一种6，8-二羟基嘌呤类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的应用

摘要

本发明提供了一种6，8‑二羟基嘌呤类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的应用。本发明的6，8‑二羟基嘌呤类化合物用于制备抗乙肝病毒药物，具有抑制乙肝病毒核心蛋白组装的作用，能从根本上抑制乙肝病毒的复制，并且对细胞无毒副作用，在乙肝病毒病治疗方面具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于乙醇类化合物的应用技术领域，涉及一种6，8-二羟基嘌呤类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范围内的重要公共健康问题。急性乙肝病毒感染后，仍有8％左右发展为慢性乙肝感染，持续性HBV感染将导致肝硬化，甚至肝癌。我国是乙肝大国，乙肝病毒携带者接近1.3亿人，约占总人口的9％。尽管随着乙肝疫苗的大范围普及，新乙肝感染率得到有效控制，但乙肝携带人口基数大，防治乙肝成为我国公共健康问题的重中之重。乙肝传播途径主要通过垂直传播与水平传播。垂直传播是指母婴传播；水平传播主要通过血液传播。

目前，被批准上市的抗HBV药物主要是免疫调节剂(干扰素-α和聚乙二醇干扰素-α-2α)和抗病毒治疗药物(拉米夫定、阿德福韦二匹夫酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦、克拉夫定、NOV-205)。但是，干扰素-α和聚乙二醇干扰素-α-2α有很多缺点，例如，耐受性差，皮下给药频繁(干扰素-α)，副作用多，费用高等等；而上述七种抗病毒治疗药物中除NOV-205是在俄罗斯上市的小分子非核苷抗病毒药物外，其它的六种抗病毒治疗药物都是作用于乙肝病毒的逆转录酶(RT)的核苷/核苷酸类似物，它们存在耐药性和副作用(如肾毒性和肌病)。而且，现在的抗病毒药物都不能针对HBV本身进行从头抗病毒，不能彻底的清除乙肝病毒。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种6，8-二羟基嘌呤类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的应用，该6，8-二羟基嘌呤类化合物具有抑制乙肝病毒核心蛋白组装的作用，能从根本上抑制乙肝病毒的复制，并且对细胞无毒副作用，在乙肝病毒病治疗方面具有广泛的应用前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种6，8-二羟基嘌呤类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的应用。

作为优选方案，所述6，8-二羟基嘌呤类化合物在制备抑制乙肝病毒核心蛋白组装药物中的应用。

作为进一步的优选方案，所述6，8-二羟基嘌呤类化合物在制备抑制乙肝病毒复制药物中的应用。

其中，所述6，8-二羟基嘌呤类化合物的通式为：

式中，R₁选自氢、卤素、五元环、六元环、C1～C4的饱和碳链、烷氧基或氰基，X选自氢、卤素。

优选地，所述卤素为氟、氯或溴；优选地，所述卤素为氯或溴。

更优选地，所述五元环为单卤素或双卤素取代的五元杂环。

进一步地，所述六元环为甲氧基、炔基、氰基或双卤素取代的苯环。

优选地，所述烷氧基为甲氧基、丙氧基和叔丁氧基中的一种。

作为优选的实施方案，所述6，8-二羟基嘌呤类化合物的结构式为

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的6，8-二羟基嘌呤类化合物用于制备抗乙肝病毒药物，具有明显的HBV抗病毒活性，在HepG2.2.15细胞中的IC50可高至1.84uM，具有较好的抗病毒作用。用6，8-二羟基嘌呤类化合物检测绿色荧光蛋白VFP的表达情况，出现了绿色荧光蛋白VFP表达下降的情形，说明6，8-二羟基嘌呤类化合物具有抑制HBV的c抗原的相互结合的作用。

本发明的6，8-二羟基嘌呤类化合物具有抑制乙肝病毒核心蛋白组装的作用，能从根本上抑制乙肝病毒的复制，并且对细胞无毒副作用，在乙肝病毒病治疗方面具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1的6，8-二羟基嘌呤抑制HBV的c抗原的相互结合的实验结果；

图2为本发明实施例2的6，8-二羟基嘌呤抑制野生型HBV病毒复制的实验结果；

图3为本发明实施例3的6，8-二羟基嘌呤对293t细胞毒性的实验结果。

具体实施方式

下面结合附图1-3，并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

本发明的6，8-二羟基嘌呤类化合物在制备抗乙肝病毒药物中的应用，以6，8-二羟基嘌呤为6，8-二羟基嘌呤类化合物A，对其在抑制HBV的c抗原、制野生型HBV病毒复制、293t细胞中的细胞毒性三个方面进行了研究，具体实验方法如实施例1-3所示。

实施例1

6，8-二羟基嘌呤抑制HBV的c抗原的相互结合的作用研究

实验方法：取生长良好的人肾上细胞株239t细胞，接种于96孔透明平底板中，每孔5×104细胞。使用的培养基是完全培养基：高糖DMEM，10％胎牛血清以及1％双抗，培养条件是5％二氧化碳、37℃；24h贴壁后，共转染pcDNA3.1-HBVcAg-VFP-C和pcDNA3.1-HBVcAg-VFP-N两种质粒。转染采用脂质体包裹转染，试剂使用lipo2000，转染液20μl。转染4h后，加入待筛选的化合物A，每孔2μl，终浓度为50μM。培养48h后，检测绿色荧光蛋白VFP的表达情况。如果出现绿色荧光蛋白VFP表达下降的情形，该化合物可能成为抗病毒候选药物。实验结果如图1所示，从实验结果可以看出，6，8-二羟基嘌呤具有抑制HBV的c抗原的相互结合的作用。

实施例2

6，8-二羟基嘌呤抑制野生型HBV病毒复制研究

实验方法：取生长良好的可产野生型HBV病毒的细胞系HepG2.2.15，细胞用量为2×104/孔，铺96孔板铺板24h后加入化合物A，化合物每孔2μl(终浓度250μM，50μM，10μM，2μM，0.4μM，0.08μM，0.016μM，0μM)；使用2％Triton X-100处理收样的上清，收培养了8天的细胞上清，然后检测细胞培养上清中HBV的DNA含量。实验结果如图2所示。从实验结果可以看出，6，8-二羟基嘌呤具有良好的抑制野生型HBV病毒复制的作用，其IC50为1.891μM。

实施例3

6，8-二羟基嘌呤在293t细胞中的细胞毒性实验

实验方法：用含10％胎小牛血清的DMEM培养液将293t配成单个细胞悬液，以每孔1000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul；24h贴壁后加入化合物，每孔2μl，终浓度分别为50μM，5μM，0.5μM，0.05μM，0.005μM，0.0005μM，0μM；培养48h后，每孔加MTS溶液20ul，继续在培养箱中孵育2～4h；选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，观察化合物对293t细胞的细胞毒性。实验结果如图3所示。从实验结果可以看出，6，8-二羟基嘌呤毒性较低，在293t细胞中均呈现出无细胞毒现象。

实施例4

以为6，8-二羟基嘌呤类化合物B代替实施例1的化合物A，按照实施例1-3的实验方法检测化合物B的抑制HBV的c抗原的相互结合的作用、抑制野生型HBV病毒复制能力以及其细胞毒性。

经检测，化合物B同样出现了绿色荧光蛋白VFP表达下降的情形，说明化合物B有抑制HBV的c抗原的相互结合的作用。

化合物B的抑制野生型HBV病毒复制研究结果为IC50为1.2uM，说明化合物B具有良好的抑制野生型HBV病毒复制的作用。

化合物B在293t细胞中的细胞毒性实验结果表明，化合物B毒性较低，在293t细胞中均呈现出无细胞毒现象。

实施例5

以为6，8-二羟基嘌呤类化合物C代替实施例1的化合物A，按照实施例1-3的实验方法检测化合物C的抑制HBV的c抗原的相互结合的作用、抑制野生型HBV病毒复制能力以及其细胞毒性。

经检测，化合物C同样出现了绿色荧光蛋白VFP表达下降的情形，说明化合物C有抑制HBV的c抗原的相互结合的作用。

化合物C的抑制野生型HBV病毒复制研究结果为IC50为1.65uM，说明化合物C具有良好的抑制野生型HBV病毒复制的作用。

化合物C在293t细胞中的细胞毒性实验结果表明，化合物C毒性较低，在293t细胞中均呈现出无细胞毒现象。

实施例6

以为6，8-二羟基嘌呤类化合物D代替实施例1的化合物A，按照实施例1-3的实验方法检测化合物D的抑制HBV的c抗原的相互结合的作用、抑制野生型HBV病毒复制能力以及其细胞毒性。

经检测，化合物D同样出现了绿色荧光蛋白VFP表达下降的情形，说明化合物D有抑制HBV的c抗原的相互结合的作用。

化合物D的抑制野生型HBV病毒复制研究结果为IC50为1.84uM，说明化合物D具有良好的抑制野生型HBV病毒复制的作用。

化合物D在293t细胞中的细胞毒性实验结果表明，化合物D毒性较低，在293t细胞中均呈现出无细胞毒现象。

本发明的6，8-二羟基嘌呤类化合物，具有抑制乙肝病毒核心蛋白组装的作用，能从根本上抑制乙肝病毒的复制，并且对细胞无毒副作用，在乙肝病毒病治疗方面具有广泛的应用前景。

以上实施例仅用来说明本发明的详细方法，本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。