小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用

摘要

本发明公开了小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用。本发明提供了TaWox5基因或含有所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高核酸分子转化目的植物转化效率中的应用，还提供了TaWox5基因或含有所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在促进核酸分子转化目的植物中的应用。本发明克隆了小麦TaWOX5基因，将该基因导入不同小麦中的结果发现，该基因可以大幅提高小麦转化效率。不仅提高了Fielder等易转化小麦品种的转化效率，还大大提高了难转化小麦品种如济麦22，矮抗58及京411等的转化效率，解决了小麦转化基因型限制的问题。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用。

背景技术

自1983年植物转基因技术取得成功以来，利用遗传工程途径改良植物的发展速度很快。2016年全球共有28个国家种植了转基因作物，面积达到了1.797亿公顷，比1996年增加了约100倍，约1800万农民从种植转基因作物中受益。转基因作物的种植不但提高了产量，增加了收入，而且减少了杀虫剂使用，保护了环境和生物多样性，提高了农产品品质。但是，目前全球商业化种植的转基因作物仅限于抗虫玉米和棉花，抗除草剂大豆和油菜，抗病毒病木瓜等，还没有小麦等主要禾谷类粮食作物。相比之下，全球转基因小麦研究和产业化明显处于落后状态。除了转基因品种安全性、产业政策、人们认识、基因功能等因素的限制外，低效率的遗传转化技术是限制转基因小麦研发的主要环节(Harwood，2012)。为了培育抗病、耐旱、耐盐、优质、营养吸收高效的转基因小麦，需要对大量候选基因进行功能鉴定。由于目标基因表达受到插入位点和插入拷贝数等因素的影响，以及外源基因插入对内源基因遗传和功能的影响等，鉴定每一个候选基因的功能都需要获得一定数量的转基因植株。另外，随着小麦基因组测序工作的完成，大量基因将被克隆和进行功能研究。所以，转基因小麦研发和小麦功能基因组学研究需要获得大量转基因植株，迫切需要提高小麦转化效率，扩大转化规模，建立高效、安全、规模化转基因技术体系，推进转基因小麦产业化和小麦功能基因组学研究进程。

在主要农作物中，小麦属于遗传转化比较困难的作物(Harwood，2012)，遗传转化效率较低，重复性较差，基因工程育种进程明显落后于大豆、玉米、棉花、水稻等农作物。知道近几年日本烟草公司将小麦的遗传转化效率大幅提升，澳大利亚利用该技术小麦转化效率可以达到40％左右(Richardson et al，2014)。但是该技术仅仅针对Fielder及Westonia等少数基因型有效果，多数小麦品种转化效率仍然较低甚至不能转化。本单位于2014年引进了该技术，通过对该技术的消化吸收与改进，小麦基因型Fielder和CB037的转化效率也达到40％，并成功转化了周麦18，杨麦16，冀5264等15个商业化品种。但是除了科农199的转化效率达到20％以外，其它品种转化效率不高，其中济麦22只有2.7％，中麦895仅3.6％，矮抗58及京411没有转化成功。考虑到转基因小麦的产业化前景，育种家需要用大面积推广的小麦品种作为转化受体，因此，商业化小麦品种的转化是最大的限制因素。

发明内容

本发明的一个目的是提供TaWox5蛋白或其编码基因或含有所述基因的表达盒或含有所述基因的重组载体或含有所述基因的重组菌的用途。

本发明提供的TaWox5蛋白或其编码基因或含有所述基因的表达盒或含有所述基因的重组载体或含有所述基因的重组菌在提高核酸分子导入目的植物转化效率中的应用。

本发明还提供了TaWox5蛋白或其编码基因或含有所述基因的表达盒或含有所述基因的重组载体或含有所述基因的重组菌在促进核酸分子导入目的植物中的应用。

上述应用中，所述TaWox5蛋白源自小麦。

或所述TaWox5蛋白的氨基酸序列为序列2。

上述应用中，所述TaWox5蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的DNA分子:

1)核苷酸序列为序列1第11821-12573位的DNA分子；

2)与1)所示的DNA分子同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；(麻烦把英文字体改一致，一般全用times new man)

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子。

上述应用中，所述植物为小麦；

或所述核酸分子为质粒；

或所述核酸分子为质粒，所述质粒为pDE003。

本发明另一个目的是提供一种提高核酸分子导入目的植物的转化效率的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将含有TaWox5蛋白编码基因的表达盒和核酸分子转入目的植物中，实现提高核酸分子导入目的植物的转化效率。

含有TaWox5蛋白编码基因的表达盒和核酸分子可以通过一个载体也可以通过不同载体转入目的植物中。

上述方法中，所述TaWox5基因源自小麦；

所述TaWox5蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的DNA分子:

1)核苷酸序列为序列1第11821-12573位的DNA分子；

2)与1)所示的DNA分子同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；

3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子；

所述含有所述基因的表达盒为如下a)-c)中任一所述的DNA分子:

a)核苷酸序列为序列1第9812-12837位的DNA分子；

b)与1)所示的DNA分子同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；

c)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子。

上述方法中，所述植物为小麦；

或所述核酸分子为质粒；

或所述核酸分子为质粒，所述质粒为pDE003。

上述方法中，所述含有TaWox5蛋白编码基因的表达盒和核酸分子是通过pDE003-TaWOX5载体转入目的植物中；所述pDE003-TaWOX5载体的核苷酸序列为序列1。

本发明第3个目的是提供如下物质。

本发明提供的物质，为TaWox5蛋白或其编码基因或含有所述基因的表达盒或含有所述基因的重组载体或重组菌。

上述提高核酸分子导入目的植物转化效率的方法为将TaWOX5和其它核酸分子混合导入目的植物转化效率高于将其它核酸分子单独导入目的植物转化效率。

本发明克隆了小麦TaWOX5基因，将该基因导入不同小麦中的结果发现，该基因可以大幅提高小麦转化效率。不仅提高了Fielder等易转化小麦品种的转化效率，还大大提高了难转化小麦品种如济麦22，矮抗58及京411等的转化效率，解决了小麦转化基因型限制的问题。

附图说明

图1为pDE001载体示意图。

图2为pDE003载体示意图。

图3为pDE003-TaWOX5载体示意图。

图4为Bar基因的PCR检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中所举的质粒、菌株只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体试验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

试验例中所举的质粒、菌株来源如下：

克隆载体pMD-18T：为Takara公司市售产品；

植物表达载体pDE001和pDE003：为拜尔迪公司市售产品；

大肠杆菌TOP10：为北京市全式金公司市售产品；大肠杆菌PRK2013和根癌农杆菌C58C1由本实验室保存。

科农199、轮选987、济麦22、矮抗58、杨麦16、京411、Fielder、CB037、西农979均记载在如下文献中：Wang et.al 2017Generation of marker-free transgenic hexaploidwheat via an Agrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercialChinese wheat varieties Plant biotechnology journal 15:614-623；王荣成,张睿.肥料运筹对强筋小麦西农979群体及产量效应.西北农业学报,2012,21(6):63-66。

实施例1、小麦TaWOX5基因克隆及其在小麦转基因中的应用

一、小麦TaWOX5基因克隆

设计引物(F：GTGTCAATGGAGGCGCTGAGCG；R：GTGTCAATGGAGGCGCTGAGCG)。

提取小麦品系CB037的基因组DNA作为模板，用上述引物F和R进行AS-PCR扩增，得到约760bp片段。

将上述PCR产物连接在pMD-18T载体上，得到pMD-18T-TaWOX5，送去测序。

测序结果，该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，命名为TaWOX5基因，该基因长度为749bp，含有1个116bp的内含子，编码210个氨基酸，该基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列2，该蛋白命名为TaWOX5。

也可以人工合成序列1，将其连接在pMD-18T载体上，得到pMD-18T-TaWOX5。

二、小麦TaWOX5基因在小麦转基因中的应用

1、植物转化载体pDE003-TaWOX5的构建

将上述引物F和R分别加上SmaI和KpnI，利用高保真酶KOD以pMD-18T-TaWOX5为模板进行PCR扩增，然后利用KpnI和SmaI对PCR产物和pDE001载体(图1)进行酶切，得到773bp的PCR扩增产物和4535bp的pDE001载体骨架，最后将两者进行连接得到中间的植物表达载体pDE001-TaWOX5。然后利用HindIII分别对pDE001-TaWOX5和pDE003(图2)进行酶切，得到3033bp的TaWOX5酶切产物和10170bp的pDE003载体骨架，最后将两者的酶切产物进行连接得到最终的植物表达载体pDE003-TaWOX5(图3)。

pDE003-TaWOX5载体的核苷酸序列为序列1，该载体为将序列1第9812-12837所示的DNA分子(含有TaWOX5基因的表达盒)插入pDE003载体的HindIII酶切位点间得到的载体。

其中，序列1第7832-9817位为UBI启动子，第7257-7808位为Bar基因，第6989-7242位为Nos终止子,9818-11815位为UBI启动子，第11821-12573位为TaWOX5基因，第12586-12837位为Nos终止子。

将植物表达载体pDE003-TaWOX5转入大肠杆菌Top10中，得到含pDE003-TaWOX5的大肠杆菌Top10菌株。

2、重组质粒pDE003-TaWOX5转入农杆菌C58C1

1)将宿主菌农杆菌C58C1(Wang et.al 2017Generation of marker-freetransgenic hexaploid wheat via an Agrobacterium-mediated co-transformationstrategy in commercial Chinese wheat varieties Plant biotechnology journal15:614-623)菌株在4ml含Rif、Gen的LB培养基的试管中，180rpm,28℃培养40h，得到农杆菌C58C1菌液；

含pDE003-TaWOX5的大肠杆菌Top10菌株及辅助菌PRK2013(wang et.Al2017Generation of marker-free transgenic hexaploid wheat via anAgrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercial Chinese wheatvarieties Plant biotechnology journal 15:614-623)在4ml含Kan的LB培养基的试管中，225rpm,37℃培养16h，得到含pDE003-TaWOX5的大肠杆菌Top10菌液和PRK2013菌液；

2)将农杆菌C58C1菌液、含pDE003-TaWOX5的大肠杆菌Top10菌液和PRK2013菌液各100μl加入1.5ml离心管中，混匀；用只有农杆菌C58C1菌液和辅助菌PRK2013菌液各100μl加入1.5ml离心管中作对照；4000rpm,离心3min收集菌体；

3)弃上清，并用移液枪将剩余的上清液吸干，加入50μl不含抗生素的LB培养基，重悬浮菌体；

4)用移液枪将菌体加入不含抗生素的LB固体培养基上，注意不要晃动平板，使菌体成团，待平板晾干后，用封口膜封好，28℃培养24h；

5)用接种针将从菌团上接取少量菌体，在含Rif、Gen、Kan的LB固体培养基上划线，每个平板划一个目的菌和一个对照，28℃培养48h。

6)从三亲杂交的平板上挑取单克隆，PCR验证阳性农杆菌菌株。

PCR验证的引物为引物F和R，结果得到700bp的为阳性农杆菌菌株。

阳性农杆菌菌株为将重组质粒pDE003-TaWOX5转入农杆菌C58C1得到的重组菌，命名为含pDE003-TaWOX5的农杆菌C58C1。

采用同样的方法将空载体pDE003转入农杆菌C58C1得到的重组菌，命名为含pDE003的农杆菌C58C1。

3、农杆菌介导法转化小麦

详细步骤和方法参考Wang et al.,2016和Ishida et al.,2015，具体如下：

1)在侵染前4d，将含pDE003-TaWOX5的农杆菌C58C1和含pDE003的农杆菌C58C1分别接种于含Gent>-1、Spec>-1、Rif>-1的YEP固体培养基上，28℃黑暗条件下复苏培养3d。挑取单菌落于10ml含有Gent>-1、Spec50mg>-1、Rif>-1的YEP液体培养基中，200rpm、28℃黑暗条件下过夜震荡培养.

2)室温下3,500rpm离心10min收集农杆菌菌体，倒掉上清，用MS重悬液(1/10MS基本培养基(北京西美杰科技有限公司，货号：M519，glucose 10g>-1)重悬，得到含pDE003-TaWOX5的农杆菌C58C1重悬液和含pDE003的农杆菌C58C1重悬液。

3)选择适宜大小的不同品种小麦幼胚(大约开花后14天左右)等分为2份，分别与含pDE003-TaWOX5的农杆菌C58C1重悬液和含pDE003的农杆菌C58C1重悬液混合进行侵染，然后平铺于AS基本共培养基上(1/10MS基本培养基，glucose 10g>-1，agarose 8g>-1)，25℃培养3d。

4)将共培养后的幼胚转移至恢复培养基WLS-RES(MS基本培养基，2,4-D 0.5mg>-1,picloram 2.2mg>-1,Cb 400mg>-1、Cef 100mg>-1)黑暗下培养5d。

5)将恢复培养后的幼胚转移至第一次筛选培养基WLS-P5(MS基本培养基，2,4-D0.5mg>-1,picloram 2.2mg>-1,PPT 5mg>-1、Cb 400mg>-1、Cef 100mg>-1)黑暗下培养14d。

6)然后再将愈伤转移至第一次筛选培养基WLS-P10(MS基本培养基，2,4-D 0.5mgL^-1,picloram 2.2mg>-1,PPT 10mg>-1、Cb 400mg>-1)黑暗下培养21d。

7)将上述愈伤转移至分化培养基LSZ-P5(MS基本培养基、PPT 5mg>-1)，光下培养2周。

8)将小麦绿芽分离出来放置生根培养基MSF-P5(MS培养基，PPT 5mg>-1、IBA0.5mgL^-1),培养21d。

9)待根长好的幼苗移栽到土中，得到转pDE003-TaWOX5苗和转pDE003苗。

4、阳性苗鉴定

1)、PCR方法

利用Bar(pDE003载体上含有Bar基因)引物(F:ACCATCGTCAACCACTACATCG；R:GCTGCCAGAAACCACGTCATG)对转pDE003-TaWOX5苗进行PCR扩增。

结果如图4所示，M：5000bp DNA marker；CK为普通小麦Fielder；1-15：转pDE003-TaWOX5苗，可以看出，得到429bp片段为阳性转pDE003-TaWOX5苗。

对转pDE003苗进行PCR扩增，结果得到429bp片段为阳性转pDE003苗。

上述结果表明，转基因苗均为阳性。

2)、转化效率统计分析

转化效率＝(阳性苗/幼胚数)*％

结果如表1所示，与转空载体pDE003相比，转pDE003-TaWOX5载体可以使同一品种的小麦转化效率有大幅度提升，如：Fielder对照转化效率为45.3％，而转TaWOX5载体的转化效率高达154％；科农199对照转化效率为22.7％，转TaWOX5载体转化效率提高到近70％；以前转化率较低的品种济麦22、轮选987、杨麦16等，转TaWOX5载体的转化效率都提高到20％以上；此外，以前不能转化的品种矮抗58、京411及西农979，转TaWOX5载体的转化效率都可以达到10％以上。

由此可见，TaWOX5可以大大提高小麦的转化效率，解决小麦转化的基因型问题。

表1对照载体和TaWOX5载体转化效率比较

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120> 小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13202

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<221>（6734）…(6982）

<223>n=a或g或c或t

<400> 1

agtactttga tccaacccct ccgctgctat agtgcagtcg gcttctgacg ttcagtgcag 60

ccgtcttctg aaaacgacat gtcgcacaag tcctaagtta cgcgacaggc tgccgccctg 120

cccttttcct ggcgttttct tgtcgcgtgt tttagtcgca taaagtagaa tacttgcgac 180

tagaaccgga gacattacgc catgaacaag agcgccgccg ctggcctgct gggctatgcc 240

cgcgtcagca ccgacgacca ggacttgacc aaccaacggg ccgaactgca cgcggccggc 300

tgcaccaagc tgttttccga gaagatcacc ggcaccaggc gcgaccgccc ggagctggcc 360

aggatgcttg accacctacg ccctggcgac gttgtgacag tgaccaggct agaccgcctg 420

gcccgcagca cccgcgacct actggacatt gccgagcgca tccaggaggc cggcgcgggc 480

ctgcgtagcc tggcagagcc gtgggccgac accaccacgc cggccggccg catggtgttg 540

accgtgttcg ccggcattgc cgagttcgag cgttccctaa tcatcgaccg cacccggagc 600

gggcgcgagg ccgccaaggc ccgaggcgtg aagtttggcc cccgccctac cctcaccccg 660

gcacagatcg cgcacgcccg cgagctgatc gaccaggaag gccgcaccgt gaaagaggcg 720

gctgcactgc ttggcgtgca tcgctcgacc ctgtaccgcg cacttgagcg cagcgaggaa 780

gtgacgccca ccgaggccag gcggcgcggt gccttccgtg aggacgcatt gaccgaggcc 840

gacgccctgg cggccgccga gaatgaacgc caagaggaac aagcatgaaa ccgcaccagg 900

acggccagga cgaaccgttt ttcattaccg aagagatcga ggcggagatg atcgcggccg 960

ggtacgtgtt cgagccgccc gcgcacgtct caaccgtgcg gctgcatgaa atcctggccg 1020

gtttgtctga tgccaagctg gcggcctggc cggccagctt ggccgctgaa gaaaccgagc 1080

gccgccgtct aaaaaggtga tgtgtatttg agtaaaacag cttgcgtcat gcggtcgctg 1140

cgtatatgat gcgatgagta aataaacaaa tacgcaaggg gaacgcatga aggttatcgc 1200

tgtacttaac cagaaaggcg ggtcaggcaa gacgaccatc gcaacccatc tagcccgcgc 1260

cctgcaactc gccggggccg atgttctgtt agtcgattcc gatccccagg gcagtgcccg 1320

cgattgggcg gccgtgcggg aagatcaacc gctaaccgtt gtcggcatcg accgcccgac 1380

gattgaccgc gacgtgaagg ccatcggccg gcgcgacttc gtagtgatcg acggagcgcc 1440

ccaggcggcg gacttggctg tgtccgcgat caaggcagcc gacttcgtgc tgattccggt 1500

gcagccaagc ccttacgaca tatgggccac cgccgacctg gtggagctgg ttaagcagcg 1560

cattgaggtc acggatggaa ggctacaagc ggcctttgtc gtgtcgcggg cgatcaaagg 1620

cacgcgcatc ggcggtgagg ttgccgaggc gctggccggg tacgagctgc ccattcttga 1680

gtcccgtatc acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca caaccgttct 1740

tgaatcagaa cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa 1800

atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta 1860

agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac 1920

acgccagcca tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag 1980

atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt accgagctgc tatctgaata catcgcgcag 2040

ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg 2100

cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg 2160

aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg 2220

aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg 2280

gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc 2340

aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc 2400

gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg 2460

gcgacgagca accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc 2520

gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg 2580

tgatccgcta cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg 2640

ccagtgtgtg ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga 2700

accgataccg ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg 2760

acgtactcaa gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa 2820

cctgcattcg gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg 2880

gccgcctggt gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga 2940

gcgaaaccgg gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga 3000

tcacagaagg caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc 3060

ccggcatcgg ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca 3120

gatggttgtt caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct 3180

gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg 3240

aggcggggca ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag 3300

catccgccgg ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa 3360

aaggtcgaaa aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca 3420

ttgggaaccg gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca 3480

tgtaagtgac tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac 3540

ttattaaaac tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg 3600

aagagctgca aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc 3660

gtcggcctat cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac 3720

cagggcgcgg acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc 3780

tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg 3840

gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg 3900

ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat 3960

actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg 4020

aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc 4080

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 4140

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 4200

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 4260

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 4320

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 4380

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 4440

atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 4500

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 4560

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 4620

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 4680

ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 4740

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 4800

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 4860

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg catgatatat 4920

ctcccaattt gtgtagggct tattatgcac gcttaaaaat aataaaagca gacttgacct 4980

gatagtttgg ctgtgagcaa ttatgtgctt agtgcatcta atcgcttgag ttaacgccgg 5040

cgaagcggcg tcggcttgaa cgaatttcta gctagacatt atttgccgac taccttggtg 5100

atctcgcctt tcacgtagtg gacaaattct tccaactgat ctgcgcgcga ggccaagcga 5160

tcttcttctt gtccaagata agcctgtcta gcttcaagta tgacgggctg atactgggcc 5220

ggcaggcgct ccattgccca gtcggcagcg acatccttcg gcgcgatttt gccggttact 5280

gcgctgtacc aaatgcggga caacgtaagc actacatttc gctcatcgcc agcccagtcg 5340

ggcggcgagt tccatagcgt taaggtttca tttagcgcct caaatagatc ctgttcagga 5400

accggatcaa agagttcctc cgccgctgga cctaccaagg caacgctatg ttctcttgct 5460

tttgtcagca agatagccag atcaatgtcg atcgtggctg gctcgaagat acctgcaaga 5520

atgtcattgc gctgccattc tccaaattgc agttcgcgct tagctggata acgccacgga 5580

atgatgtcgt cgtgcacaac aatggtgact tctacagcgc ggagaatctc gctctctcca 5640

ggggaagccg aagtttccaa aaggtcgttg atcaaagctc gccgcgttgt ttcatcaagc 5700

cttacggtca ccgtaaccag caaatcaata tcactgtgtg gcttcaggcc gccatccact 5760

gcggagccgt acaaatgtac ggccagcaac gtcggttcga gatggcgctc gatgacgcca 5820

actacctctg atagttgagt cgatacttcg gcgatcaccg cttcccccat gatgtttaac 5880

tttgttttag ggcgactgcc ctgctgcgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacat 5940

cgacccacgg cgtaacgcgc ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg taccccaaaa 6000

aaacatgtca taacaagaag ccatgaaaac cgccactgcg ccgttaccac cgctgcgttc 6060

ggtcaaggtt ctggaccagt tgcgtgacgg cagttacgct acttgcatta cagcttacga 6120

accgaacgag gcttatgtcc actgggttcg tgcccgaatt gatcacaggc agcaacgctc 6180

tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttc aaacccggca 6240

gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc cgccttacaa 6300

cggctctccc gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt ggtgattttg 6360

tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg caggatatat tgtggtgtaa 6420

acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg tactgaatta 6480

acgccgaatt gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 6540

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 6600

atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 6660

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 6720

acgaattcga gctnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6780

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6840

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6900

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6960

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nngagctccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga 7020

taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg 7080

cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat 7140

tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg 7200

attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tctgcaggtc gacggatcag 7260

atctcggtga cgggcaggac cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag 7320

aaacccacgt catgccagtt cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg 7380

gcatatccga gcgcctcgtg catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg 7440

accacgctct tgaagccctg tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag 7500

cccagtcccg tccgctggtg gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg 7560

taggcgttgc gtgccttcca ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc 7620

tcggcgacga gccagggata gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc 7680

ggttcctgcg gctcggtacg gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg 7740

gtgcagaccg ccggcatgtc cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct 7800

gggctcatgg atcctctaga gtcgacctgc agaagtaaca ccaaacaaca gggtgagcat 7860

cgacaaaaga aacagtacca agcaaataaa tagcgtatga aggcagggct aaaaaaatcc 7920

acatatagct gctgcatatg ccatcatcca agtatatcaa gatcaaaata attataaaac 7980

atacttgttt attataatag ataggtactc aaggttagag catatgaata gatgctgcat 8040

atgccatcat gtatatgcat cagtaaaacc cacatcaaca tgtataccta tcctagatcg 8100

atatttccat ccatcttaaa ctcgtaacta tgaagatgta tgacacacac atacagttcc 8160

aaaattaata aatacaccag gtagtttgaa acagtattct actccgatct agaacgaatg 8220

aacgaccgcc caaccacacc acatcatcac aaccaagcga acaaaaagca tctctgtata 8280

tgcatcagta aaacccgcat caacatgtat acctatccta gatcgatatt tccatccatc 8340

atcttcaatt cgtaactatg aatatgtatg gcacacacat acagatccaa aattaataaa 8400

tccaccaggt agtttgaaac agaattaatt ctactccgat ctagaacgac cgcccaacca 8460

gaccacatca tcacaaccaa gacaaaaaaa agcatgaaaa gatgacccga caaacaagtg 8520

cacggcatat attgaaataa aggaaaaggg caaaccaaac cctatgcaac gaaacaaaaa 8580

aaatcatgaa atcgatcccg tctgcggaac ggctagagcc atcccaggat tccccaaaga 8640

gaaacactgg caagttagca atcagaacgt gtctgacgta caggtcgcat ccgtgtacga 8700

acgctagcag cacggatctn acacaaacac ggatctaaca caaacatgaa cagaagtaga 8760

ctaccgggcc ctaacatgga ccgaacgcga tctagagagt anagaggggg gggggggagg 8820

acgagcggcg taccttgaag cggaggtgcc gacgggtgga tttgggggag atctggtttg 8880

tgtgtgtgtg cgctccgaac aacacgaggt tggggaaaga gggtgtggag ggggtgtcta 8940

tttattacgg cgggcgagga agggaaagcg aaggagcggt gggaaaggaa tcccccgtag 9000

ctgccggtgc cgtgagagga ggaggaggcc gcctgccgtg ccggctcacg tctgccgctc 9060

cgccacgcaa tttctggatg ccgacagcgg agcaagtcca acggtggagc ggaactctcg 9120

agaggggtcc agaggcagcg acagagatgc cgtgccgtct gcttcgcttg gcccgacgcg 9180

acgctgctgg ttcgctggtt ggtgtccgtt agactcgtcg acggcgttta acaggctggc 9240

attatctact cgaaacaaga aaaatgtttc cttagttttt ttaatttctt aaagggtatt 9300

tgtttaattt ttagtcactt tattttattc tattttatat ctaaattatt aaataaaaaa 9360

actaaaatag agttttagtt ttcttaattt agaggctaaa atagaataaa atagatgtac 9420

taaaaaaatt agtctataaa aaccattaac cctaaaccct aaatggatgt actaataaaa 9480

tggatgaagt attatatagg tgaagctatt tgcaaaaaaa aaggagaaca catgcacact 9540

aaaaagataa aactgtagag tcctgttgtc aaaatactca attgtccttt agaccatgtc 9600

taactgttca tttatatgat tctctaaaac actgatatta ttgtagtact atagattata 9660

ttattcgtag agtaaagttt aaatatatgt ataaagatag ataaactgca cttcaaacaa 9720

gtgtgacaaa aaaaatatgt ggtaattttt tataacttag acatgcaatg ctcattatct 9780

ctagagaggg gcacgaccgg gtcacgctgc aaagctttgc agcgtgaccc ggtcgtgccc 9840

ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt 9900

tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct 9960

acgaataata taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg 10020

aacagttaga catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt 10080

atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac 10140

ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa 10200

tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct 10260

attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa 10320

attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag 10380

tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 10440

agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg 10500

acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 10560

gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc 10620

accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 10680

gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca 10740

cacacacaca aaccagatct cccccaaatc cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg 10800

ccgctcgtcc tccccccccc ccctctntac tctctagatc gcgttcggtc catgttaggg 10860

cccggtagtc tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtna gatccgtgct 10920

gctagcgttc gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc 10980

agtgtttctc tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt 11040

catgattttt tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat 11100

atgccgtgca cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg 11160

atgtggtctg gttgggcggt cgttctagat cggagtagaa ttaattctgt ttcaaactac 11220

ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa 11280

ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gcgggtttta 11340

ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg 11400

cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtgtattta 11460

ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt taagatggat 11520

ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat 11580

gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct attataataa 11640

acaagtatgt tttataatta ttttgatctt gatatacttg gatgatggca tatgcagcag 11700

ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc 11760

ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc aggtcgactc tagaggatcc 11820

cgggatggag gcgctgagcg ggcgggtggg agtgaagtgc gggcggtgga acccgacggc 11880

ggagcaggtg aaggtgctga cggagctgtt ccgggcgggg ctgcggacgc cgagcaccga 11940

gcagatccag cggatctcca cccacctcag cgccttcggc aaggtggaga gcaagaacgt 12000

cttctactgg ttccagaacc acaaggcccg cgagcgccac caccacaaga agcgccgccg 12060

cgtcgcatcc tgctcccccg acagcagcag caacgatgaa gagaccggcc gtgccgccgc 12120

cgccgagccc gccgacctcg tgctccagcc tcccgagagc aagcgggagg ccggaggcta 12180

caaccaccac ccccggatca tgacatgtaa gttagcagta gcacccatgt cgttgttcat 12240

acgtagagct tggtttgttc ctaatggaac agtatcctta gatcatcggc ccggtgctga 12300

tccatttggt gcgtgcatgc aggctatgtg agggaggtgg cggagcagga agaggcgacg 12360

acgtgggagc ggccgacgag ggaagtggag acgctggagc tgttcccgct caaagcagcc 12420

tgctacgacc tggagctgga ggcggacagg ttcagccggt atgtgaggag cggcgagcaa 12480

cagtgcaggg agatctcctt cttcgacgtg gccaccggac gggatccgcc gctggagctc 12540

aggctctgca gcttcgatcg gtatctggtc taaggtaccg agctgatcgt tcaaacattt 12600

ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat 12660

ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga 12720

gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa 12780

tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcgaa 12840

ttcaagcttg gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac 12900

ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc 12960

ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgag cttgagcttg 13020

gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt aaactatcag tgtttgacag gatatattgg 13080

cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataacg gatatttaaa agggcgtgaa 13140

aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg catgccaacc acagggttcc cctcgggatc 13200

aa13202

<210> 2

<211> 210

<212> PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Glu Ala Leu Ser Gly Arg Val Gly Val Lys Cys Gly Arg Trp Asn

1 5 1015

Pro Thr Ala Glu Gln Val Lys Val Leu Thr Glu Leu Phe Arg Ala Gly

202530

Leu Arg Thr Pro Ser Thr Glu Gln Ile Gln Arg Ile Ser Thr His Leu

354045

Ser Ala Phe Gly Lys Val Glu Ser Lys Asn Val Phe Tyr Trp Phe Gln

505560

Asn His Lys Ala Arg Glu Arg His His His Lys Lys Arg Arg Arg Val

65707580

Ala Ser Cys Ser Pro Asp Ser Ser Ser Asn Asp Glu Glu Thr Gly Arg

859095

Ala Ala Ala Ala Glu Pro Ala Asp Leu Val Leu Gln Pro Pro Glu Ser

100 105 110

Lys Arg Glu Ala Gly Gly Tyr Asn His His Pro Arg Ile Met Thr Cys

115 120 125

Tyr Val Arg Glu Val Ala Glu Gln Glu Glu Ala Thr Thr Trp Glu Arg

130 135 140

Pro Thr Arg Glu Val Glu Thr Leu Glu Leu Phe Pro Leu Lys Ala Ala

145 150 155 160

Cys Tyr Asp Leu Glu Leu Glu Ala Asp Arg Phe Ser Arg Tyr Val Arg

165 170 175

Ser Gly Glu Gln Gln Cys Arg Glu Ile Ser Phe Phe Asp Val Ala Thr

180 185 190

Gly Arg Asp Pro Pro Leu Glu Leu Arg Leu Cys Ser Phe Asp Arg Tyr

195 200 205

Leu Val

210