一种利用吧哈伊姆新鞘氨醇菌提高锌污染土壤植物修复效率的方法

摘要

本发明公开了一种利用吧哈伊姆新鞘氨醇菌提高锌污染土壤植物修复效率的方法，包括如下步骤：将拟南芥种植于Zn污染土壤中，在拟南芥生长过程中，定期向所述Zn污染土壤中接种吧哈伊姆新鞘氨醇菌(Novosphingobium barchaimii)菌液。在Zn污染土壤拟南芥生长过程中，采用本方法能显著促进拟南芥对土壤内Zn的吸收与积累。可使Zn污染土壤中拟南芥体内Zn含量明显增加41‑106％，Zn的单株积累量提高100‑250％。大幅缩短中轻度污染地区的植物修复时间，使该地区的植物修复技术更具可行性。

说明书

技术领域

本发明涉及土壤修复技术领域，具体涉及一种利用吧哈伊姆新鞘氨醇菌提高锌污染土壤植物修复效率的方法。

背景技术

随着社会经济的迅猛发展、工业和城市污染的大幅排放、农用化学物质的大规模使用，大量重金属不可避免地进入环境，最终导致土壤重金属污染问题十分严峻。2014年《全国土壤污染状况调查公报》数据显示，我国土壤重金属锌(Zn)污染物点位超标率已达0.9％。其中，轻微、轻度、中度和重度超标点位分别占了0.75％、0.08％、0.05％和0.02％。土壤Zn含量的超标，会引起植物体积累过量的Zn，不仅引起农作物品质下降，更因食物链的迁移作用严重威胁人类机体健康。例如，如人体长期摄取过量Zn会影响脑发育，增加高血压和冠心病等疾病患病风险。因此，土壤Zn污染的治理备受关注。

传统Zn污染土壤的修复技术，如工程措施法(客土、换土等)虽然可有效的处理污染土壤，但是工程量大且费用较高；化学修复法(添加改良剂、淋洗等)虽然周期短，但是该方法不仅容易破坏土壤微团聚体结构，引起土壤中某些营养元素的沉淀和淋失，更有可能引入二次污染。近年来，兴起的植物修复技术以其原位、经济、绿色等优点而受到人们的关注。然而，该方法最大的缺陷是治理效率低下。例如，Li等(Environmental Pollution,2014,189(12):176-183)的研究发现超富集植物伴矿景天能显著降低酸性土壤(含Zn476mg/kg)与碱性土壤(含Zn 1308mg/kg)中重金属Zn的含量。但以“中国土壤环境标准”农业土壤标准衡量，该研究中酸性与碱性土壤中的Zn含量分别需1.2年和18.2年才能达标。由此可见，超积累植物富集重金属的方式具有长期性的特点。如何进一步优化这些超级累植物的富集能力已成为植物修复技术的研究热点。

目前，很多研究开始关注利用微生物联合超积累植物修复污染土壤的方法，以此提高植物的修复效率。如，添加复合微生物菌制剂(主要成分为巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium、胶质芽孢杆菌Bacillus mucilaginosus和柠檬酸杆菌Citrobacter)可使含Zn量分别为97.4、300、600、900mg/kg的土壤中苋菜体内Zn的富集量提高47.73％、33.8％、29.99％和41.17％(张宗迪等.上海交通大学学报(农业科学版),2017,35(1):70-75)；反硝化利斯特氏菌(Listeria denitrificans)配施可使印度荠菜地上部对Zn的吸收量提高9％-15.1％(芦小军等.农业环境科学学报,2010,29(7):1315-1319)。值得注意的是，这些研究中所采用的菌剂大多是通过改变土壤重金属的活性来提高植物的修复效率。如，洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)可分泌有机酸使pH从7下降至2.93，引起可溶性Zn含量从13％增加至72％(Li等.Plant&Soil,2010,326(1-2):453-467)。因而，当矿区土壤中接种该菌后，可使超级累植物东南景天的地上部分富集更多的Zn。另外，微生物也可通过氧化还原耦合协同代谢过程改变重金属形态，如Beolchini等曾报道，接种铁还原菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)和铁硫氧化细菌(Acidithiobacillus thiooxidans)可使Zn的移动性显著提高90％(Beolchini等.Chemosphere,2009,74(10):1321-1326)。由此可见，这些微生物主要通过分泌产物(如有机酸)或氧化还原作用活化植物根际重金属，从而改变重金属的生物有效性来促进植物对重金属的积累。然而，这类菌在土壤中定殖后可能会影响土壤酸碱度等理化性质，不利于该地区的可持续性农业生产。因此，寻找一种对土壤重金属有效性不存在显著影响，但可通过调控重金属进入植物根系效率的技术方法，可能更适合中轻度污染地区的植物修复。

发明内容

提供一种在Zn污染土壤中配施吧哈伊姆新鞘氨醇菌的方法，在不改变土壤基本理化性质及Zn有效性的前提下，用于促进植物吸收土壤中的Zn，达到提高Zn污染土壤植物修复的效果。

一种利用吧哈伊姆新鞘氨醇菌提高Zn污染土壤植物修复效果的方法，包括如下步骤：将对锌有较强吸收能力的拟南芥种植物植于Zn污染土壤中，在拟南芥生长过程中，定期向所述Zn污染土壤中接种吧哈伊姆新鞘氨醇菌(Novosphingobium barchaimii)菌液。

植物根系吸收土壤中的Zn离子，主要是通过根系质膜上的转运体进入植物细胞。本发明发现，土壤中定殖吧哈伊姆新鞘氨醇菌后能够大幅促进拟南芥与Zn转运相关的通道表达，增加拟南芥对Zn²⁺的转运效率，提高Zn在植物地上部的积累率，从而实现促进积累植物修复Zn污染土壤的效果。

在Zn污染土壤拟南芥生长过程中，采用本方法能显著促进拟南芥对土壤内Zn的吸收与积累。可使Zn污染土壤中拟南芥Zn含量增加41-106％，拟南芥体内Zn的单株积累量增加100-250％。大幅缩短中轻度污染地区的植物修复时间，使该地区的植物修复技术更具可行性。优选地，所述吧哈伊姆新鞘氨醇菌为保藏号为CICC 24073的吧哈伊姆新鞘氨醇菌。通过向保藏中心购买获得。

优选地，所述吧哈伊姆新鞘氨醇菌菌液接种至拟南芥根部土壤表层深0.4～0.6cm处。

优选地，所述吧哈伊姆新鞘氨醇菌菌液中细胞浓度约为1×10⁷～1×10⁸CFU/mL。

优选地，每株拟南芥根部每次接种1.5～2.5mL菌液，每周接种一次，共接种3～5次。最优选地，在每株拟南芥根部的土壤表层深0.5cm处接种2mL上述菌液；每周配施一次，共配施4次。每周接种一次，保证土壤中活菌数量保持在5×10⁶～18×10⁶CFU/g，若两周或以上接种一次，则菌数量下降导致修复效果降低。

优选地，所述拟南芥采用双叶龄拟南芥幼苗，其根长为1-1.5cm。移植幼苗采用双叶龄拟南芥，若幼苗过小，则其在土壤中不易存活；幼苗过大则根长过长不易移植，因此培养基中生长7-10日(即双叶龄)最适移植。更为重要的是，若幼苗过大后移栽会导致菌剂联合修复效果降低。

优选地，所述Zn污染土壤中含水率保持在60-70％。

优选地，拟南芥生长周期内控制光周期12h/24～26℃/天，12h/20～22℃/夜，光照强度50-60μmol>-2s^-1。进一步优选地，光周期12h/25℃/天，12h/22℃/夜，光照强度50-60μmol>-2s^-1，此条件适合拟南芥营养生长。

优选地，所述拟南芥为编码蛋白磷酸酶的ABI缺失敏感型突变体或野生型拟南芥Colombia-0。ABI缺失突变体在野生型拟南芥Colombia-0基础上通过T-DNA插入法得到。

优选地，所述锌污染土壤中Zn浓度为100～1000mg/kg；进一步优选为150～500mg/kg。Zn浓度过高拟南芥植物生长胁迫受抑严重，修复效果下降；Zn浓度过低，接菌处理与对照处理植物Zn积累量差异不显著。

本发明具有如下有益效果：

1)当使用本方法时，可使Zn污染土壤的拟南芥Zn含量增加41-106％。这说明，本方法可大幅度提高Zn污染土壤中修复植物体内的Zn含量。

2)当使用本方法时，可使Zn污染土壤中单株拟南芥体内Zn积累量提高100-250％，即修复效率可提高1-2.5倍。这说明，联合此菌可有效缩短污染土壤植物修复的时间。

综上所述，发明人经大量研究发现本方法可在不改变土壤中Zn有效性的前提下促进植物对Zn的吸收，从而促进植物修复土壤Zn污染的效率，有望为植物-微生物修复重金属污染土壤研究提供新的方法。

具体实施方式

实施例1

本试验土壤(理化性质：pH 6.3、35g/kg N、25g/kg P、45g/kg K)由营养土(Klasmann-deilmannGmbh)、蛭石和珍珠岩按6:3:1比例混匀(v/v)后经高压灭菌(121℃，30min)所得。取自然风干土壤加入硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)溶液混匀得到含150mg/kg>

供试植株为野生型拟南芥Colombia-0及编码蛋白磷酸酶的ABI敏感型突变体拟南芥种子用75％酒精进行表面消毒15min后用无菌水冲洗两次，种植于含0.8％琼脂的MS培养基的培养皿中发芽。MS培养基成分如下：KNO₃>4NO₃>2PO₄>4·7H₂O>2·2H₂O>3BO₃>4·4H₂O22.3mg/L、ZnSO₄·7H₂O>2MoO₄·2H₂O>4·5H₂O>2·6H₂O>2EDTA>4·7H₂O>

各培养箱中分别进行如下操作：

(1)移栽双叶龄拟南芥幼苗(根长约1-1.5cm)于培养箱土壤中；

(2)土壤含水率保持60-70％，每隔2d补水一次。人工气候室条件：光周期12h/25℃/天，12h/22℃/夜，光照强度50-60μmol>-2s^-1。

(3)拟南芥移植培养箱两周后，接入吧哈伊姆新鞘氨醇菌(中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号CICC 24073)。菌剂的培养与处理方法：将上述菌种接入液体培养基中(胰蛋白胨15g、大豆胨5g、氯化钠5g、琼脂13g、蒸馏水1L，pH 7.3±0.2，121℃灭菌30min)活化摇菌。活化摇菌的工艺条件：将接种后的菌种瓶放置于恒温震荡箱内摇菌活化3d(转速150r/min、温度28℃)；②取菌液于4000r/min离心5min，弃上清液后加入10mL 0.9％生理盐水涡旋混匀后离心洗涤两次，弃上清液加生理盐水摇匀后细胞浓度约为1×10⁸CFU/mL。在每株拟南芥根部的土壤表层深0.5cm处接种2mL上述菌液。每周配施一次，共配施4次。

(4)拟南芥于温室培养架种植1.5个月后收获(低温(8-15℃)下种植2个月，15-30℃则种植1.5个月即可)。取地上部杀青并烘干至恒重后记录干重，并用HNO₃/HCl(3:1，v/v)在200℃条件下将植株消解至溶液澄清。样品冷却后用1％硝酸定容至10mL，随后用火焰原子吸收分光光度计(ICE>

野生型拟南芥和敏感型拟南芥叶片Zn含量(按干重计，下同)和单株累积量的结果分别如表1和表2所示：

表1土壤Zn处理浓度为150mg/kg时野生型拟南芥地上部Zn含量及积累量

表2土壤Zn处理浓度为150mg/kg时敏感型突变体地上部Zn含量及积累量

实施例2

将实施例1中的“含Zn 150mg/kg的土壤”改成“含Zn 250mg/kg的土壤”，其余同实施例1。所得结果如表3和表4：

表3土壤Zn处理浓度为250mg/kg时野生型拟南芥地上部Zn含量及积累量

表4土壤Zn处理浓度为250mg/kg时敏感型突变体地上部Zn含量及积累量

实施例3

将实施例1中的“含Zn 150mg/kg的土壤”改成“含Zn 500mg/kg的土壤”，其余同实施例1。所得结果如表5和表6：

表5土壤Zn处理浓度为500mg/kg时野生型拟南芥地上部Zn含量及积累量

表6土壤Zn处理浓度为500mg/kg时敏感型突变体地上部Zn含量及积累量

以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但本发明专利的技术特征并不局限于此，任何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。