SAG在制备治疗发育期缺氧缺血脑损伤疾病的药物中的应用

摘要

本发明公开了SAG在制备治疗发育期缺氧缺血脑损伤疾病的药物中的应用。实验表明，在新生大鼠缺氧缺血后2小时腹腔注射5～25mg/kg SAG均可减轻脑梗死；给与15mg/kg SAG后进一步研究发现，SAG可明显改善脑损伤，减轻缺氧缺血后神经细胞崩解、坏死。Morris水迷宫实验显示，给与15mg/kg SAG可有效改善缺氧缺血大鼠的学习能力。进一步研究显示，SAG中剂量实验组大鼠(15mg/kg SAG)的2,3,5‑氯化三苯基四氮唑阳性细胞明显减少，大脑皮质IL‑1β、TNF‑αmRNA减少，胶质纤维酸性蛋白的表达减少。

说明书

技术领域

本发明涉及Smoothened Agonist(简称SAG)的用途，尤其是在制药中的用途。

背景技术

缺氧缺血脑损伤(hypoxic-ischemic encephalopathy,简称HIE)是新生儿常见的神经系统疾病，可导致癫痫、脑瘫、生长发育迟滞等，给社会和家庭带来沉重负担。尽管经过几十年的研究，但HIE的发病机制仍不完全清楚，临床缺乏有效治疗手段，因此积极探寻HIE的干预和治疗手段具有重要和积极意义。临床上现有的治疗手段非常有限，主要是亚低温和对症支持治疗。

Smoothened Agonist(简称SAG)是小分子合成物质，分子式为C₂₈H₂₉C_l2N₃OS，分子量>

SAG现在主要用于唐氏综合症、脑卒中、糖皮质激素对新生儿小脑损伤治疗的研究。

发明内容

本发明的目的在于证明SAG的新用途，即在制药中的新用途，为治疗发育期缺氧缺血脑损伤疾病提供新的药品。

本发明通过实验证明：在新生大鼠缺氧缺血后2小时腹腔注射5～25mg/kg SAG均可减轻脑梗死。给与15mg/kg SAG后进一步研究发现，苏木素-伊红(hematoxylin andeosin,H&E) 染色显示SAG可明显改善脑损伤，减轻缺氧缺血后神经细胞崩解、坏死。Morris水迷宫实验显示，SAG中剂量实验组(15mg/kg)在第1-4天游泳平均时间与溶剂对照组比较，无明显差异；然而在第5、6天SAG中剂量实验组的大鼠游泳过程中平均潜伏期明显缩短，差异具有统计学意义，说明SAG中剂量可有效改善缺氧缺血大鼠的学习能力。进一步研究显示，SAG 中剂量实验组大鼠的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazouliumtydrochloride, TUNEL)阳性细胞明显减少，说明凋亡减轻。大脑皮质IL-1β、TNF-αmRNA减少，免疫荧光显示胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达减少。因此，可将SAG 作为治疗发育期缺氧缺血脑损伤疾病的药品。

本发明具有以下有益结果：

1、本发明对已知的小分子合成物质SAG发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。

2、本发明为新生儿缺氧缺血脑病的治疗提供一种有效的新药品，具有明显的社会效益和经济效益。

附图说明

图1是建模48小时TTC检测实验大鼠的脑梗死结果照片，图中，HI为溶剂对照组，HI-1为SAG高剂量实验组，HI-2为SAG中剂量实验组,HI-3为SAG低剂量实验组。

图2是实验动物的状态照片，图中，HI为溶剂对照组，HI-1为SAG高剂量实验组，HI-2 为SAG中剂量实验组,HI-3为SAG低剂量实验组。

图3是Morris水迷宫实验中，实验大鼠训练天数与潜伏期时间的变化曲线图，图中， HI为溶剂对照组，HI-2为SAG中剂量实验组。

图4是Morris水迷宫实验中，实验大鼠穿越平台次数图，图中，HI为溶剂对照组，HI-2 为SAG中剂量实验组。

图5是H&E染色观察实验大鼠脑组织病理改变的照片，图中，HI为溶剂对照组，HI-2为SAG中剂量实验组。

图6是TUNEL染色检测实验大鼠建模12小时、24小时、48小时细胞凋亡的照片，图中，HI为溶剂对照组，HI-2为SAG中剂量实验组。

图7是免疫荧光检测建模后7天即生后14天实验大鼠的GFAP表达情况图，图中，HI为溶剂对照组，HI-2为SAG中剂量实验组。

具体实施方式

1、实验材料与试剂

1.1、实验动物

健康清洁级7日龄新生SD大鼠，雌雄不限，体重14-22克，购自成都达硕实验动物有限公司。实验分为两部分，第一部分确定适合的SAG浓度。随机分为假手术组，溶剂对照组，SAG高剂量实验组(25mg/kg)，SAG中剂量实验组(15mg/kg)，SAG低剂量实验组(5mg/kg)，每组12只SD大鼠。溶剂对照组和SAG高剂量实验组、SAG中剂量实验组、SAG低剂量实验组在建模后2小时分别腹腔注入溶剂(双蒸水)或相应浓度的SAG。根据TTC和H&E 染色结果确定SAG适合剂量组。第二部分将随机分为假手术组、溶剂对照组、SAG中剂量组(15mg/kg)，每组45只SD大鼠。取缺氧缺血后12小时、24小时、48小时行TUNEL检测细胞凋亡情况。缺氧缺血后24小时，荧光定量PCR检测Gli1、TNF-α,IL-1β的表达。取缺氧缺血后7天脑组织，用于免疫荧光检测GFAP表达。取建模后24小时、48小时及7天的脑组织采用H&E染色观察光镜下组织损伤情况。建模后21天即大鼠生后28天Morris水迷宫实验。

1.2、主要试剂

SAG(Selleck，美国)，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma，美国)，小鼠抗鼠β-actin 抗体(成都正能生物技术公司)；辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体和辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体(成都正能生物技术公司)；小鼠抗大鼠GFAP单抗(Millipore，美国)，Cy3 标记驴抗小鼠二抗(Jackson)，BCA蛋白定量检测试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)； DAPI染液(Beyotime)，叠氮钠(Solarbio)，琼脂糖(OXOID)，抗荧光淬灭封片剂(Solarbio)；牛血清白蛋白(Gibco)，新鲜胎牛血清(Gibco)，Triton-x-100(Solarbio)；异丙醇，苯酚，氯仿，无水酒精，DEPC(Sigma)，TRIzol(Invitrogen，15596-026)； qPRC Green Master Mix试剂盒(Vazyme)。引物由上海生工公司合成。

2、实验方法

2.1、实验动物模型建立

溶剂对照组和SAG高剂量实验组、SAG中剂量实验组、SAG低剂量实验组的7日龄新生SD大鼠经异氟烷麻醉后，仰卧位固定，质量浓度75％酒精消毒颈部皮肤，颈正中一切口，暴露并结扎左侧颈总动脉上下端，双节之间离断，缝合皮肤切口，再次局部消毒。术后置于37℃加热垫复温1小时，1小时后将大鼠放入缺氧舱。设置缺氧舱氧气工作浓度，使缺氧舱内氧气维持于(8.0±0.1)v.％，6v.％氧气和94v.％氮气的低氧混合气1～2L/min往缺氧舱通气，以氧气浓度稳定维持在设定温度为计时起点，低氧通气2.5小时。假手术组仅分离左侧颈总动脉，不结扎，再消毒缝合切口，不进行低氧通气。

2.2、石蜡切片标本制备

2.2.1标本固定

用医用注射器抽取生理盐水和质量浓度4％多聚甲醛各50ml，连接头皮针备用。新生大鼠用异氟烷麻醉后仰卧位固定，剪开胸腔暴露心脏。剪开右心耳，并将连接50ml生理盐水注射器的头皮针从心尖刺入左心室，匀速推注生理盐水以冲洗血液至流出液清亮。然后心脏推注质量浓度4％多聚甲醛，大鼠四肢完全僵直后，开颅取脑。取出的脑组织固定于质量浓度4％多聚甲醛中，放置于4℃冰箱约36-48h。

2.2.2取材

根据大鼠脑立体定位图谱第三版，将固定好的新生大鼠鼠脑以前囟视交叉为起点，冠状位切除前面的不需要的脑组织，向后约5mm冠状切除后面的脑组织，保留中间部位的组织，并置于水中15min，中间换水3-4次。

2.2.3脱水、透明及石腊包埋

60℃浸蜡1.5h×2次，石蜡包埋。

2.2.4石蜡切片制备

将标本蜡块从视交叉开始连续冠状切片(厚度5μm)，切片包括皮层和海马，贴于防脱载玻片上，60℃烤箱烤片6h。

2.3、H&E染色

2.3.1石蜡切片脱蜡至水

2.3.2苏木素染色5min

2.3.3倒掉苏木素，流水冲洗5sec

2.3.4质量浓度1％盐酸酒精分化20～30sec，流水略加冲洗5sec

2.3.5质量浓度0.1～0.5％伊红染液染色1min，流水冲洗2min

2.3.6梯度酒精脱水

2.3.7滴加中性树胶，加盖玻片封片，镜检。

2.4、TTC染色及分析

2.4.1标本制备

a)7日龄SD新生大鼠造模后48h，异氟烷麻醉后处死取脑。

b)取一小皿加入PBS并提前至于冰水混合物上预冷，将脑组织置入该小皿中(该小皿提前置于冰水混合物上预冷)

c)以视交叉为起点，冠状位向后连续切片，切片厚度为2mm

d)将切片置于现配的质量浓度2％TTC溶液中，37℃避光孵育20min，间隔5min翻动脑片以利于均匀染色

e)吸去TTC溶液，加入质量浓度4％多聚甲醛固定24h后拍照分析

2.4.2梗死面积分析

采用间接法计算梗死面积，即左侧梗死面积(LI)＝右侧大脑面积(RT)－左侧未梗死面积(LN)。梗死体积比值＝∑(LI×脑片厚度)/∑(RT×脑片厚度)×100％[13]。

2.5、TUNEL实验

2.5.1挑选震荡切片制备的脑组织切片于24孔板中，PBS洗5min×3次。

2.5.2按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒操作步骤进行：

a)在含质量浓度0.1％Triton X-100的质量浓度0.1％柠檬酸钠的溶液中冰上作用5min

b)PBS洗5min×3次

c)每张片子滴加50ul TUNEL反应液，37℃孵育1h，PBS洗5min×3次。

2.5.3加入DAPI室温孵育5min，PBS洗5min×3次。

2.5.4滴加抗荧光淬灭剂，封片，在激光共聚焦显微镜观察结果，每个标本观察5张脑组织切片，每张脑组织切片随机选取4个视野，计数凋亡细胞，计算凋亡指数＝(凋亡细胞/总细胞数)×100％。

2.6、免疫荧光测定GFAP

2.6.1震荡切片制备

(1)造模后24h，取各组脑组织，脑组织固定、取材同第一部分HE染色。

(2)用PBS洗3次固定后的脑组织。

(3)往包埋模框中注入适当厚度的质量浓度为2.5％的琼脂糖。

(4)将脑组织放入包埋模框，继续填入琼脂糖以没过组织，并调整脑组织位置。

(5)琼脂糖完全凝固后，取出并修理琼脂糖模块。

(6)安装刀架和刀片，用胶水将组织块固定到震荡切片机的托盘上。

(7)切片槽中加入PBS液，需没过组织块，切片槽周围加适量冰块。

(8)设置厚度为40μm，挑出需要的脑片置于已加入质量浓度0.04％叠氮钠PBS溶液的6 孔板中，4℃保存备用。

2.6.2免疫荧光染色

(1)挑选合适的脑片，置于24孔板中，每孔加入500ul PBS洗5min×3次；

(2)每孔加入含质量浓度0.3％Triton-x-100的PBS溶液200ul，穿膜30min；

(3)每孔加入封闭液200ul，室温封闭1小时；

(4)吸出封闭液，滴加相应的封闭液稀释一抗GFAP(Millipore，1:500)4℃过夜；

(5)吸出一抗，每孔加入500ul PBS洗5min×3次；

(6)滴加Cy3标记的驴抗兔二抗(1:500)和488标记的驴抗鼠二抗(1：500)，置于湿盒内，室温避光孵育2小时；

(7)吸出二抗，每孔加入500ul PBS洗5min×3次；

(8)用PBS按照1：500稀释DAPI，每孔加入稀释后的DAPI 200ul，避光孵育5min；

(9)PBS洗5min×2次；

(10)挑片平铺于粘附载玻片上，滴加适量抗荧光淬灭剂，封片；

(11)激光共聚焦显微镜观察结果。

2.7、荧光定量PCR检测Gli1,IL-1β,TNF-αmRNA表达

2.7.1总RNA的提取

(1)建模后12小时，异氟烷吸入麻醉后处死动物，断头取脑，取结扎侧大脑皮质1mLTrizol 试剂，超声粉碎组织至完全裂解，室温静置10min。

(2)每个EP管中分别加入200μl氯仿，剧烈混匀，静置5min。

(3)将EP管转移到预冷的低温离心机中，4℃12000g离心15min。

(4)小心吸取上清(约500μl)，与等体积异丙醇混合，轻轻颠倒混匀，静置10分钟后，将混合液吸入吸附柱中。12000g离心1min，弃滤液。

(5)加入600μlRNA洗液，12000g离心45s，弃滤液。

(6)准备DNA酶孵育液：

(7)在吸附膜中央加入50μl孵育液，室温放置15min。

(8)加入600μl洗液，12000g离心45s，弃滤液。

(9)加入600μl洗液，12000g离心45s，弃滤液。将离心柱重新安置于收集管上，12000g 离心2min。

(10)离心柱转移至洗脱管上，加入50μl无核酸酶水，室温静置2min,12000g离心1min，将RNA保存-80℃备用。

2.7.2 RNA逆转录为cDNA

按照Vazyme逆转录试剂盒说明书进行逆转录。先去除基因组DNA(具体见表1)。再配制逆转录反应体系(表2)，进行逆转录反应(表3)。反应产物可立即用于PCR，或在-20℃保存备用。

表1基因组DNA去除混合液配制

表2逆转录反应体系

表3逆转录反应标准程序

2.7.3引物设计与合成

所用引物均由上海生工公司合成。3000rpm离心2min后加入引物合成说明书中指定体积 ddH₂O，稀释引物至10μM，4℃保存备用。引物序列如下：

1)IL-1β引物序列：5’-ATGGGCTCCCTCTCATCAGT-3’(sense)

5’-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3’(anti-sense)

2)TNF-α引物序列：5’-GCTTCCTTGTGCAAGTGTCT-3’(sense)

5’-TCTGGACAGCCCAAGTCAAG-3’(anti-sense)

3)GADPH引物序列：5’-AGTGCCAGCCTCGTCTCATA-3’(sense)

5’-GAGAAGGCAGCCCTGGTAAC3’(anti-sense)

2.7.4荧光定量PCR

使用 qPRC Green Master Mix试剂盒，按试剂说明书操作。反应液及反应条件设置见表4及表5。

表4 qPCR反应液的配制

表5 PCR反应条件设置(两步法)

2.8、Morris水迷宫

2.8.1根据TTC和H&E染色结果确定SAG适合剂量组，进一步进行Morris水迷宫实验。

2.8.2假手术组，溶剂对照组，SAG中剂量实验组三组各取15只，于生后28天开始进行 Morris水迷宫试验，试验期为7天。

2.8.3水迷宫水深32cm，水温保持在25±1℃。水池分为I、II、III、IV四个象限，在第I象限正中距离池壁25cm处放置平台，平台顶低于水面2cm。将食用增白剂放入水中混匀以掩盖平台位置。实验人员、实验环境、实验平台位置及水池周围参照物在每次实验时均保持不变。实验前用苦味酸标记大鼠头部以便于摄像头追踪大鼠。

2.8.4定位航行试验

每日上午训练每只大鼠1次，连续6天。操作者将大鼠面向池壁，从第I象限开始，依次从4个象限固定放置点轻柔放置大鼠入水。每次大鼠入水后在水中游泳120s，成功找到平台者，逃避潜伏期时间为大鼠找到平台的时间；如120s内不能找到平台，则帮助其找到平台，并在平台上休息30s，此时逃避潜伏期时间记录为120s。记录大鼠找到平台的时间，4个象限潜伏期时间的平均值作为每日最终成绩进入统计。6天潜伏期成绩的平均值即平均逃避潜伏期，用于检测大鼠空间学习及记忆能力。

2.8.5空间探索试验

完成定位航行试验后，在第7天进行测试。撤去平台，电脑软件于原平台位置设置虚拟平台，大鼠从第III象限入水，计算机机追踪系统记录整个实验过程，应用系统软件进行视频记录及数据分析。观察120s内大鼠穿越虚拟平台的次数，检测大鼠空间记忆能力。

3、实验结果

3.1、不同浓度SAG对新生大鼠缺氧缺血脑病的作用

TTC结果显示：建模后48小时，处死动物取脑做TTC检测。SAG高剂量实验组(25mg/kg)， SAG中剂量实验组(15mg/kg)，SAG低剂量实验组(5mg/kg)，未见明显梗死灶，SAG低剂量实验组大鼠可见少许梗死灶，较溶剂对照组明显减轻(图1)，三个实验组(分别即为 HI-SAG25、HI-SAG15、HI-SAG5)组与溶剂对照组(记为HI)相比均有统计学差异(见表6)。

表6 TTC检测梗死面积结果

P<0.05，三个实验组与HI组比较

3.2、实验动物一般情况及体重变化

溶剂对照组(HI组)动物表现为反复刻板运动，有强直性抽搐，震颤，反应低下等表现。 SAG高剂量实验组(HI-SAG 25)、SAG中剂量实验组(HI-SAG 15)动物活动能力强，无抽搐，未见刻板运动，反应好。SAG低剂量实验组(HI-SAG 5)部分动物出现反应低下，刻板运动，但无抽搐。

建模后7天即生后14天测量各组动物体重。SAG高剂量实验组(HI-SAG 25)动物体重减轻，出现毛稀疏，较假手术组比较，具有统计学差异。SAG中剂量实验组(HI-SAG 15) 及SAG低剂量实验组(HI-SAG 5)毛色顺滑，体重增长可，较假手术组无明显改变(见图2，表7)。由于SAG高剂量实验组出现体重明显减轻，毛发稀疏，考虑与SAG副作用有关，因此在选用SAG中剂量实验组进一步研究。

表7建模后7天体重

P<0.05，HI-SAG25与假手术组比较

3.3、Morris水迷宫结果

与溶剂对照组(HI)相比，SAG中剂量实验组(HI-SAG 15)大鼠在第1-4天游泳平均时间无明显差异，在第5、6天游泳过程中平均潜伏期明显缩短，差异具有统计学意义(图3)。三个组平台穿越次数比较无统计学差异(图4)。

3.4、H&E染色结果

溶剂对照组(HI)建模后24小时，可见动物皮层细胞排列紊乱，结构不清，神经元出现胞体肿胀，气球样变，胞浆稀疏，核浆比例异常，核固缩变圆；而SAG中剂量实验组(HI-SAG15)建模后24小时动物神经元细胞形态大致正常，未见明显的细胞肿胀，可见较多淋巴细胞浸润。溶剂对照组(HI)建模后48小时，可见动物细胞损伤程度加重，细胞溶解缺失明显，而SAG中剂量实验组(HI-SAG 15)建模后48小时动物神经元细胞形态大致正常，仅见少许淋巴细胞浸润。溶剂对照组(HI)建模后7天，可见动物胶质细胞增多，瘢痕形成； SAG中剂量实验组(HI-SAG 15)建模后7天，动物未见明显胶质瘢痕形成，细胞形态正常 (见图5)。实验结果表明，15mg/kg的SAG可明显改善脑损伤。

3.5、TNF-α、IL-1βmRNA检测结果

SAG中剂量实验组(HI-SAG 15)大脑皮质IL-1β，TNF-αmRNA减少，较溶剂对照组(HI)有统计学差异(p<0.05)，表明SAG可减轻炎症反应(表8)。

表8 TNF-α、IL-1βmRNA检测结果

P<0.05，HI-SAG15与HI组比较

3.6、TUNEL检测凋亡结果

建模12h、24小时、48小时后，灌注取脑，震荡切片，TUNEL染色激光共聚焦显微镜下检测细胞凋亡指数。结果显示，在建模后12小时，两个组均可见细胞凋亡，其中溶剂对照组(HI)的凋亡指数60.7±2.13％，SAG中剂量实验组(HI-SAG 15)的凋亡指数22.5±1.80％，表明HI组较HI-SAG 15组细胞凋亡多，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

在建模后24小时，两个组的凋亡细胞较12小时减少，溶剂对照组(HI)的凋亡指数35.4±2.79％，SAG中剂量实验组(HI-SAG 15)的凋亡指数7.60±1.76％，表明HI组仍较HI-SAG 15组细胞凋亡明显增多，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

在建模后48小时，HI-SAG15组凋亡细胞明显减少(2.9±1.17％)，仅可见少许散在的 TUNEL阳性细胞，而HI组细胞凋亡较24小时无明显变化(34.7±1.53％)，见图6、表9。

表9 TUNEL结果

P<0.05，HI-SAG15与HI组比较

3.7、免疫荧光检测星形胶质细胞活化结果

在建模后7天即生后14天将假手术组(Sham)、溶剂对照组(HI)和SAG中剂量实验组(HI-SAG 15)实验动物断头取脑组织固定，震荡切片，免疫荧光染色检测星形胶质细胞活化标志即GFAP表达情况。结果显示SAG中剂量实验组(HI-SAG 15)可显著减少建模后14 天脑皮质GFAP表达，与溶剂对照组(HI)比较，差异具有统计学意义(表10，图7)。

表10免疫荧光检测GFAP在大脑皮层表达情况

P<0.05，HI-SAG15与HI组比较。