后的聚苯乙烯微球离心并弃去上清，分离得到连接了人溶菌酶抗体的聚苯乙烯微球；

4)将连接了人溶菌酶抗体的聚苯乙烯微球用保存液溶解，在200W条件下，冰水浴超声10min，即制得聚苯乙烯微球标记物；

其中，步骤1)中所述的活化时间为1小时；

其中，步骤3)中所述的离心转速为8000-16000rpm，时间为1-4小时；

其中，步骤4)中所述的保存液的配制方法为：在容器中依次加入800mL的50mM pH8.0HEPES缓冲液，50g BSA搅拌溶解，9g NaCl，1g脱脂奶粉，1mLTWEEN-20，1g麦芽糖，0.8-1.2mL PEG 8000，加入各成分的同时伴随搅拌，再用50mM pH 8.0HEPES缓冲液定容至1000mL，再将溶液用0.22μm微孔滤膜过滤即得胶乳保存液。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：

1.本发明申请人意料之外的发现当在聚苯乙烯微球保存液中添加0.8-1.2mL PEG8000时，可以很好地提高检测灵敏度，检测下限可达0.08μg/ml，并且添加的1g麦芽糖显著增强了试剂的稳定性。

2.本发明中的一种基于胶乳免疫比浊法检测人体液样本中溶菌酶含量的试剂盒，可在全自动生化分析仪上使用，耗时短，操作简便，可实现短时高通量测定，显著提高了检测效率。

具体实施方式

应当指出，以下详细说明都是示范性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明的保护范围不局限于下述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明，或凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。

实施例1试剂盒中人溶菌酶抗体的制备

1)将人溶菌酶核酸序列制备成cDNA，并利用基因工程技术转入酵母菌表达系统中；

2)将酵母菌在30℃，pH 4.5，麦芽汁培养基中发酵，并制得含人溶菌酶的发酵液粗品，并将人溶菌酶粗品与724树脂混合，搅拌吸附6h，在2℃条件下静置24h，倾去上清液；

3)将树脂在8000rpm条件下离心2h，倾去上清液,用去离子水反复清洗树脂，重复本步骤2次，将树脂装柱，用150mM pH 6.5磷酸盐缓冲液清洗树脂，再用10％硫酸铵溶液对树脂进行洗脱，收集洗脱液；

4)在200rpm搅拌条件下，向洗脱液中缓慢加入固体硫酸铵，使之浓度达到40％，并伴有白色固体生成，2℃静置12h，然后将固体抽滤，用150mM pH 6.5磷酸盐缓冲液溶解沉淀；

5)将溶液装入透析袋中，在去离子水中透析24h，用盐酸将透析液pH值调整至5.0，冷冻干燥即制得人溶菌酶；

6)将溶菌酶多次免疫大鼠(RAT)，免疫完毕后取颈动脉血，于室温静置2-3小时。待血液凝结完全，析出血清后，以3000-5000rpm转速离心8-10分钟，然后取上清以PBS稀释后纯化，即可制得人溶菌酶抗体。

实施例2试剂盒中聚苯乙烯微球保存液配制

1)在容器中依次加入800mL的50mM pH 8.0HEPES缓冲液，50g BSA搅拌溶解，9gNaCl，1g脱脂奶粉，1mL TWEEN-20，1g麦芽糖，1mL PEG8000，加入各成分的同时伴随搅拌，再用50mM pH 8.0HEPES缓冲液定容至1000mL；

2)将溶液0.22μm微孔滤膜过滤备用。

对比例1试剂盒中聚苯乙烯微球保存液配制

该对比例采用实施例2所述的保存液配制方法进行配制，唯一的区别为：将PEG8000去掉，其他条件不变。

对比例2试剂盒中聚苯乙烯微球保存液配制

该对比例采用实施例2所述的保存液配制方法进行配制，唯一的区别为：将PEG8000替换为等量的PEG 1000，其他条件不变。

对比例3试剂盒中聚苯乙烯微球保存液配制

该对比例采用实施例2所述的保存液配制方法进行配制，唯一的区别为：将PEG8000替换为等量的PEG 4000，其他条件不变。

对比例4试剂盒中聚苯乙烯微球保存液配制

该对比例采用实施例2所述的保存液配制方法进行配制，唯一的区别为：将PEG8000替换为等量的PEG 20000，其他条件不变。

对比例5试剂盒中聚苯乙烯微球保存液配制

该对比例采用实施例2所述的保存液配制方法进行配制，唯一的区别为：将麦芽糖去掉，其他条件不变。

对比例6试剂盒中聚苯乙烯微球保存液配制

该对比例采用实施例2所述的保存液配制方法进行配制，唯一的区别为：将麦芽糖替换为等量的蔗糖，其他条件不变。

实施例3试剂盒中校准品制备

1)在20mM pH 6.0PBS缓冲液中加入10％(W/V)BSA，0.1％(V/V)TWEEN-20，充分搅拌后再用0.22μm微孔滤膜过滤，制成校准品稀释液；

2)用校准品稀释液溶解人溶菌酶即可得到校准品。

实施例4物理吸附制备连接了人溶菌酶抗体的固相载体

1)取聚苯乙烯微球，用1×CB缓冲液将制得的人溶菌酶抗体与活化的聚苯乙烯微球混合，2℃标记12h，将人溶菌酶抗体标记于聚苯乙烯微球载体上；

2)将标记后的聚苯乙烯微球在8000rpm条件下离心1h，弃去上清，分离得到连接了人溶菌酶抗体的聚苯乙烯微球；

3)重复步骤2)，用去离子水清洗连接了人溶菌酶抗体的聚苯乙烯微球1次；

4)将连接了人溶菌酶抗体的聚苯乙烯微球用保存液溶解，在200W条件下，冰水浴超声10min，超声3s，间歇3s，即制得连接了人溶菌酶抗体的固相载体；

其中，所述的聚苯乙烯微球的粒径为250nm。

实施例5化学交联制备连接了人溶菌酶抗体的固相载体

1)取聚苯乙烯微球，用EDC和NHS将聚苯乙烯微球活化1h；

2)用制得的人溶菌酶抗体与活化的聚苯乙烯微球混合，将人溶菌酶抗体标记于聚苯乙烯微球载体上；

3)将标记后的聚苯乙烯微球在8000rpm条件下离心1h，弃去上清，分离得到连接了人溶菌酶抗体的聚苯乙烯微球；

4)将连接了人溶菌酶抗体的聚苯乙烯微球用保存液溶解，在200W条件下，冰水浴超声10min，超声3s，间歇3s，即制得连接了人溶菌酶抗体的固相载体；

其中，所述的聚苯乙烯微球的粒径为250nm。

实施例6试剂盒中试剂1反应缓冲液配制

在100mM pH7.2-7.4PBS缓冲液中加入0.1％(V/V)TWEEN-20，0.22μm微孔滤膜过滤，制成反应缓冲液。

实施例7试剂盒的使用

1)按照校准品制备方法可制得多水平梯度校准品，校准梯度为0μg/mL，10μg/mL，40μg/mL，80μg/mL，160μg/mL，320μg/mL；

2)生化分析仪设定参数如表1所示。

表1

数据处理：

采用多校准点校准，Spline或Log-4P曲线拟合方式进行拟合，由校准品与△A间建立校准曲线关系，样本检测△A通过校准曲线，定量计算样本中溶菌酶含量。

实验例1试剂盒稳定性测试

将根据实施例1、2、3、4和6所示的制备方法和实施例7所示的使用方法制备并使用的一个批次的试剂，放置37℃进行稳定性实验，连续测试同一个样本7天。同样的方法，仅将实施例2中的聚苯乙烯微球保存液分别替换为对比例5和对比例6制备的聚苯乙烯微球保存液，并进行相应的测试。

结果如表2所示。

表2：

可见，当聚苯乙烯微球保存液中去掉1g的麦芽糖后，试剂盒的稳定性检测结果明显变差，将麦芽糖替换为蔗糖的稳定性效果也远远不如本发明中采用的麦芽糖，即本发明的聚苯乙烯微球中添加了1g的麦芽糖后，显著提高了试剂盒检测的稳定性。

实验例2试剂盒灵敏度检测

将根据实施例1、2、3、4和6所示的制备方法和实施例7所示的使用方法制备并使用的一个批次的试剂，以水为样本，连续重复测试20次。分析灵敏度为平均值加2倍标准差。同样的方法，仅将实施例2中的聚苯乙烯微球保存液分别替换为对比例1、对比例2、对比例3和对比例4制备的聚苯乙烯微球保存液，并取得各自的灵敏度值；

结果如表3所示。

表3：

综上，发明人意料之外的发现当在聚苯乙烯微球保存液中添加1g的麦芽糖时，检测的稳定性明显高于添加之前或添加其他糖类的稳定性，发明人推测麦芽糖和聚苯乙烯微球保存液中其他的物质整体作用，起到了稳定剂的作用；

当在聚苯乙烯微球保存液中添加1mL PEG 8000时，该试剂盒的检测灵敏度最高，可达0.08μg/ml，灵敏度明显高于不添加或者添加其他PEG种类时的灵敏度，而且检测的灵敏度并不是随着PEG种类后面的数字的增加而增加。通过实验例2可知，当添加PEG8000时，检测的灵敏度比添加PEG20000时明显要高，即发明人发现添加1mL PEG8000时的检测灵敏度最高。