一种与植物结实率相关的磷酸盐转运蛋白LcPHT4;3及其应用

摘要

一种与植物结实率相关的磷酸盐转运蛋白LcPHT4;3及其应用。本发明提供了一种磷酸盐转运蛋白基因及其蛋白、cDNA序列，该基因来源于草原牧草植物羊草，利用所克隆到的cDNA序列，构建植物表达载体，转化野生型拟南芥，获得了转基因植物。转基因拟南芥表型观察发现，该磷酸盐转运蛋白基因参与了磷响应的信号通路，同时影响到植物的结实率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种磷酸盐转运蛋白。具体的说，本发明涉及到一种来源于典型草原牧草植物——羊草的编码磷酸盐转运蛋白的基因，命名为LcPHT4;3。本发明还涉及该基因编码的氨基酸序列，以及含有这类基因的载体，以及这类基因在结实率基因工程中的应用。

背景技术

羊草是牧草之王，营养丰富，适口性好，被誉为家畜“细粮”。同时，由于羊草的根具有极强的穿透侵占能力，并且能形成密集的根网结构，能很好的保持水土，有利于草原“三化”的治理，对草原生态保护具有重要的价值。但是，我国草原生产力与上世纪80年代相比下降 40％左右，90％以上草原发生退化。过度放牧是导致草原退化的主要因素之一。长期放牧干扰下，羊草的形态特征发生显著地变化，表现为羊草茎叶性状显著小型化，其中包括株高和个体地上生物量的降低。在自然生境中羊草无性繁殖占绝对优势，有性繁殖能力较弱，主要表现在三低问题：即结实率低、抽穗率低、种子萌发率低。结实率低对羊草的实际生产和应用带来很大的困难，也严重限制了我国天然草地的恢复改良。

利用生物技术对羊草磷酸盐转运蛋白基因进行研究，发现LcPHT4;3参与了羊草对放牧胁迫的响应以及磷响应的信号通路，同时影响到植物的结实率。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物结实率相关的蛋白LcPHT4;3及其编码基因与应用。

本发明所提供的LcPHT4;3来源于羊草(Leymus chinensis(Trin.)Tzvel.)，是磷酸盐转运蛋白家族中的一员，其核苷酸序列和氨基酸序列见SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；或者是将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸的取代、缺失或者添加且具有与序列表中的蛋白质相同活性的由序列衍生的蛋白质序列。表中氨基酸残基序列是由516个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量约55.68KD，等电点10.20，基因全长2197bp，拥有SEQID NO： 1所示的全长cDNA序列，包括完整读码框1548bp和45bp的5′及605bp的3′UTR区。

本发明还提供了一种分离的多核苷酸在促进植物结实率基因工程中的应用，其中所述多核苷酸的序列如SEQ ID No：1所示。其中，植物优选为拟南芥。

附图说明

图1：过度放牧下LcPHT4;3基因表达量的检测；

图2：不同非生物胁迫处理下LcPHT4;3基因表达量的检测；

图3：磷胁迫处理条件下LcPHT4;3-OE与拟南芥(Col-0)种子量比较，OE代表不同的转基因株系。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的实验步骤进行详细说明：

实施例1.羊草LcPHT4;3基因的克隆

取羊草一个月苗龄植株用于试验，剪取地上部分组织置于1.5mL离心管中，液氮速冻，保存于-80℃超低温冰箱中备用。利用植物RNA提取试剂盒(TaKaRa，Cat#9769)和反转录试剂盒(TaKaRa，Cat#RR047A)对植物样品进行RNA的提取和反转录合成cDNA。以全长引物LcPHT4;3-F/R为引物，以cDNA为模板进行PCR扩增。

LcPHT4;3-F：CGCCTCCCTCGTCGACAGACGGCGGAGAAAACA；

LcPHT4;3-R：ATTCGAGCTCACTAGTCATATGTCCTCTTTGGCG。

PCR反应体系(50μL)：

PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸100s，30个循环；72℃补充延伸10min；16℃保存。

1％琼脂糖凝胶，100V，60mA电泳30-45min检测目的条带。

实施例2.LcPHT4;3基因在过度放牧及非生物胁迫条件下的表达模式

在锡林郭勒盟中科院定位站(采样地点)收集过度放牧样地和围封样地的羊草地上部分组织(图1)，放入冻存管中，迅速放入液氮中冻存，放-80℃超低温冰箱冻藏备用。

将羊草一个月苗龄植株进行4℃冷处理、100μmol/L MeJA、高pH(pH10)、机械损伤(Wounding)、100μmol/L ABA、干旱、42℃热处理、300mmol/L氯化钠等不同胁迫处理(图 2)，在0、0.5、1、3、6、12、24、48h时间点取样，液氮冻存，-80℃冰箱保存备用。

利用植物RNA提取试剂盒(TaKaRa，Cat#9769)和反转录试剂盒(TaKaRa，Cat#RR047A) 对植物样品进行RNA的提取和反转录合成cDNA。根据实时荧光定量PCR(qRT-PCR)引物的设计原则，采用软件Primer 5.0对LcPHT4;3设计qRT-PCR引物，

LcPHT4;3-qF：TGGTTTGAAGTCCTTTGGTCAC；

LcPHT4;3-qR：CGTGTTTGCCATTCCGTGTAGC。

利用Roche LightCycler 480Real-Time PCR System进行表达量检测。qRT-PCR反应体系 (20μL)为：

qRT-PCR扩增程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸15s，40个循环。

以LcEF1α为内参，实验数据利用2^-ΔΔCT法计算相对表达量。

实施例3.转LcPHT4;3基因拟南芥的获得及结实率比较

将上述实施例1中提取反转录得到的cDNA，利用引物加15bp载体序列的引物，采用全式金HiFi DNA聚合酶扩增得到的LcPHT4;3，Clontech公司的In-Fusion试剂盒通过基因重组将目的基因连入带有35S的强启动子的植物表达载体pCanG中，得到双元表达载体。经酶切验证无误后，转入根癌农杆菌，提质粒经过PCR、酶切鉴定正确后，采用蘸花法转入拟南芥 (Col-0)，通过卡那霉素抗性筛选转基因纯合植株。

将转LcPHT4;3基因拟南芥纯合植株与拟南芥(Col-0)进行25mmol/L的磷浓度处理(图 3)，并对磷胁迫处理条件下转基因株系LcPHT4;3-OE与拟南芥(Col-0)WT种子量进行了比较(参见表1)，统计结实率发现：正常培养的不同株系种子的结实率差不多，但在磷浓度处理后转基因株系比野生型增加约一倍。

表1.磷胁迫处理条件下与正常条件下单钵种子的重量比较

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许改动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 申请人

<120> 一种与植物结实率相关的磷酸盐转运蛋白LcPHT4;3及其应用

<130> 一种与植物结实率相关的磷酸盐转运蛋白LcPHT4;3及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2197

<212> cDNA

<213> 羊草（Leymus chinensis （Trin.） Tzvel.）

<400> 1

cttccactcc ggcagagcgc acccagacgg cggagaaaac aaaccatggc ccctcccggc 60

caactgctcc ccttgacccg ctcgcttctg cctccctccg ctcccccctt cctctccggc 120

cgccgtcgcc tgcctcctcc cgcccgcgct caaacctcgc ctccgcttcc atggcagccc 180

caccgcctcc agtgtccttc tcccctccag ccgctccgcc ctctcgccag gaacaggacc 240

cttcccgttg ctgcgcctcc tggggcctcc gccgccggcg gaggcgatac gcaggctctg 300

gcggcggagt tcatgacgtc tgagagggtg aaggtggcgg cgatgctggg gctggccctc 360

gcgctctgca acgccgaccg cgtggtcatg tccgtggcca tcgtcccgct ctcccaggcg 420

tatggatgga ccccgtcctt cgccggcgtc gtgcagtcat ccttcctttg gggatatctg 480

atatcaccta taatcggtgg agcgcttgtt gactactacg gtgggaagcg agtcatggcg 540

tatggtgtgg ctttatggtc cttcgctaca ttcctttccc cttgggcagc tgctcgctca 600

ctgtggttgt tcatctcaac tagaattctg ctcggtgttg cagaaggagt ggcattgcca 660

tgtatgaaca atatggtgct gaggtggttt cctcgtactg aacgatctag tgctgtgggg 720

atcgcgatgg ctggctttca gcttggaaat acgatcggct tacttctttc ccctattatc 780

atgtcacgaa ctggaacatt tggacccttt gtgatttttg gtttgtttgg atttctgtgg 840

gtgctggtgt ggatatctgc tataacagga actcctggtg aacatcctca aatatcagca 900

tatgaactag agtatataac aaagggtcag aaattggtga aacctcaagt tcaaggtgaa 960

aaactaagaa agatccctcc gtttagaaac ctactttcta aatggccgac ctgggcttta 1020

atatctgcaa atgctatgca tagctggggc tatttcgtca tcctttcatg gatgccagtg 1080

tatttcaaaa ctatatttca tgtcaatctg agagaagctg catggtttag tgcaattccc 1140

tgggtcatga tggcagtttt aggctatgtg gctggtgttg tatcagacgc acttatccga 1200

aatggcacaa gcattacttt aactcggaag ataatgcaga caattggctt tgtgggtcct 1260

ggtattgctc ttattggttt aaatgcagca aagagtccag ccattgcttc agcttggcta 1320

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atcgccccac aatatgccgg agtgctacac ggaatggcaa acacggccgg aacatttgct 1440

gccatcttag gaactattgg agcaggattc tttgttgatc ggatgggttc tttccgtgga 1500

tttttaacat taacatcact tctatatttc agcagtgctc tgttctggga tatctttgct 1560

actggagagc gtgttgattt tgatggcact aactagcgcc aaagaggaca tatgcaatgc 1620

atatcctaga acataaaacc tcatgatttg atgattcacg ggagaatact gtgccatcat 1680

catttgggat agtacccaaa agttccatga agcagagatg agcagtagag ttctgacaca 1740

tccagactac aagattgtgt gcttcaagaa gtatgtggtg agttgtctta ttgtggaagc 1800

agagtacccg acatggataa tggatttagc tacttggatc acgtgagttc ttctgcacaa 1860

gttcgaaatg tgaatgtaaa gagtcaagga tacctgaagt atatcagaga ataaatagca 1920

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aattgccagg gtagttgaaa gcttgatcta gcatagtttg gtgaggcaag agttgacctt 2040

gtttaaaatg gctagtagat gtactgccat ttactgtcat gattagtgaa aaggtgagac 2100

caggaactca aacaaagagg ggggcctgtt gggggtgtaa agatacagaa ttctctgttg 2160

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<210> 2

<211> 516

<212> PRT

<213> 羊草（Leymus chinensis （Trin.） Tzvel.）

<400> 2

Met Ala Pro Pro Gly Gln Leu Leu Pro Leu Thr Arg Ser Leu Leu Pro

1 5 1015

Pro Ser Ala Pro Pro Phe Leu Ser Gly Arg Arg Arg Leu Pro Pro Pro

202530

Ala Arg Ala Gln Thr Ser Pro Pro Leu Pro Trp Gln Pro His Arg Leu

354045

Gln Cys Pro Ser Pro Leu Gln Pro Leu Arg Pro Leu Ala Arg Asn Arg

505560

Thr Leu Pro Val Ala Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Ala Gly Gly Gly

65707580

Asp Thr Gln Ala Leu Ala Ala Glu Phe Met Thr Ser Glu Arg Val Lys

859095

Val Ala Ala Met Leu Gly Leu Ala Leu Ala Leu Cys Asn Ala Asp Arg

100 105 110

Val Val Met Ser Val Ala Ile Val Pro Leu Ser Gln Ala Tyr Gly Trp

115 120 125

Thr Pro Ser Phe Ala Gly Val Val Gln Ser Ser Phe Leu Trp Gly Tyr

130 135 140

Leu Ile Ser Pro Ile Ile Gly Gly Ala Leu Val Asp Tyr Tyr Gly Gly

145 150 155 160

Lys Arg Val Met Ala Tyr Gly Val Ala Leu Trp Ser Phe Ala Thr Phe

165 170 175

Leu Ser Pro Trp Ala Ala Ala Arg Ser Leu Trp Leu Phe Ile Ser Thr

180 185 190

Arg Ile Leu Leu Gly Val Ala Glu Gly Val Ala Leu Pro Cys Met Asn

195 200 205

Asn Met Val Leu Arg Trp Phe Pro Arg Thr Glu Arg Ser Ser Ala Val

210 215 220

Gly Ile Ala Met Ala Gly Phe Gln Leu Gly Asn Thr Ile Gly Leu Leu

225 230 235 240

Leu Ser Pro Ile Ile Met Ser Arg Thr Gly Thr Phe Gly Pro Phe Val

245 250 255

Ile Phe Gly Leu Phe Gly Phe Leu Trp Val Leu Val Trp Ile Ser Ala

260 265 270

Ile Thr Gly Thr Pro Gly Glu His Pro Gln Ile Ser Ala Tyr Glu Leu

275 280 285

Glu Tyr Ile Thr Lys Gly Gln Lys Leu Val Lys Pro Gln Val Gln Gly

290 295 300

Glu Lys Leu Arg Lys Ile Pro Pro Phe Arg Asn Leu Leu Ser Lys Trp

305 310 315 320

Pro Thr Trp Ala Leu Ile Ser Ala Asn Ala Met His Ser Trp Gly Tyr

325 330 335

Phe Val Ile Leu Ser Trp Met Pro Val Tyr Phe Lys Thr Ile Phe His

340 345 350

Val Asn Leu Arg Glu Ala Ala Trp Phe Ser Ala Ile Pro Trp Val Met

355 360 365

Met Ala Val Leu Gly Tyr Val Ala Gly Val Val Ser Asp Ala Leu Ile

370 375 380

Arg Asn Gly Thr Ser Ile Thr Leu Thr Arg Lys Ile Met Gln Thr Ile

385 390 395 400

Gly Phe Val Gly Pro Gly Ile Ala Leu Ile Gly Leu Asn Ala Ala Lys

405 410 415

Ser Pro Ala Ile Ala Ser Ala Trp Leu Thr Ile Ala Val Gly Leu Lys

420 425 430

Ser Phe Gly His Ser Gly Phe Leu Val Asn Phe Gln Glu Ile Ala Pro

435 440 445

Gln Tyr Ala Gly Val Leu His Gly Met Ala Asn Thr Ala Gly Thr Phe

450 455 460

Ala Ala Ile Leu Gly Thr Ile Gly Ala Gly Phe Phe Val Asp Arg Met

465 470 475 480

Gly Ser Phe Arg Gly Phe Leu Thr Leu Thr Ser Leu Leu Tyr Phe Ser

485 490 495

Ser Ala Leu Phe Trp Asp Ile Phe Ala Thr Gly Glu Arg Val Asp Phe

500 505 510

Asp Gly Thr Asn

515