一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。所述试剂盒由：分别用于检测SLCO1B1基因rs2306283位点、SLCO1B1基因rs4149056位点、ApoE基因rs429358位点和ApoE基因rs7412位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成，所述PCR预混反应液包含用于扩增各位点的特异性引物序列组、探针组和PCR反应液，所述特异性引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成。本发明所述试剂盒用于检测人类SLCO1B1和ApoE基因多态性具有灵敏度高、特异性高、操作简便、结果可靠等优点，且能在1小时内完成检测，并且结果判读简单客观。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

人类SLCO1B1基因定位于12号染色体，编码有机阴离子转运多肽OATP1B1。OATP1B1为跨膜转运蛋白，主要分布于肝脏，具有介导肝细胞膜转运内、外源性物质并对其进行代谢和消除的生理功能，在转运他汀类药物中发挥重要的调控作用。研究表明SLCO1B1基因具有遗传多态性，其中388A>G、521T>C是两种常见的单核苷酸多态性，可以形成4种单倍型SLCO1B1*1a(388A-521T)、SLCO1B1*1b(388G-521T)、SLCO1B1*5(388A-521C)和SLCO1B1*15(388G-521C)。突变型SLCO1B1基因引起编码的OATP1B1转运蛋白活力减弱，表现为肝脏摄取药物能力降低，引起血药浓度上升。ApoE基因定位于第19对染色体，指导合成载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)，ApoE是血浆中重要的载脂蛋白之一，主要在肝脏和脑组织中表达，识别LDL受体和ApoE受体，介导VLDL和IDL的代谢。ApoE基因主要有两种单核苷酸多态性，rs7412(526C>T)和rs429358(388T>C)，可以形成3种单倍型分别是ApoE3(388T-526C)、ApoE2(388T-526T)、ApoE4(388C-526C)。文献报道，ApoE4携带者相比于ApoE2携带者的药物代谢能力较弱。图1是SLCO1B1基因和ApoE基因多态性位点及基因型频率汇总。他汀类药物是目前防治冠心病、脑中风、高血脂等疾病的首选药物。当SLCO1B1基因发生突变时，其转运功能下降，会导致血液中的他汀类药物浓度上升，增加药物的不良反应(如横纹肌溶解症等)；ApoE基因产生变异时，可导致TC、LDL-C水平产生差异，从而对他汀类药物的疗效产生影响。

目前临床上主要采取以下四种方式检测SLCO1B1和ApoE基因的多态性：

1.PCR-测序法

2.高分辨率溶解曲线法

3.芯片杂交法

4.Taqman-qPCR法

PCR-测序法灵敏度低，实验耗时长，不适合临床推广；芯片杂交法，检测灵敏度低并且特异性差，容易出现假阳性结果；高分辨率溶解曲线法对设备要求特殊，不适合临床推广，且检测灵敏度不高。Taqman-qPCR法，检测灵敏度高，但往往由于位点序列原因，导致检测特异性不高，并且其通过Genotyping方法进行分型，对样本数量和多态性分布有一定要求，不适合检测突变频率过低的位点。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用。本试剂盒具有高灵敏度、高特异性、低成本高通量、操作简便、实验周期短等特点，可以快速精准的对人类基因组DNA中SLCO1B1和ApoE基因多态性进行检测。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测引物组，所述引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成，具体序列如下：

一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测探针组，所述探针组由特异性taqman-MGB探针和携带淬灭基团的锁核酸探针组成，具体序列如下：

内控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’ SEQ ID NO.19

野生型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’SEQ ID NO.20

突变型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’SEQ ID NO.21。

一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒，所述试剂盒由：分别用于扩增SLCO1B1基因rs2306283、SLCO1B1基因rs4149056、ApoE基因rs429358和ApoE基因rs7412四个位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成；

所述PCR预混反应液的具体组分如下：

(1)用于扩增SLCO1B1基因rs2306283位点PCR预混反应液：由权利要求1所述用于扩增SLCO1B1基因rs2306283位点的4个引物、引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示，内控引物、引物序列如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示，权利要求2所述探针组，核苷酸序列如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.21所示，PCR反应液组成；

(2)用于扩增SLCO1B1基因rs4149056位点PCR预混反应液：由权利要求1所述用于扩增SLCO1B1基因rs4149056位点的4个引物、序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示，内控引物、序列如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示，权利要求2所述探针组、序列如SEQ IDNO.19～SEQ ID NO.21所示，PCR反应液组成；

(3)用于扩增ApoE基因rs429358位点PCR预混反应液：由利要求1所述用于扩增ApoE基因rs429358位点的4个引物、序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示；内控引物、序列如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示，权利要求2所述探针组、序列如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.21所示，PCR反应液组成；

(4)用于扩增ApoE基因rs7412位点PCR预混反应液：由利要求1所述用于扩增ApoE基因rs7412位点的4个引物、序列如SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.16所示，内控引物、序列如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示，权利要求2所述探针组、序列如SEQ ID NO.19～SEQ IDNO.21所示，PCR反应液组成；

所述阳性对照品包括：SLCO1B1基因rs2306283位点野生型质粒、SLCO1B1基因rs2306283位点突变型质粒、SLCO1B1基因rs4149056位点野生型质粒、SLCO1B1基因rs4149056位点突变型质粒、ApoE基因rs429358位点野生型质粒、ApoE基因rs429358位点突变型质粒、ApoE基因rs7412位点野生型质粒、ApoE基因rs7412位点突变型质粒及内参基因质粒DNA；所述阴性对照品包含不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒。

上述方案中，所述PCR预混反应液中，探针组内taqman-MGB探针的浓度为50～100nM，携带淬灭基团的锁核酸探针的浓度均为100～400nM；用于扩增各位点的不带荧光基团的各引物浓度均为100～400nM，带荧光基团的各引物浓度均为50～100nM；用于内控的引物的浓度均为100～400nM。

上述方案中，所述PCR反应液包括Premix qPCRmix和TE缓冲液。

上述方案中，所述阴性对照品由PUC-19质粒空载体和TE缓冲液组成。

上述人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒在制备用于检测人类SLCO1B1和ApoE基因多态性产品中的应用。

采用人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒检测人类SLCO1B1和ApoE基因多态性的检测过程，具体包括如下步骤：

(1)采用基因组DNA提取试剂盒提取待测人外周血的基因组DNA作为待检测样本；

(2)荧光定量检测：向反应管中加入PCR预混反应液和待测样本DNA；同时设置阳性对照组和阴性对照组，然后将反应管置于荧光PCR仪进行PCR扩增反应，并采集FAM、VIC和ROX荧光信号；

(3)PCR扩增反应结束后，根据所采集的荧光信号起线情况进行结果判定。

上述方案中，步骤(1)中将所述待检测样本DNA稀释到浓度为0.1～100ng/μL，再进行PCR扩增反应。

上述方案中，步骤(2)中所述PCR扩增反应的条件为：95℃1分钟预变性；15个循环：95℃5秒，61℃32秒，不收集荧光；30个循环：95℃5秒，61℃32秒，收集荧光。

上述方案中，步骤(3)所述结果判定的原则为(如下表5所示)：①当阳性对照组均有FAM、VIC、ROX荧光信号起线，阴性对照组均无FAM、VIC、ROX荧光起线，待检测样本有ROX荧光信号起线时，判定实验成功，可以进行后续分型判定；②根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断SLCO1B1基因rs2306283位点的分型：VIC荧光信号起线，SLCO1B1基因rs2306283位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，SLCO1B1基因rs2306283位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，SLCO1B1基因rs2306283位点分型为杂合突变型；③根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断SLCO1B1基因rs4149056位点的分型：VIC荧光信号起线，SLCO1B1基因rs4149056位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，SLCO1B1基因rs4149056位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，SLCO1B1基因rs4149056位点分型为杂合突变型；④根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断ApoE基因rs429358位点的分型：VIC荧光信号起线，ApoE基因rs429358位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，ApoE基因rs429358位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，ApoE基因rs429358位点分型为杂合突变型；⑤根据检测样本的FAM、VIC荧光信号判断ApoE基因rs7412位点的分型：VIC荧光信号起线，ApoE基因rs7412位点分型为纯合野生型；FAM荧光信号起线，ApoE基因rs7412位点分型为纯合突变型；VIC、FAM荧光信号均起线，ApoE基因rs7412位点分型为杂合突变型。

本发明所述人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒的检测原理如图2和图3所示，携带FAM荧光的带有标签序列的ARMs引物可特异性识别并扩增突变基因型的模板，并且随着引物的消耗，将更多的FAM荧光释放出来，在循环结束时，采集各通道荧光，生成荧光曲线；携带VIC荧光的带有标签序列的ARMs引物可特异性识别并扩增野生基因型的模板，并且随着引物的消耗，将更多的VIC荧光释放出来，在循环结束时，采集各通道荧光，生成荧光曲线。内控探针采用MGB探针，特异性识别内控相应序列，通过扩增，越来越多的ROX荧光被释放出来。所以当检测的基因组模板是纯合野生型，最终显示只有内控(ROX)和野生(VIC)荧光曲线可以正常起线且曲线呈S型，突变(FAM)荧光曲线不起线，或起线很低且不呈S型。当检测的基因组模板是纯合突变型，最终显示只有内控(ROX)和突变(FAM)荧光曲线可以正常起线且曲线呈S型，野生(VIC)荧光曲线不起线，或起线很低且不呈S型。当检测的基因组模板是杂合子，最终显示有内控(ROX)、突变(FAM)和野生(VIC)荧光曲线均可以正常起线且曲线呈S型。

本发明的有益效果如下：本发明所述人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒可以简单快速的检测人类SLCO1B1和ApoE基因多态性分型，采用ARMs引物结合特异性荧光标签进行PCR反应实现每个基因的多态性分型只需通过一个多重PCR反应即可完成，每个PCR反应中均含有内控，保证检测结果的准确性，防止假阴性和假阳性结果的出现；每个PCR反应体系中携带FAM或VIC荧光的带标签ARMs引物可以被相应带有淬灭基团的锁核酸锁定使荧光处于淬灭状态，PCR反应过程中，携带FAM或VIC荧光的带标签ARMs引物与待检测基因模板特异性结合后释放荧光生成荧光曲线进行结果判读；本发明利用携带荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物结合携带淬灭基团的锁核酸序列、特异性的内控探针、和特异性的内控引物，可以大大提高基因分型的特异性和准确性，同时，两条外引物F1和R1也可以进行扩增，进一步富集基因组模板，可以大大提高分型效率，进而可以检测到更低浓度的基因组样本，本发明所述试剂盒最低可对0.1ng基因组DNA进行多态性检测；此外，本发明所述试剂盒采用预混合的方式进行包装，使用时仅需加入基因组DNA，同时简化了PCR的反应程序，可在1小时内完成阿司匹林抵抗基因多态性的检测，可直接根据荧光曲线进行结果判读，判读结果简便客观，便于分析。

附图说明

图1为临床上SLCO1B1和ApoE基因位点多态性及其发生频率。

图2为本发明所述试剂盒的检测原理示意图。

图3为本发明所述试剂盒的检测原理示意图。

图4为SLCO1B1基因rs2306283位点纯合野生型检测结果。

图5为SLCO1B1基因rs2306283位点杂合型检测结果。

图6为SLCO1B1基因rs2306283位点纯合突变型检测结果。

图7为SLCO1B1基因rs4149056位点纯合野生型检测结果。

图8为SLCO1B1基因rs4149056位点杂合型检测结果。

图9为SLCO1B1基因rs4149056位点纯合突变型检测结果。

图10为ApoE基因rs429358位点纯合野生型检测结果。

图11为ApoE基因rs429358位点杂合型检测结果。

图12为ApoE基因rs429358位点纯合突变型检测结果。

图13为ApoE基因rs7412位点纯合野生型检测结果。

图14为ApoE基因rs7412位点杂合型检测结果。

图15为ApoE基因rs7412位点纯合突变型检测结果。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1制备本发明的SLCO1B1和ApoE基因检测试剂盒

一、引物设计和合成：

SLCO1B1 388、SLCO1B1 521、ApoE 388和ApoE 526 4个位点每个体系中包含6条引物；其中两条正义链上游引物F1和F2，两条反义链下游引物R1和R2，F1和R1为普通引物，F2和R2为带荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物，通过引物和PCR反应条件筛选，保证引物对F1R1对模板进行富集，而F2和R1，F1和R2可正常扩增出带荧光的特定基因型PCR产物；每个基因位点中均加入内参引物。

具体序列如下：

具体的组合如下：

其中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4用于扩增SLCO1B基因位点388A DNA片段，扩增产物为107bp，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3用于扩增SLCO1B1 388G DNA片段，扩增产物为102p，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3对两种基因型均进行扩增；

其中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8用于扩增SLCO1B基因位点521T DNA片段，扩增产物为133bp，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7用于扩增SLCO1B基因位点521C DNA片段，扩增产物为141bp，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.7对两种基因型均进行扩增；

其中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.12用于扩增ApoE基因位点388T DNA片段，扩增产物为104bp，SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11用于扩增ApoE基因位点388C DNA片段，扩增产物为135bp，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11对两种基因型均进行扩增；

其中SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.16用于扩增ApoE基因位点526C DNA片段，扩增产物为110bp，SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15用于扩增ApoE基因位点526T DNA片段，扩增产物为99bp，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.15对两种基因型均进行扩增；

SEQ ID NO 17和SEQ ID NO18用于扩增内控DNA片段，扩增产物为186bp；

二、探针设计和合成：

SLCO1B1 388、SLCO1B1 521、ApoE 388和ApoE 526四个位点每个体系中包含2条特异性带淬灭基团的锁核酸探针和1条内参特异性MGB探针，2条特异性带淬灭基团的锁核酸探针其中一条用于锁定检测野生型的带VIC荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物，另一条用于锁定检测突变型的带FAM荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物；内参特异性MGB探针用于识别内参位点。

具体序列如下：

内控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’ SEQ ID NO.19

野生型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’SEQ ID NO.20

突变型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’SEQ ID NO.21。

具体的组合如下：

其中SEQ ID NO.19特异性识别内参位点；

其中SEQ IDNO.20特异性识别并锁定检测野生型的带VIC荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物；

其中SEQ ID NO.21特异性识别检测突变型的带FAM荧光基团和标签序列的特异性ARMs引物；

三、PCR预混反应液配置

PCR预混反应液1：由用于扩增SLCO1B1基因rs2306283位点A388G的4个引物，引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示；内控引物，引物序列如SEQ ID NO.17～SEQ IDNO.18所示；探针组，核苷酸序列如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.21所示；PCR反应液组成，具体成分如下表1：

表1 SLCO1B1基因rs2306283位点PCR反应液试剂组成

PCR预混反应液2：由用于扩增SLCO1B1基因rs4149056位点T521C位点的4个引物，引物序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示；内控引物，引物序列如SEQ ID NO.17～SEQID NO.18所示；探针组，核苷酸序列如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.21所示；PCR反应液组成。具体成分如下2：

表2 SLCO1B1基因rs4149056位点PCR反应液试剂组成

组分配比Premix qPCR MIX25μLSEQ ID NO.5100～400nMSEQ ID NO.650～100nMSEQ ID NO.7100～400nMSEQ ID NO.850～100nMSEQ ID NO.17100～400nMSEQ ID NO.18100～400nMSEQ ID NO.1950～100nMSEQ ID NO.20100～400nMSEQ ID NO.21100～400nMTE缓冲液补足至30μL

PCR预混反应液3：由用于扩增ApoE基因rs429358位点T388C的4个引物，引物序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示；内控引物，引物序列如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示；探针组，核苷酸序列如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.21所示；PCR反应液组成。具体成分如下表3：

表3 ApoE基因rs429358位点PCR反应液试剂组成

PCR预混反应液4：由用于扩增ApoE基因rs7412位点C526T的4个引物，引物序列如SEQ ID NO.13～16所示；内控引物，引物序列如SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.18所示；探针组，核苷酸序列如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.21所示；PCR反应液组成。具体成分如下表4：

表4 ApoE基因rs7412位点PCR反应液试剂组成

组分配比Premix qPCR MIX25μLSEQ ID NO.13100～400nMSEQ ID NO.1450～100nMSEQ ID NO.15100～400nMSEQ ID NO.1650～100nMSEQ ID NO.17100～400nMSEQ ID NO.18100～400nMSEQ ID NO.1950～100nMSEQ ID NO.20100～400nMSEQ ID NO.21100～400nMTE缓冲液补足至30μL

四、对照品配置

阳性对照品：浓度各为10^4copy/μl的SLCO1B1基因rs2306283位点野生型质粒、SLCO1B1基因rs2306283位点突变型质粒、SLCO1B1基因rs4149056位点野生型质粒、SLCO1B1基因rs4149056位点突变型质粒、ApoE基因rs429358位点野生型质粒、ApoE基因rs429358位点突变型质粒、ApoE基因rs7412位点野生型质粒、ApoE基因rs7412位点突变型质粒及内参基因质粒DNA和TE缓冲液。所述质粒序列为本领域人员所熟知，此处不再一一列举其序列。

阴性对照品：PUC-19质粒空载体和TE缓冲液。

五、组装试剂盒

试剂盒包含4管分别检测SLCO1B1 388、SLCO1B1 521、ApoE 388和ApoE 526基因位点多态性的PCR预混反应液，1管阳性对照品，1管阴性对照品。计算20人份规格的使用量，配制各管中的成分并组装。

实施例2

使用实施例1中制备的人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒对待测样本进行检测。本实施例收集100例EDTA抗凝静脉全血样本，提取基因组DNA，使用人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒检测SLCO1B1 388、SLCO1B1 521、ApoE 388和ApoE 526基因多态性情况，具体操作过程如下：

(1)血液样本基因组DNA提取：使用商品化提取试剂盒进行基因组DNA提取，提取完成后使用TE缓冲液洗脱DNA，并测定DNA浓度；将基因组DNA稀释到20ng/μl；

(2)荧光定量检测：向反应管中加入30μl PCR预混反应液和20μl待测样本DNA；PCR反应程序为：95℃1分钟预变性；15个循环：95℃5秒，61℃32秒，不收集荧光；30个循环：95℃5秒，61℃32秒，收集荧光。

(3)PCR反应结束后按照表5，进行结果判读。

表5结果判读

注:“+”代表deta Rn终点荧光值>100,000，且扩增曲线呈S型；“-”代表deta Rn终点荧光值<100,000，或曲线非S型；

判读结果如下：

SLCO1B1基因rs2306283位点1075纯合野生样本8例，其中一个检测结果如图4所示；

SLCO1B1基因rs2306283位点1075杂合样本36例，其中一个检测结果如图5所示；

SLCO1B1基因rs2306283位点1075纯合突变样本56例，其中一个检测结果如图6所示；

SLCO1B1基因rs4149056位点纯合野生样本70例，其中一个检测结果如图7所示；

SLCO1B1基因rs4149056位点杂合样本28例，其中一个检测结果如图8所示；

SLCO1B1基因rs4149056位点纯合突变样本2例，其中一个检测结果如图9所示；

ApoE基因rs429358位点纯合野生样本80例，其中一个检测结果如图10所示；

ApoE基因rs429358位点杂合样本19例，其中一个检测结果如图11所示；

ApoE基因rs4293583位点纯合突变样本1例，检测结果如图12所示；

ApoE基因rs7412位点纯合野生样本85例，其中一个检测结果如图13所示；

ApoE基因rs7412位点杂合样本14例，其中一个检测结果如图14所示；

ApoE基因rs7412位点纯合突变样本1例，检测结果如图15所示。

上述100例样本荧光定量检测结果与测序结果100％一致。这表明本发明所述人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒用于人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测结果非常可靠，且本发明所述试剂盒的检测灵敏度远高于测序法。采用本发明所述试剂盒检测人类SLCO1B1和ApoE基因多态性具有灵敏度高、特异性高、操作简便、结果可靠等优点，此外本发明简化了PCR的反应程序，将常规PCR反应中的退火和延伸步骤(退火30秒延伸1分钟)简化为一个步骤(仅需61度反应32秒)所以可在1小时内完成检测，并且本发明可直接根据荧光曲线进行结果判读，结果直观，判读简便。

实施例3

使用实施例1制备的试剂盒检测验证本试剂盒的最低检测线，具体包括如下操作步骤：

(1)使用实施例2中已知SLCO1B1和ApoE相应位点基因型的样本，每个位点分别选取野生型基因组、突变型基因组和杂合型基因组样本各一例，将上述样本稀释至10ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL、0.25ng/μL、0.1ng/μL、0.05ng/μL、0.025ng/μL、0.001ng/μL；

(2)荧光定量检测：向反应管中加入30μl PCR预混反应液和20μl待测样本DNA；PCR反应程序为：95℃1分钟预变性；15个循环：95℃5秒，61℃32秒，不收集荧光；30个循环：95℃5秒，61℃32秒，收集荧光；每个样本的每个浓度梯度均重复检测20次；

(3)PCR反应结束后按照表5，进行结果判读；

(4)统计上述样本各个浓度梯度的检测成功率(分型与已知基因型一致即为检测成功，检测成功率＝检测结果一致结果数量/20×100％)，见表6～9。

表6 SLCO1B1基因rs2306283位点检测成功率统计

表7 SLCO1B1基因rs4149056位点检测成功率统计

表8 ApoE基因rs429358位点检测成功率统计

表9 ApoE基因rs7412位点检测成功率统计

上述结果显示，本发明可对浓度低至0.1ng/μL的DNA样本进行人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉康录生物技术股份有限公司

<120>一种人类SLCO1B1和ApoE基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用

<160> 21

<210> 1

<211> 22bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞1

atatttctct gtatttctag ga 22

<210> 2

<211> 24bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞2

atcccttgtc atcgttgatg aatc24

<210> 3

<211> 17bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞3

attcttacct tttccca17

<210> 4

<211>25bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞4

aagatacatt gatgaactaa tatca25

<210> 5

<211>25bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞5

aagatacatt gatgaactaa tatca25

<210> 6

<211>24bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞6

atcccttgtc atcgtccatg aacg 24

<210> 7

<211>20bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞7

tgatcataca atttaatatt20

<210> 8

<211>26bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞8

aagatacatt gatgatggat atatgt26

<210> 9

<211>18bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞9

actggaggaa caactgac 18

<210> 10

<211>22bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞10

atcccttgtc atcgtggccg cg22

<210> 11

<211>20bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞11

ctgcaggtca tcggcatcgc 20

<210> 12

<211>24bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞12

aagatacatt gatgaaggac gtgt 24

<210> 13

<211>17bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞13

gtgcaggcca tgctcgg 17

<210> 14

<211>25bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞14

atcccttgtc atcgtctgcc aggca 25

<210> 15

<211>16bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞15

cacgcggccc tgttcc 16

<210> 16

<211>25bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞16

aagatacatt gatgactgca gaagc 25

<210> 17

<211>20bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞17

cgggacctga ctgactacct20

<210> 18

<211>20bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞18

ggccatctct tgctcgaagt20

<210> 19

<211>16bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞19

accaccacgg ccgagc16

<210> 20

<211>15bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞20

acgatgacaa gggat 15

<210> 21

<211>15bp

<212> DNA

<213>人工序列

＜400＞21

tcatcaatgt atctt 15