一种斑马鱼老年疾呆模型的建立方法及应用

摘要

本发明具体涉及一种建立斑马鱼老年疾呆模型的方法及应用，包括葡萄糖培养液和冈田酸培养液，所述葡萄糖培养液与冈田酸培养液交替用于培养斑马鱼，葡萄糖培养液或冈田酸培养液的单次培养时间为22～26小时。本发明首次公开了通过采用特定浓度的葡萄糖培养液和冈田酸培养液交替培养斑马鱼，能快速有效造成斑马鱼老年疾呆样症状的出现，从而极大减少了冈田酸的药物用量，节约了实验资源。

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种用于建立斑马鱼老年疾呆模型的方法及其应用，属于动物模型制备技术领域。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种以智能减退为主要特征的老年中枢神经系统退行性疾病。随着人口老龄化的加剧，其发病率逐年升高。通常65岁以后缓慢起病，表现为以记忆障碍为主的认知功能障碍，进行性加重并难以逆转，最终导致痴呆和功能障碍，严重影响老年人认知功能和生活能力，同时加重家属和社会护理和经济负担。故早期诊断、及时治疗和有效预防成为重要临床和科研问题。针对AD目前尚无有效的药物治愈方法，但流行病学研究表明,AD的发生与一些心血管危险因素和社会心理因素等有密切关系，如吸烟、高血压、糖尿病等可通过导致脑血管性和神经退行性疾病促使老年痴呆临床发病，糖尿病，高血压，抑郁，肥胖等都列为老年痴呆的风险因素。

糖尿病患者发生老年痴呆的风险是正常人的2倍左右，有研究认为70％的Ⅱ型糖尿病患者会最终发展为老年痴呆，研究发现很多糖尿病患者虽然没有老年痴呆症状，但已经可以观察到老年痴呆的病理变化如脑皮质较薄(这代表脑神经元可能已经出现损伤)、老年痴呆特有的脑毒性物质Tau蛋白水平升高等。有学者认为I型和Ⅱ型糖尿病是身体对糖的利用能力下降(胰岛素减少或胰岛素抵抗)，从而造成血糖升高，血糖波动增大；而老年痴呆的重要病因和表现就是到大脑糖代谢异常，大脑对糖的利用也显著减少，所以将老年痴呆称为“3型糖尿病”。同时也发现，脑中糖代谢的减少在老年痴呆的早期或前期就已经出现，而且这种糖代谢异常的机制和糖尿病几乎重合，也是胰岛素抵抗或胰岛素水平异常，这些代谢异常会妨碍大脑对老年痴呆特有的脑毒性物质—Tau蛋白等的清除，形成老年痴呆特有的脑中的“老年斑”，进而造成大脑功能障碍或萎缩。

利用整体动物模型开展的体内实验，将受试样品置于复杂的机体内环境下，能客观反映样品在体内的代谢规律和作用机制，及体内各器官相互作用下机体的反应，所获得的结果可靠性高，参考价值大。

中国专利文献CN1781019(申请号CN200480006554.7)公开了一种药理学的非人类动物模型的开发，该模型使在具有阿尔茨海默病的受检者的脑中发现的组织病理学特征与记忆丧失相关联。在一个实施方案中，在年轻的成年Long-Evans大鼠的左脑室内连续四周灌注一种Fe2+、Aβ42、buthionine sulfoximine(FAB)溶液诱发了记忆损伤并伴随着脑脊液中高磷酸化Tau蛋白水平的升高，该专利用的大鼠培养成本高、繁殖周期长，很难实现化合物活性的快速、高通量筛选。

斑马鱼作为一种理想的脊椎模式生物，与其他哺乳动物模型比，斑马鱼具有产卵量高，发育周期短，药物用量少，可重复性强优势。斑马鱼单胺类神经系统与哺乳动物极为相似，通过给予斑马鱼不同刺激条件，其复杂的行为模式与精神神经障碍行为均能得到良好体现，斑马鱼被广泛应用神经发育学、神经生物学、神经损伤和行为学等神经科学研究。在已有研究中，如梯形测试箱试验中，已确定评价斑马鱼焦虑与恐惧、药物依赖与戒断等精神状态的行为学指标，例如呆滞及异常游泳动作频率、顶部停留时间、上下穿梭次数及游动速度与距离等参数，均是斑马鱼行为学模型研究中常用的特征性评价指标。因此，利用斑马鱼研究人类神经系统疾病具有较好的适用性及良好的发展前景。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提出了一种斑马鱼老年疾呆模型的建立方法。

本发明还提出了一种斑马鱼老年疾呆模型的应用。

本发明的技术方案如下：

一种用于建立斑马鱼老年疾呆模型的培养液，包括葡萄糖培养液和冈田酸培养液，所述葡萄糖培养液与冈田酸培养液交替用于培养斑马鱼，葡萄糖培养液或冈田酸培养液的单次培养时间为22～26小时；

所述葡萄糖培养液为含葡萄糖质量百分比浓度1％～2％的水培养液；所述冈田酸培养液为含冈田酸浓度80～200nM的水培养液。

根据本发明优选的，所述单次培养时间为24小时。

根据本发明优选的，所述水培养液组份如下：

NaCl 5mmol/L，KCl 0.17mmol/L，CaCl₂>4>

根据本发明优选的，所述冈田酸培养液的浓度为100nM。

上述培养液在建立斑马鱼老年疾呆模型中的应用。

根据本发明优选的，所述应用，包括以下步骤：

(1)将斑马鱼放入水培养液和葡萄糖培养液中交替培养，斑马鱼在每种培养液中培养22～26小时，共培养50～60天，制得初步培养后的斑马鱼；

(2)将步骤(1)初步培养后的斑马鱼在葡萄糖培养液和冈田酸培养液中交替培养，初步培养后的斑马鱼在每种培养液中培养22～26小时，共培养6～10天，即得。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，水培养液的组分为NaCl 5mmol/L，KCl0.17mmol/L，CaCl₂>4>

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，斑马鱼为健康的5～10月龄野生型或AB系斑马鱼；根据本发明进一步优选的，水培养液、葡萄糖培养液或冈田酸培养液的体积为1.5L，置于3L的培养容器中，每个培养容器中放10条斑马鱼。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，培养步骤为在21～25℃下控光培养斑马鱼24小时；根据本发明进一步优选的，所述的控光为光照14小时，黑暗10小时；根据本发明进一步优选的，当更换斑马鱼培养液时，先用水培养液冲洗斑马鱼3～5遍，然后放入更换后的培养液中；进一步优选的，交替培养期间正常喂食并及时取出死亡的斑马鱼。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，培养步骤为在21～25℃下控光培养斑马鱼24小时；根据本发明进一步优选的，搜书的控光为光照14小时，黑暗10小时；根据本发明进一步优选的，当更换斑马鱼培养液时，先用水培养液冲洗斑马鱼3～5遍，然后放入更换后的培养液中；进一步优选的，交替培养期间正常喂食并及时取出死亡的斑马鱼。

本发明优选的，所述步骤(2)中，交替培养时间为9天。

本发明的有益效果

1.本发明首次公开了通过采用特定浓度的葡萄糖培养液和冈田酸培养液交替培养斑马鱼，能快速有效造成斑马鱼老年疾呆症状的出现，从而极大减少了冈田酸的药物用量，节约了实验资源；

2.通过这一模型建立可以充分利用斑马鱼的生物学特点及便捷的实验操作优势，从分子、器官及整体水平全面研究疾病的病理机制，为快速筛选、研发治疗行为障碍疾病的活性药物提供理论依据；

3.在这一模型中对斑马鱼行为学特征及行为评价参数进行较为详细地考察，能为其它类似的脑神经系统疾病模型的建立及研究提供参考。

附图说明

图1为实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3处理后的斑马鱼的运动轨迹；

图2为实验例1中在T_15-20时间段，实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3中每条斑马鱼平均总游动距离、呆滞频率及在上层停留时间的柱状图；

图3为实验例2中在T_15-20时间段，T₁、T₂、T₃、T₄、T₅、T₆组每条斑马鱼的平均总游动距离、呆滞频率及在上层停留时间等参数值的柱状图；

图4为实验例3中在T_15-20时间段，T₇、T₈、T₉、T₁₀、T₁₁、T₁₂组每条斑马鱼的平均总游动距离、呆滞频率及在上层停留时间等参数值的柱状图；

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案做进一步的解释说明，但本专利的保护范围不限于此。

冈田酸(Okacaid acid,OA)，MW:805，纯度≥99％，购自Sigma公司；

石杉碱甲(Huperzine A，Hup A)，MW:242，纯度≥99％购自上海源叶生物科技有限分司；

葡萄糖为国产分析纯；

水培养液组分如下：

NaCl 5mmol/L，KCl 0.17mmol/L，CaCl₂>4>

葡萄糖培养液为向水培养液中加入葡萄糖，配制葡萄糖质量百分比浓度为1％～2％的溶液；

冈田酸培养液向水培养液中加入含冈田酸，配制冈田酸浓度为80～200nM的溶液。

受试样品1为参枝苓口服液。受试样品2为一种中药方剂复合物，由制附片15g，黄芪45g，丹参30g,益智仁15g，何首乌30g，补骨脂15g，川芎15g，枳实10g，法半夏15g，茯苓15g，鸡血藤30g组成。

实施例1、

建立斑马鱼老年疾呆模型的方法，步骤如下：

(1)将水培养液和含质量百分比浓度2％的葡萄糖培养液分别加入不同的3L培养缸内，每缸培养液体积为1.5L，选取健康的7月龄野生型斑马鱼放于水培养液内，每缸放10条斑马鱼，在23℃下控光培养24小时(光照14小时，黑暗10小时)，取出斑马鱼用水培养液冲洗5遍，再放入葡萄糖培养液内，继续在23℃下控光培养24小时(光照14小时，黑暗10小时)，然后取出斑马鱼用水培养液冲洗5遍，再放入水培养液中，在两种培养液中持续交替培养60天，期间正常喂食，及时去除死亡斑马鱼，制得初步培养后的斑马鱼；

(2)将浓度为100nM的冈田酸培养液1.5L，加入3L的培养缸内，在冈田酸培养液中放入步骤(1)初步培养后的斑马鱼，在23℃下控光培养24小时(光照14小时，黑暗10小时)，取出斑马鱼用水培养液冲洗5遍，再放入质量百分比浓度2％的葡萄糖培养液内，继续在23℃下控光培养24小时(光照14小时，黑暗10小时)，然后取出斑马鱼用水培养液冲洗5遍，再放入冈田酸培养液中，在两种培养液中持续交替培养9天，期间正常喂食，及时去除死亡斑马鱼，得培养后的斑马鱼；

记录斑马鱼在步骤(1)中的第10天、第20天、第30天、第40天、第50天和第60天的血糖值，如表1所示。

实施例2、

建立斑马鱼老年疾呆模型的方法，步骤如下：

(1)将水培养液和含质量百分比浓度1％的葡萄糖培养液分别加入不同的3L培养缸内，每缸培养液体积为1.5L，选取健康的7月龄野生型斑马鱼放于水培养液内，每缸放10条斑马鱼，在23℃下控光培养24小时(光照12小时，黑暗12小时)，取出斑马鱼用水培养液冲洗3遍，再放入葡萄糖培养液内，继续在23℃下控光培养24小时(光照12小时，黑暗12小时)，然后取出斑马鱼用水培养液冲洗3遍，再放入水培养液中，在两种培养液中持续交替培养60天，期间正常喂食，及时去除死亡斑马鱼，制得初步培养后的斑马鱼；

(2)将浓度为100nM的冈田酸培养液1.5L，加入3L的培养缸内，在冈田酸培养液中放入步骤(1)初步培养后的斑马鱼，在23℃下控光培养24小时(光照12小时，黑暗12小时)，取出斑马鱼用水培养液冲洗3遍，再放入质量百分比浓度2％的葡萄糖培养液内，继续在23℃下控光培养24小时(光照12小时，黑暗12小时)，然后取出斑马鱼用水培养液冲洗3遍，再放入冈田酸培养液中，在两种培养液中持续交替培养9天，期间正常喂食，及时去除死亡斑马鱼，得培养后的斑马鱼；

记录斑马鱼在步骤(1)中的第10天、第20天、第30天、第40天、第50天和第60天的血糖值，如表1所示。

对比例1、

如实施例1所述的方法，不同之处在于：步骤(2)中，23℃下控光培养时间延长至72小时，在两种培养液中持续交替培养9天。

记录斑马鱼培养第10天、第20天、第30天、第40天、第50天和第60天的血糖值，取其平均值，如表1所示。

对比例2、

如实施例1所述的方法，不同之处在于：

(2)向3L的培养缸内加入1.5L浓度为100nM的冈田酸培养液，平行处理3缸，每缸放10条步骤(1)初步培养后的斑马鱼，在23℃下控光(光照14小时，黑暗10小时)培养，每天更换1/4冈田酸培养液，连续培养9天。

记录斑马鱼培养第10天、第20天、第30天、第40天、第50天和第60天的血糖值，取其平均值，如表1所示。

对比例3、

向3L的培养缸内加入1.5L水，平行处理3缸，每缸放10条7月龄野生型斑马鱼，在23℃下控光(光照14小时，黑暗10小时)培养，每24小时更换一次水，连续培养69天。

记录斑马鱼培养第10天、第20天、第30天、第40天、第50天和第60天的血糖值，取其平均值，如表1所示。

对比例4、

向3L的培养缸内加入0.7L含质量百分比浓度为2％的葡萄糖培养液和0.8L浓度为100nM的冈田酸培养液，混合均匀，平行处理3缸，每缸放10条7月龄野生型斑马鱼，在23℃下控光(光照14小时，黑暗10小时)培养，在培养第10h的时候，斑马鱼全部死亡。

表1斑马鱼造模过程中血糖值变化(mmol/L)

分组第10天第20天第30天第40天第50天第60天实施例14.3±0.85.4±1.11.3±0.313.3±1.112.2±1.414.4±1.3实施例24.4±0.56.0±1.32.8±0.412.4±1.513.5±1.013.2±1.5对比例14.7±0.96.2±1.22.3±0.512.8±1.612.8±1.613.6±1.6对比例25.0±0.76.7±0.91.9±0.213.7±1.713.4±1.114.0±1.7对比例34.0±1.07.9±0.75.4±0.76.1±0.88.1±0.97.2±0.7

实验例1、

将实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3处理后的斑马鱼分别放入2L培养缸内，缸内加入3/4体积水培养液，一次放一条，置于斑马鱼行为学分析系统的检测台上，打开背景光源，使用Zeblab软件在垂直方向上采集斑马鱼30min内的运动轨迹，如图1所示，并利用软件对实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3中每条斑马鱼平均总游动距离、呆滞频率及在上层停留时间等参数进行分段测量，以每5min为一时间段(T_0-5)，选取T_15-20的数据，如图2所示，此时间段内斑马鱼状态较为稳定，根据行为学检测结果，实施例1、实施例2、对比例1、对比例2中的斑马鱼游动范围局限于水体下层，总游动距离和在上层停留时间比对比例3中的斑马鱼减少，呆滞频率高于对比例3斑马鱼的呆滞频率，即实施例1、实施例2、对比例1、对比例2中的斑马鱼出现老年疾呆样症状；实施例1、实施例2中的斑马鱼的总游动距离和在上层停留时间比对比例2、对比例3中的斑马鱼少，呆滞频率高，出现老年疾呆样症状的斑马鱼比例显著升高(图3)，说明斑马鱼出现持续高血糖状态基础上联用冈田酸，比单用冈田酸能有效提高造模成功率；实施例1、实施例2中的斑马鱼的总游动距离和在上层停留时间比对比例1也显著下降，说明葡萄糖培养液和冈田酸培养液的更换频次也对老年疾呆样症状的产生具有显著影响。

实验例2、

分别向六个培养缸内加入0.3L的10mg·L-1受试样品1培养液、0.3L的50mg·L-1受试样品1培养液、0.3L的100mg·L-1受试样品1培养液,0.3L的12.5μM石杉碱甲培养液，0.3L的水培养液，0.3L的水培养液，向前五组培养液中随机放入实施例1处理后的斑马鱼，向第六组培养液中加入对比例3中的斑马鱼，在28℃下，控光(光照14小时，黑暗10小时)培养7天，每天更换1/3培养液，分别记为T₁、T₂、T₃、T₄、T₅、T₆组。

处理结束后，将各组斑马鱼依次取出放入培养缸内，一次测一条，然后放于斑马鱼行为学分析系统的检测台面上，打开背景光源，在垂直方向上，使用Zeblab软件采集各组斑马鱼30min内的运动轨迹，并以每5min为一时间段(T_0-5)，分段测量各组斑马鱼总游动距离、呆滞频率及在上层停留时间等参数值，选取T_15-20测量数据，计算各参数均值，如图3所示。

结论：受试样品1浓度为100mg·L^-1组时，斑马鱼T_15-20总游动距离明显增长，在上层停留时间有所增加，呆滞频率显著下降，与T₆、T₄组相比，各参数均比较相近。

实验例3、

(1)将水培养液和含2％葡萄糖培养液分别加入3L的培养缸内，每缸培养液体积为1.5L，选取健康的10月龄野生型斑马鱼放于水培养液内，在21℃下控光培养24小时(光照14小时，黑暗10小时)，取出斑马鱼用水冲洗5遍，再放入葡萄糖培养液内，继续在21℃下控光培养24小时(光照14小时，黑暗10小时)，然后取出斑马鱼用水冲洗5遍，再放入水培养液中，在两种培养液中持续交替培养55天，期间正常喂食，及时去除死亡斑马鱼；

(2)取适量冈田酸母液和受试样品2用水培养液溶解稀释得到含60nM冈田酸和1mg·L^-1受试样品2的混合溶液，体积为1.5L，取适量葡萄糖和受试样品2用水培养液溶解稀释得到含2％葡萄糖和1mg·L^-1的受试样品2的混合溶液，体积为1.5L，制得第一溶剂组；取适量冈田酸母液和受试样品2用水培养液溶解稀释得到含60nM冈田酸和10mg·L^-1受试样品2的混合溶液，体积为1.5L，取适量葡萄糖和受试样品2用水培养液溶解稀释得到含2％葡萄糖和10mg·L^-1的受试样品2的混合溶液，体积为1.5L，制得第二溶剂组；取适量冈田酸母液和受试样品2用水培养液溶解稀释得到含60nM冈田酸和100mg·L^-1受试样品2的混合溶液，体积为1.5L，取适量葡萄糖和受试样品2用水培养液溶解稀释得到含2％葡萄糖和100mg·L^-1的受试样品2的混合溶液，体积为1.5L，制得第三溶剂组；取适量冈田酸母液和石杉碱甲母液用水培养液溶解稀释得到含60nM冈田酸和12.5μM石杉碱甲的混合溶液，体积为1.5L，取适量葡萄糖和石杉碱甲母液用水培养液溶解稀释得到含2％葡萄糖和12.5μM石杉碱甲的混合溶液，体积为1.5L，制得第四溶剂组；第五溶剂组为1.5L>7、T₈、T₉、T₁₀、T₁₁、T₁₂组。

处理结束后，将各组斑马鱼依次取出放入培养缸内，一次测一条，然后放于斑马鱼行为学分析系统的检测台面上，打开背景光源，在垂直方向上，使用Zeblab软件采集各组斑马鱼30min内的运动轨迹，并以每5min为一时间段(T_0-5)，分段测量各组斑马鱼总游动距离、呆滞频率及在上层停留时间等参数值，选取T_15-20测量数据，计算各参数均值，如图4所示。

结论：利用斑马鱼行为学分析系统依次采集各处理组斑马鱼30min内的运动轨迹及各项行为学参数，结果显示，T₁₁组斑马鱼游动范围集中在水体下层，游动总距离和在上层停留时间显著低于T₁₂组，显示出异常行为表现。同时加入受试样品2进行处理，能明显降低这种异常行为的程度，并有量-效依赖性特点，T₉组斑马鱼T_15-20内呆滞频率、在上层停留时间及总游动距离与T₁₂、T₁₀相比，各参数均比较相近。