TLCD1在乳腺癌转移的诊断、预后及治疗中的应用

摘要

本发明公开了TLCD1在乳腺癌转移的诊断、预后及治疗中的应用。本发明发现TLCD1在乳腺癌骨转移的组织和细胞中高表达，并且预示着更短的无骨转移生存时间，体内体外实验证实了TLCD1基因下调表达能够抑制乳腺癌迁移和侵袭，从而抑制乳腺癌骨转移；基于上述发现，本发明提出将检测TLCD1基因表达水平的试剂应用于制备检测乳腺癌是否发生转移的试剂盒和/或预测乳腺癌转移倾向的预后试剂盒中；将TLCD1的抑制性试剂应用于制备预防和/或治疗乳腺癌转移的药物中，为乳腺癌转移的诊断、预后和治疗提供新的思路。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，更具体地涉及TLCD1在乳腺癌转移的诊断、预后及治疗中的应用。

背景技术

转移是肿瘤患者的主要死因，超过90％的肿瘤相关死亡与远处器官转移有关。骨是实体肿瘤最常见的远处转移器官之一，肿瘤发生骨转移后，伴随而来的是骨相关并发症，如疼痛、病理性骨折、高血钙症、脊髓压迫、运动功能丧失等，最终导致患者死亡。目前针对骨转移的治疗均属姑息性，无论是手术、放疗以及药物治疗，只是缓解及改善相应症状，并不能明显提高患者的生存预期。因而，一旦发生骨转移，不仅严重影响了患者的生活质量与寿命，也给临床治疗带来极大的困难。

乳腺癌(breast cancer：BC)是最易发生骨转移的肿瘤。在我国，随着营养结构改变及老龄化趋势，乳腺癌骨转移的发生率和死亡数量有显著增长的趋势。多数情况下，乳腺癌在没有引起明显的临床症状之前，就已经引起了骨转移灶的发生，或者原发肿瘤治疗后没有复发，但仍发现骨转移灶的形成，给临床治疗带来了极大的困难。乳腺癌一旦发生骨转移，表明患者已进入肿瘤晚期，严重影响了患者的生活质量与寿命，增加了患者家庭的经济负担，也消耗了大量的医疗资源。因此，有针对性地开发检测乳腺癌是否发生转移的产品、预测乳腺癌转移倾向的预后产品，以及抑制乳腺癌转移的药物，对于诊断、预后和治疗乳腺癌转移，提高患者生存率具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供TLCD1在乳腺癌转移的诊断、预后及治疗中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

用于检测TLCD1基因表达水平的试剂在制备检测乳腺癌是否发生转移的试剂盒中的应用。

其中，所述检测TLCD1基因表达水平的试剂选自：引物、探针、芯片、抗体。

其中，所述转移包括骨转移、肝转移、肺转移、胸膜转移、脑转移和淋巴转移。

用于检测TLCD1基因表达水平的试剂在制备预测乳腺癌转移倾向的预后试剂盒中的应用。

其中，所述检测TLCD1基因表达水平的试剂选自：引物、探针、芯片、抗体。

其中，所述转移包括骨转移、肝转移、肺转移、胸膜转移、脑转移和淋巴转移。

TLCD1的抑制性试剂在制备预防和/或治疗乳腺癌转移的药物中的应用。

其中，所述TLCD1的抑制性试剂选自：能够全部或部分抑制TLCD1基因表达的物质，能够全部或部分抑制TLCD1蛋白发挥功效的物质。

其中，所述TLCD1的抑制性试剂选自：蛋白质、寡核苷酸、寡核苷酸表达载体、小分子化合物。

其中，所述转移包括骨转移、肝转移、肺转移、胸膜转移、脑转移和淋巴转移。

本发明的有益效果是：

本发明发现TLCD1在乳腺癌骨转移的组织和细胞中高表达，并且预示着更短的无骨转移生存时间。体内体外实验证实了TLCD1基因下调表达能够抑制乳腺癌迁移和侵袭，从而抑制乳腺癌骨转移；基于上述发现，本发明提出将检测TLCD1基因表达水平的试剂应用于制备检测乳腺癌是否发生转移的试剂盒和/或预测乳腺癌转移倾向的预后试剂盒中；将TLCD1的抑制性试剂应用于制备预防和/或治疗乳腺癌转移的药物中，为乳腺癌转移的诊断、预后和治疗提供新的思路。

附图说明

图1：乳腺癌组织和细胞中TLCD1的mRNA和蛋白表达量；其中，图A为乳腺癌骨转移组织和无骨转移组织中TLCD1的mRNA含量，图B为乳腺癌骨转移组织(4例)和无骨转移组织(4例)中TLCD1的蛋白含量；图C为各种细胞系中TLCD1的mRNA含量，图D为各种细胞系中TLCD1的蛋白含量；图中BC/nBM表示无骨转移乳腺癌组织，BC/BM表示骨转移乳腺癌组织；

图2：TLCD1高表达组和TLCD1低表达组患者的无骨转移生存时间；图中TLCD1 H表示TLCD1高表达组，TLCD1 L表示TLCD1低表达组；

图3：RNA干扰质粒对MDA-MB-231和MCF7细胞中TLCD1的mRNA和蛋白表达量的影响，图中vector为转染有对照质粒的细胞系，TLCD1 RNAi#1为TLCD1稳定低表达乳腺癌细胞系；

图4：RNA干扰质粒对MDA-MB-231和MCF7细胞迁移和侵袭的影响，图中vector为转染有对照质粒的细胞系，TLCD1 RNAi#1为TLCD1稳定低表达乳腺癌细胞系；

图5：利用转染有RNA干扰质粒的TLCD1稳定低表达MDA-MB-231细胞构建小鼠乳腺癌骨转移模型；其中，图A为BLI成像示意图，图B为骨X射线图，图C为骨HE染色图，图D为骨转移评分结果，图E为BLI信号结果图，图F为总生存曲线，图G为无骨转移生存曲线；图中vector为转染有对照质粒的细胞系，TLCD1 RNAi#1为TLCD1稳定低表达乳腺癌细胞系；

图6：利用转染有RNA干扰质粒的TLCD1稳定低表达MCF7细胞构建小鼠乳腺癌骨转移模型；其中，图A为BLI成像示意图，图B为骨X射线图，图C为骨HE染色图，图D为骨转移评分结果，图E为BLI信号结果图，图F为总生存曲线，图G为无骨转移生存曲线；图中vector为转染有对照质粒的细胞系，TLCD1 RNAi#1为TLCD1稳定低表达乳腺癌细胞系。

具体实施方式

发明人利用二代测序、肿瘤相关数据库及生物信息分析手段，经过长时间研究和筛选，发现TLCD1能作为乳腺癌转移的诊断和预后标志物，并且应用于乳腺癌转移的预防和治疗中。

为此，本发明提出：

用于检测TLCD1基因表达水平的试剂在制备检测乳腺癌是否发生转移的试剂盒中的应用。

其中，所述检测TLCD1基因表达水平的试剂选自：引物、探针、芯片、抗体，但不限于此。本领域技术人员可以根据TLCD1基因或其编码蛋白的序列，设计特异性地引物、探针、芯片、抗体，且对所述试剂的修饰也应包含在保护范围内。

其中，所述转移包括骨转移、肝转移、肺转移、胸膜转移、脑转移和淋巴转移。

用于检测TLCD1基因表达水平的试剂在制备预测乳腺癌转移倾向的预后试剂盒中的应用。

其中，所述检测TLCD1基因表达水平的试剂选自：引物、探针、芯片、抗体，但不限于此。本领域技术人员可以根据TLCD1基因或其编码蛋白的序列，设计特异性地引物、探针、芯片、抗体，且对所述试剂的修饰也应包含在保护范围内。

其中，所述转移包括骨转移、肝转移、肺转移、胸膜转移、脑转移和淋巴转移。

TLCD1的抑制性试剂在制备预防和/或治疗乳腺癌转移的药物中的应用。

其中，所述TLCD1的抑制性试剂选自：能够全部或部分抑制TLCD1基因表达的物质，能够全部或部分抑制TLCD1蛋白发挥功效的物质。

进一步说明，能够全部或部分抑制TLCD1基因表达的物质可以是通过中断TLCD1基因的转录和/或阻断TLCD1基因的mRNA翻译实现；能够全部或部分抑制TLCD1蛋白发挥功效的物质至少应理解为能够抑制TLCD1蛋白的活性、有效作用时长、稳定性的物质。

其中，所述TLCD1的抑制性试剂选自：蛋白质、寡核苷酸、寡核苷酸表达载体、小分子化合物，但不限于此。进一步说明，表达载体可选用病毒载体或真核载体。

其中，所述转移包括骨转移、肝转移、肺转移、胸膜转移、脑转移和淋巴转移。

下面结合具体实验，进一步阐述本发明思路，但本发明的保护范围但并不局限于此。

下述实验例中所使用的实验方法或实验条件，如无特殊说明，均按常规方法或厂家说明书进行，下述实验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

材料与方法

1、实验材料

(1)细胞系：人正常乳腺上皮细胞(NMEC1)，非转移性人乳腺癌细胞系(MDA-MB-415、T47D、BT549)，转移性乳腺癌细胞系(MDA-MB-453、MCF-7、4T1、MDA-MB-231)；其中，NMEC1细胞用添加有表皮生长因子和牛脑垂体提取物的角质细胞培养基(无血清)培养，并在培养基中加入120μg/mL链霉素和120μg/mL青霉素；MDA-MB-415细胞用添加有15％胎牛血清的L15培养基培养；BT549、4T1用添加有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养；T47D、MCF-7、MDA-MB-453、、MDA-MB-231细胞用添加有10％的胎牛血清、200mg/ml青霉素、250mg/ml氯霉素、500mg/ml谷胺酰胺的DMEM培养基培养，以上细胞培养条件为：二氧化碳浓度为5％，温度为37℃；定期观察细胞状态及细胞密度，定期更换培养基，待细胞密度至80％时适宜实验使用。

(2)组织样本：263例手术或穿刺活检获得的乳腺癌组织样本，其中，231例非骨转移乳腺癌组织，32例骨转移乳腺癌组织，以上组织样本来源于江门市中心医院，均有对应的临床病理信息。

(3)实验动物：5～6周龄，18～20g的BALB/c-nu裸鼠。

(4)引物：用于检测人TLCD1基因的mRNA及其内参基因的引物由广州市锐博生物科技有限公司设计和合成。

(5)抗体：用于检测人TLCD1基因编码蛋白及其内参蛋白的一抗、二抗购自Santa Cruz公司。

(6)RNA干扰质粒：用于下调人TLCD1基因表达的人TLCD1 shRNA质粒(简称RNA干扰质粒)及其对照质粒由广州市锐博生物科技有限公司设计和合成。

2、实验方法

(1)荧光定量PCR检测TLCD1 mRNA

取约100mg的待测组织/细胞，在液氮中用研钵碾碎，加入TRizol室温裂解10min，1ml TRizol裂解液加入0.2ml氯仿，剧烈振摇30s，静置5min；4℃，12,000g离心15min，吸取上清至新离心管中，加入等体积的异丙醇，吹打均匀，静置10min，4℃，12,000g离心5min，用含75％乙醇的DEPC水溶洗涤RNA沉淀3次，稍事干燥后，用DEPC水溶解RNA。测得浓度后按PrimeScript RT reagent Kit说明书操作，进行反转录：按SYBR Premix Ex Taq II Kit说明书，在7500实时定量PCR系统上，选用2ddCt相对定量法进行检测分析，内参基因为GAPDH，求算目标基因的相对mRNA表达量。

(2)Western blotting检测TLCD1蛋白表达水平

取约100mg的待测组织/细胞，在液氮中用研钵碾碎，加入RIPA裂解液冰上裂解30min，收集裂解液，4℃，12,000g离心15min，收集上清，按BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量，向上清液加入体积量1/4的5×上样缓冲液，沸水浴10min后，冰浴5min。使用SDS PAGE蛋白电泳系统，上样量为30μg总蛋白，电泳参数为10％分离胶、5％浓缩胶，100V电泳90min至溴盼蓝指示剂迁移至底部后，进行电转移，使用0.45μm的PVDF膜，300mAl冰浴电转90min。电转结束后，膜使用5％脱脂奶粉封闭，TBST漂洗3遍5min，加入anti-TLCD1一抗(1:1000)，4℃孵育过夜，TBST漂洗3遍5min，加入封闭液稀释的二抗，室温孵育lh，TBST漂洗3遍5min，加入ECL发光液，置于压片夹中X光底片感光lmin至20min，经显影定影处理：免疫印迹检测以α-tubulin为对照。

(3)质粒转染

转染前将乳腺癌细胞以10⁵个/孔接种于培养板，添加稀释后的RNA干扰质粒、对照质粒和脂质体，转染后利用抗生素进行筛选，最终获得稳定表达的细胞系，具体转染实验参照Lipofectamine3000产品说明书进行。

(4)侵袭和迁移实验

采用transwell小室法进行侵袭和迁移实验，简而言之，transwell小室涂布或不涂布基质胶，将细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在无血清培养基中，上室添加1.5×10⁵个细胞，下室为含有10％胎牛血清的培养基，孵育24～48h后，用4％多聚甲醛固定，并用苏木精染色，在显微镜下计数(100×)。

(5)乳腺癌骨转移动物模型

5-6周龄，18～20g的BALB/c-nu裸鼠用于实验，实验前进行麻醉，左心室接种1×10⁵个(100μL>

实施例1、TLCD1在乳腺癌骨转移组织和细胞中高表达

在收集的组织样本和细胞系中，通过荧光定量PCR和Western blotting分别检测TLCD1的mRNA和蛋白含量，结果如图1所示，与无骨转移乳腺癌组织相比，骨转移乳腺癌组织中TLCD1的mRNA及蛋白含量增多(图1A和图1B)，与人正常乳腺上皮细胞系相比，乳腺癌细胞系中TLCD1的mRNA及蛋白含量增多，并且转移性乳腺癌细胞系中TLCD1的mRNA及蛋白含量增多更显著，尤其是MCF-7和MDA-MB-231细胞系(图1C和图1D)。

以上结果表明：TLCD1在乳腺癌骨转移组织和细胞中高表达，因此，可以通过检测TLCD1表达水平，诊断是否发生乳腺癌骨转移，例如，以受检者乳腺癌组织样本中TLCD1的mRNA或蛋白表达量为指标，或受检者乳腺癌组织样本中TLCD1 mRNA或蛋白表达量与对照组织比较值为指标，如指标超过设定阈值，则判定为骨转移。

实施例2、TLCD1高表达预示着无骨转移生存时间短

将231例无骨转移乳腺癌组织样本按照TLCD1表达量中位值分为TLCD1高表达组和TLCD1低表达组，结合乳腺癌组织样本的患者随访数据进一步分析无骨转移生存时间，结果如图2所示，TLCD1高表达组的无骨转移生存时间更多。

以上结果表明：TLCD1高表达预示着无骨转移生存时间短，因此，可以通过检测TLCD1表达水平，以无骨转移生存时间作为预后指标，来预测是否有乳腺癌骨转移倾向；例如，以受检者乳腺癌组织样本中TLCD1 mRNA或蛋白表达量为指标，或受检者乳腺癌组织样本中TLCD1 mRNA或蛋白表达量与对照组织比较值为指标，如指标超过设定阈值，则判定为骨转移风险较大，生存时间较短。

实施例3、下调TLCD1基因表达能抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭

利用具有下调TLCD1基因表达功能的RNA干扰质粒及对照质粒分别转染MDA-MB-231或MCF-7细胞，结果如图3所示，转染了RNA干扰质粒的MDA-MB-231和MCF-7细胞中TLCD1基因的mRNA及蛋白表达量显著下调。

将转染后的MDA-MB-231和MCF-7细胞分别进行侵袭和迁移实验，结果图4所示，转染了RNA干扰质粒的MDA-MB-231和MCF-7细胞的迁移和侵袭能力受到显著抑制。

以上结果表明，下调TLCD1基因表达能抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭。

实施例4、下调TLCD1基因表达能抑制小鼠乳腺癌骨转移

将转染后的MDA-MB-231和MCF-7细胞分别用于乳腺癌骨转移动物模型，结果分别如图5和图6所示，BLI成像及signal结果说明RNA干扰质粒能够抑制乳腺癌骨转移，X射线结果说明RNA干扰质粒能够减少溶骨性病变，胫骨肿瘤切片染色结果说明RNA干扰质粒能够降低骨中的肿瘤负荷，此外，转染了RNA干扰质粒的小鼠骨转移评分更低、无骨转移生存时间更长，总生存时间也更长。

实施例3和4的结果表明，无论体外还是体内，下调TLCD1基因表达功能的RNA干扰质粒能够抑制乳腺癌迁移和侵袭，从而抑制乳腺癌骨转移，因此，可以通过抑制TLCD1基因表达的物质或者抑制TLCD1蛋白发挥功效的物质能够抑制乳腺癌骨转移，用于预防和治疗乳腺癌骨转移。