从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱、制备方法及用途

摘要

本发明提供一种从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱、制备方法及用途，其制备方法包括如下步骤：将干燥的红三叶草粉碎，置于乙醇中浸泡后，加热回流提取，将滤液在低温环境下干燥至无醇味，得红三叶草总稠膏；红三叶草总稠膏，均匀分散在HCl溶液中，超声并静置，过滤得上清液；上清液用有机溶剂萃取得到稠膏；依次用石油醚‑乙酸乙酯洗脱系统、环己烷‑乙酸乙酯洗脱系统、甲醇进行洗脱，最后用乙腈反复洗脱得到该化合物。该化合物结构新颖、制备方法简便，具有显著的抗血小板聚集作用，具有较高的药用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱、制备方法及用途。

背景技术

红三叶草(Trifolium pratense L.)是豆科(Leguminosae)三叶草属多年生牧草，又名红车轴草、红荷兰翘摇等。原产于小亚细亚与东南欧，广泛分布于温带及亚热带地区。在我国的新疆、青海、吉林和云贵高原均有大量分布。近年来，有关红三叶草的研究日益受到重视，研究发现红三叶草含有异黄酮类、挥发油类、含硒化合物、粗蛋白、以及钙、钾、镁、磷、维生素、烟酸等多种营养成分。现代医学研究发现红三叶草具有调节激素平衡、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、消炎、防治骨质疏松等多方面的药理作用，因而具有非常广阔的开发前景。

血小板是由巨核细胞产生，在初期止血和血栓形成中起着重要作用。血小板的活化在动脉粥样硬化和动脉血栓以及其他的心脑血管疾病的发生发展中具有重要作用，因此目前抗血小板治疗已成为预防和治疗动脉系统血栓的重要策略。传统采用阿司匹林药物来进行抗血小板治疗，但是阿司匹林存在较大的副作用且抗血小板治疗效果并不高效。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱、制备方法及用途，该化合物制备方法简便，具有显著的抗血小板聚集作用，具有较高的药用价值。

为解决上述技术问题，本发明提供一种从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱，该化合物的化学结构如下：

上述从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱的制备方法，包括如下步骤：

S1、将干燥的红三叶草粉碎，置于90～100％乙醇中浸泡18～22小时后，加热回流提取3次，每次2～4小时，将滤液在低温环境下干燥至无醇味，得红三叶草总稠膏；

S2、将步骤S1得到的红三叶草总稠膏，均匀分散在0.8％～1.2％HCl溶液中，超声波提取45～60分钟，静置15～20小时，过滤得上清液；

S3、将步骤S2得到的上清液用氨水调至pH＝10.0～13.0，依次用有机溶剂萃取，将各萃取液浓缩干燥得到稠膏；

S4、将活性部位即步骤S3中的稠膏用石油醚溶解，湿法上硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统进行洗脱；

S5、将步骤S4中的洗脱产物用环己烷溶解，湿法上硅胶柱，用环己烷-乙酸乙酯洗脱系统进行洗脱；

S6、将步骤S5中得到的洗脱产物用100％甲醇溶解，上Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇洗脱；

S7、将步骤S6中得到的洗脱产物用100％乙腈溶解，上Toyopearl HW-40凝胶柱，用95％乙腈反复洗脱，最终得到该化合物。

进一步的，步骤S1中低温环境为40～50℃。

进一步的，步骤S3中有机溶剂采用氯仿或丙酮。

进一步的，步骤S4中硅胶柱的目数为100～200目。

进一步的，步骤S4中石油醚-乙酸乙酯洗脱系统所采用的石油醚与乙酸乙酯的比例为20:1～6:1。

进一步的，步骤S5中硅胶柱的目数为200～300目。

进一步的，步骤S5中环己烷-乙酸乙酯洗脱系统所采用的环己烷与乙酸乙酯的比例为15:1～9:1。

进一步的，所述步骤S6中使用甲醇洗脱所采用的甲醇浓度为95％～100％。

进一步的，本发明的从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱具有抗血小板聚集作用。

本发明的有益效果：

该化合物结构新颖、制备方法简便，具有显著的抗血小板聚集作用，具有较高的医用价值，可以用来制备毒副作用小、药效强、选择性好的新型抗血小板药物；

该化合物通过Born比浊法测定血小板聚集率，在使用相同剂量的情况下，效果好于阿司匹林；

该化合物纯植物提取，在做药物时对人体副作用较小，且使用更小的剂量就能达到目前抗血小板凝聚药物的效果，更是减小了副作用；

该化合物从红三叶草中分离提取，原材料价格便宜，制备的化合物成本较低，利于药物研发后进行大规模推广使用。

附图说明

图1为本发明化合物的制备流程图；

图2为本发明实施例五化合物的制备检验流程图；

图3为本发明化合物的偶联相关图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图1-3，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

本发明提供了一种从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱的制备方法，包括如下步骤：

S1、将干燥的红三叶草粉碎，置于用95％乙醇中浸泡20小时后，加热回流提取3次，每次3小时，将滤液在低温环境下干燥至无醇味，得红三叶草总稠膏；

S2、将步骤S1得到的红三叶草总稠膏，均匀分散在1.0％HCl溶液中，超声50分钟，静置18小时，过滤得上清液；

S3、将步骤S2得到的上清液用氨水调至pH＝12，依次用有机溶剂萃取，有机溶剂采用氯仿或丙酮，将各萃取液浓缩干燥得到氯仿稠膏或丙酮稠膏，采用Born比浊法测定氯仿稠膏和丙酮稠膏的血小板聚集率；

S4、将活性部位即步骤S3中的稠膏用石油醚溶解，湿法上硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统进行洗脱；

S5、将步骤S4中的洗脱产物用环己烷溶解，湿法上硅胶柱，用环己烷-乙酸乙酯进行洗脱；

S6、将步骤S5中得到的洗脱产物用100％甲醇溶解，上Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇洗脱；

S7、将步骤S6中得到的洗脱产物用100％乙腈溶解，上Toyopearl HW-40凝胶柱，用95％乙腈反复洗脱，最终得到该化合物。

进一步的，步骤S1中低温环境为45℃。

进一步的，步骤S4中硅胶柱的目数为150目。

进一步的，步骤S4中石油醚-乙酸乙酯洗脱系统所采用的石油醚与乙酸乙酯的比例为20:1～6:1。

进一步的，步骤S5中硅胶柱的目数为250目。

进一步的，步骤S5中环己烷-乙酸乙酯洗脱系统所采用的环己烷与乙酸乙酯的比例为15:1～9:1。

进一步的，所述步骤S6中使用甲醇洗脱所采用的甲醇浓度为95％～100％。

进一步的，本发明的从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱具有抗血小板聚集作用。

实施例一对步骤S3中的有机溶剂选择进行测定，通过Born比浊法测定氯仿稠膏和丙酮稠膏的血小板聚集率，最终确定氯仿稠膏抗血小板凝聚作用更好。

实施例二

本发明提供了从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱的制备方法，包括如下步骤：

S1、将干燥的红三叶草粉碎，置于用95％乙醇中浸泡20小时后，加热回流提取3次，每次3小时，将滤液在低温环境下干燥至无醇味，得红三叶草总稠膏；

S2、将步骤S1得到的红三叶草总稠膏，均匀分散在1.0％HCl溶液中，超声50分钟，静置18小时，过滤得上清液；

S3、将步骤S2得到的上清液用氨水调至pH＝12，依次用有机溶剂萃取，将各萃取液浓缩干燥得到稠膏；

S4、将活性部位即步骤S3中的稠膏用石油醚溶解，湿法上硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统进行梯度洗脱，梯度选择为20:1、12:1、9:1、6:1，对应A、B、C、D四个馏分；

S5、将步骤S4中的洗脱产物用环己烷溶解，湿法上硅胶柱，用环己烷-乙酸乙酯进行洗脱；

S6、将步骤S5中得到的洗脱产物用100％甲醇溶解，上Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇洗脱；

S7、将步骤S6中得到的洗脱产物用100％乙腈溶解，上Toyopearl HW-40凝胶柱，用95％乙腈反复洗脱，最终得到该化合物。

进一步的，步骤S1中低温环境为45℃。

进一步的，步骤S3中有机溶剂采用氯仿。

进一步的，步骤S4中硅胶柱的目数为150目。

进一步的，步骤S5中硅胶柱的目数为250目。

进一步的，步骤S5中环己烷-乙酸乙酯洗脱系统所采用的环己烷与乙酸乙酯的比例为9:1。

进一步的，所述步骤S6中使用甲醇洗脱所采用的甲醇浓度为100％。

进一步的，本发明的从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱具有抗血小板聚集作用。

该实施例对石油醚-乙酸乙酯洗脱系统中石油醚与乙酸乙酯的比例进行试验，通过Born比浊法测定各个馏分对血小板聚集率，最终确定B馏分抗血小板凝聚作用最好。

实施例三

本实施例提供了一种从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱的制备方法，包括如下步骤：

S1、将干燥的红三叶草粉碎，置于用95％乙醇中浸泡20小时后，加热回流提取3次，每次3小时，将滤液在低温环境下干燥至无醇味，得红三叶草总稠膏；

S2、将步骤S1得到的红三叶草总稠膏，均匀分散在1.0％HCl溶液中，超声50分钟，静置18小时，过滤得上清液；

S3、将步骤S2得到的上清液用氨水调至pH＝12，依次用有机溶剂萃取，将各萃取液浓缩干燥得到稠膏；

S4、将活性部位即步骤S3中的稠膏用石油醚溶解，湿法上硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统进行洗脱，石油醚-乙酸乙酯比例为12:1；

S5、将步骤S4中的洗脱产物用环己烷溶解，湿法上硅胶柱，用环己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱，梯度选择为15:1、11:1、9:1，得到B-1、B-2、B-3三个亚馏分；

S6、将步骤S5中得到的洗脱产物用100％甲醇溶解，上Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇洗脱；

S7、将步骤S6中得到的洗脱产物用100％乙腈溶解，上Toyopearl HW-40凝胶柱，用95％乙腈反复洗脱，最终得到该化合物。

进一步的，步骤S1中低温环境为45℃。

进一步的，步骤S3中有机溶剂采用氯仿。

进一步的，步骤S4中硅胶柱的目数为150目。

进一步的，步骤S5中硅胶柱的目数为250目。

进一步的，所述步骤S6中使用甲醇洗脱所采用的甲醇浓度为100％。

进一步的，本发明的从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱具有抗血小板聚集作用。

该实施例对环己烷-乙酸乙酯洗脱系统中环己烷与乙酸乙酯的比例进行试验，通过Born比浊法测定各个馏分对血小板聚集率，最终确定B-3亚馏分抗血小板凝聚作用最好。

实施例四

本实施例提供了一种从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱的制备方法，包括如下步骤：

S1、将干燥的红三叶草粉碎，置于用95％乙醇中浸泡20小时后，加热回流提取3次，每次3小时，将滤液在低温环境下干燥至无醇味，得红三叶草总稠膏；

S2、将步骤S1得到的红三叶草总稠膏，均匀分散在1.0％HCl溶液中，超声50分钟，静置18小时，过滤得上清液；

S3、将步骤S2得到的上清液用氨水调至pH＝12，依次用有机溶剂萃取，将各萃取液浓缩干燥得到稠膏；

S4、将活性部位即步骤S3中的稠膏用石油醚溶解，湿法上硅胶柱，用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统进行洗脱，石油醚-乙酸乙酯比例为12:1；

S5、将步骤S4中的洗脱产物用环己烷溶解，湿法上硅胶柱，用环己烷-乙酸乙酯进行洗脱，环己烷-乙酸乙酯的比例为9:1；

S6、将步骤S5中得到的洗脱产物用100％甲醇溶解，上Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇洗脱，洗脱所采用的甲醇浓度为95％和100％，从而得到B-3-1和B-3-2两个次馏分；

S7、将步骤S6中得到的洗脱产物用100％乙腈溶解，上Toyopearl HW-40凝胶柱，用95％乙腈反复洗脱，最终得到该化合物。

进一步的，步骤S1中低温环境为45℃。

进一步的，步骤S3中有机溶剂采用氯仿。

进一步的，步骤S4中硅胶柱的目数为150目。

进一步的，步骤S5中硅胶柱的目数为250目。

进一步的，所述步骤S6中使用甲醇洗脱所采用的甲醇浓度为100％。

进一步的，本发明的从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱具有抗血小板聚集作用。

该实施例对步骤S6中洗脱所采用的甲醇浓度进行试验，通过Born比浊法测定各个馏分对血小板聚集率，最终确定B-3-2馏分抗血小板凝聚作用最好。

实施例五

本实施例提供了一种从红三叶草中分离的新异喹啉生物碱的制备方法，包括如下步骤：

S1、将干燥的红三叶草(9.5千克)粉碎，置于用95％乙醇中浸泡20小时后，加热回流提取3次，每次3小时，将滤液在低温(45℃)干燥至无醇味，得红三叶草总稠膏(860.5克)；

S2、将步骤S1得到的红三叶草总稠膏，均匀分散在1.0％HCl溶液中，超声50分钟，静置18小时，过滤得上清液；

S3、将步骤S2得到的上清液用氨水调至pH＝12.0，依次用有机溶剂：氯仿、丙酮萃取，将各萃取液浓缩干燥得到氯仿稠膏(45.5克)、丙酮稠膏(288.6克)；

S4、采用Born比浊法测定氯仿和丙酮的血小板聚集率，结果表明氯仿稠膏具有显著的抗血小板聚集作用；

S5、将活性部位(氯仿稠膏)用石油醚溶解，湿法上硅胶柱(150目)，用石油醚-乙酸乙酯(20:1→12:1→9:1→6:1)洗脱系统进行梯度洗脱，分别得到A(6.5克)、B(12.8克)、C(15.3克)、D(8.4克)4个馏分；

S6、再次利用Born比浊法测定A、B、C、D馏分的血小板聚集率，确定馏分B具有显著的的抗血小板聚集作用，将步骤S5得到的B馏分(活性馏分)用环己烷溶解，湿法上硅胶柱(250目)，用环己烷-乙酸乙酯(15:1→11:1→9:1)进行梯度洗脱，得到B-1(2.8克)、B-2(5.4克)、B-3(3.2克)3个亚馏分；

S7、将步骤S6得到的亚馏分B-3用100％甲醇溶解，上Sephadex LH-20凝胶柱，用95％和100％甲醇梯度洗脱，分别得到B-3-1(1.1克)、B-3-2(1.8克)2个次馏分；

S8、将步骤S7得到的次馏分B-3-2用100％乙腈溶解，上Toyopearl HW-40凝胶柱，用95％乙腈反复洗脱，最终得到单体化合物(10.25毫克)。

该实施例为一个完整的制备和试验过程，所得化合物为无色固体(溶于甲醇)，HR-ESI-MS m/z 360.1071[M+Na]⁺提示其分子组成为C₂₁H₂₃NO₃(calcd.for>21H₂₃NO₃Na，360.1039)。化合物的UV(MeOH)λ_max:215，285，308，355nm；IRν_max:3208，1615，1509，1415，1323，1136cm^-1；化合物的¹H>3COCD₃，400MHz)和¹³C>3COCD₃，100MHz)数据见下表。综合运用化合物的IR、MS、NMR、UV等波谱数据并结合化合物的HMBC、¹H-¹H>

该化合物的¹H>13C>

采用Born比浊法来测定血小板聚集率

首先配置溶液，先配置磷酸盐缓冲液(PBS)，称取NaCl(4.0g)，KH₂PO₄(0.2g)，NaH₂PO₄·12H₂O(1.5g)，KCl(0.1g)，用蒸馏水溶解后定溶于500mL容量瓶中，摇匀，即得pH约为7.4的缓冲溶液。称取柠檬酸钠(3.8g)，用PBS溶液溶解后，定容于100mL的容量瓶中，摇匀，即为3.8％柠檬酸钠溶液。称取阿司匹林(0.5g)，用PBS溶液溶解后，定容于25mL的容量瓶中，摇匀，得到0.1mol·L^-1的Aspirin溶液。

ADP溶液的配制

称取1.8mg二磷酸腺苷(ADP)，用PBS溶液溶解后，定容于25mL的容量瓶中，摇匀，得到80.0μmol·L^-1的ADP溶液。

AA溶液的配制

将10.0mg花生四烯酸(AA)用适量的乙醇溶解，将PBS溶液稀释定容至25mL的容量瓶中，得到1.3mmol·L^-1的花生四烯酸溶液，使用PBS继续稀释至所需浓度100.0μmol·L^-1。

制备血浆样品

将雄性新西兰兔(2-3kg)静脉注射浓度为1％的戊巴比妥钠溶液(2.5mL·kg^-1)麻醉，颈动脉插管法取血，用3.8％柠檬酸钠抗凝(柠檬酸钠与取血量的比例为1:9)。在1500r·min^-1转速下离心5min，此时得到的上清液为富血小板血浆(PRP)；余下的血浆在3000r·min^-1转速下继续离心10min，此时上层的血浆就是贫血小板血浆(PPP)，且使用PPP调整PRP的血小板个数。

在样品池中加入180μL PRP、10μL样品溶液和搅拌磁子，在37℃预热5min；测量血浆中血小板的数量，控制在45万/mm³左右，迅速加入诱导剂ADP或者AA，样品溶液为本发明的化合物或阿司匹林溶液，用阿司匹林作为阳性对照药。本发明的化合物溶液用甲醇制备，配多种浓度进行测量，取最优值，观察并记录5min内的血小板聚集情况，记录样品组的血小板最大聚集率。

在样品池中加入180μL PRP、10μL空白溶液(ADP作为诱导剂时，空白溶液为0.5％DMSO；AA作为诱导剂时，空白溶液为DMSO和乙醇的混合溶液)和搅拌磁子，在37℃预热5min；测量血浆中血小板的数量，控制在45万/mm³左右，迅速加入诱导剂ADP或者AA。观察并记录5min内的血小板聚集情况，记录空白组的血小板最大聚集率。血小板聚集抑制率的计算公式：血小板聚集抑制率(％)＝[(空白组的最高聚集率-样品组的最高聚集率)/空白组的最高聚集率]×100％。

该化合物抗血小板聚集活性的IC₅₀值如下

当诱导剂为ADP时，化合物对血小板聚集表现出较好的抑制活性，其IC₅₀值为：26.45±1.35μM；当诱导剂为AA时，化合物对血小板聚集有一定的抑制活性，其IC₅₀值为：10.13±0.16μM。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。