一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒

摘要

本发明涉及动物疫病检测技术领域，特别涉及一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒。该试剂盒包括：p27蛋白、GroEL‑Δ8‑1蛋白、酶标记的第二抗体、BSA、包被液、封闭液、显色液和终止液。本发明用禽白血病病毒保守区p27的原核表达蛋白和鸡白痢沙门氏菌优势抗原GroEL的截短体GroEL‑Δ8‑1的原核表达蛋白为包被抗原开发出能够同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的间接ELISA试剂盒，本发明的试剂盒能够同时检测禽白血病和鸡白痢，只要检测为阳性的鸡即淘汰，达到同时净化的目的，极大地减轻临床检测净化的工作。

说明书

技术领域

本发明涉及动物疫病检测技术领域，特别涉及一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒。

背景技术

禽白血病(Avian Leukosis)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)和禽肉瘤病病毒(Avian Sarcoma Virus,ASV)群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。该病对鸡能引起许多种具有传染性的良性和恶性肿瘤。自1868年Roloff报道鸡淋巴肉瘤以来，禽白血病已分布于世界各地，我国也有自然病例发生。该病可引起鸡只增重缓慢、性成熟延迟、蛋小、蛋壳薄、产蛋量下降、受精率和孵化率低、胴体废弃率增加、死亡率增高等，造成直接经济损失。同时还可引起机体非特异性抵抗力下降和免疫抑制，造成间接经济损失。由于该病能垂直传播，因此对养禽业危害很大，是危害养鸡业的主要疾病之一。

鸡白痢(Pullorum Disease)是由鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum,SP)引起的，以雏鸡为主要感染对象，以排白色粪便和产蛋下降为主要特征，可致产前各日龄鸡败血性伤寒症的禽类急性传染病。鸡白痢沙门氏菌的传播方式呈多样性，不仅可通过饲料、空气、饮水、鼠类等进行水平传播，也可通过产带菌卵进行垂直传播，孵化出的病雏绒毛中携带的大量病原菌，可污染饮水、育雏器、饲料等，通过消化道、呼吸道等感染同鸡舍的幼雏，耐过鸡只成年后再排带菌卵，由此形成复杂的传播网络。鸡白痢沙门氏菌在国内感染率高，分布广，是种禽养殖净化的重点，也是商品蛋鸡养殖重点防治的疾病。

禽白血病和鸡白痢都是可以垂直传播的传染病，对养鸡业造成严重的危害。目前控制禽白血病和鸡白痢最有效的措施是实施传染病的净化，主要通过定期对种鸡群进行检疫，淘汰阳性鸡，通过不断地净化从而选育出无禽白血病和鸡白痢的鸡群。各国在众多检测方法中，ELISA检测方法以其敏感、特异、操作方便而被广泛应用于临床检测。该法适合于基层兽医部门和鸡场对该病的诊断和血清学检测。

禽白血病病毒的p27基因是禽白血病病毒不同亚群之间的一段高度保守的基因。其编码的p27蛋白是病毒核心外壳的主要成分，其含量高，占病毒总蛋白成分的30％以上，能够诱导机体产生特异性抗体。Heat-shock protein 60(GroEL)是鸡白痢沙门氏菌重要的蛋白抗原，在鸡白痢沙门氏菌入侵机体时可诱导产生大量抗体。因此，可以用p27和GroEL作为包被抗原，建立检测禽白血病和鸡白痢抗体的间接ELISA检测试剂盒。目前主要的禽白血病和鸡白痢检测试剂盒种类如表1所示：

表1禽白血病和鸡白痢检测试剂盒统计

禽白血病和鸡白痢都是养鸡场需要净化的传染病，目前对禽白血病的净化主要是用国外ELISA试剂盒检测鸡泄殖腔拭子的禽白血病病毒抗原p27和鸡血清的禽白血病抗体，对鸡白痢的净化主要用平板凝集试验检测鸡血清的鸡白痢沙门氏菌抗体，这些试剂盒或方法都是针对单一传染病的检测，还没有一种单一试剂盒能够检测禽白血病和鸡白痢这两种病。单独检测禽白血病的试剂盒和平板凝集试验单独检测鸡白痢的方法，使临床检测净化禽白血病和鸡白痢工作耗费大量的人力、物力和财力。因此迫切需要研制出方便好用的禽白血病和鸡白痢检测试剂盒，减轻禽白血病和鸡白痢的净化工作。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒。该试剂盒能够同时检测禽白血病和鸡白痢，只要检测为阳性的鸡即淘汰，达到同时净化的目的。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒，包括：p27蛋白、GroEL-Δ8-1蛋白、酶标记的第二抗体、BSA(牛血清白蛋白)、包被液、封闭液、显色液和终止液。

本发明结合禽白血病和鸡白痢要同时净化的现状，利用ELISA(酶联免疫吸附测定)的基本原理，用禽白血病病毒保守区p27的原核表达蛋白和鸡白痢沙门氏菌优势抗原GroEL的截短体GroEL-Δ8-1的原核表达蛋白为包被抗原开发出能够同时检测禽白血病和鸡白痢的ELISA试剂盒。通过摸索最佳的p27和GroEL-Δ8-1包被条件，优化ELISA的反应条件建立同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的间接ELISA方法。与目前常用的单独检测禽白血病或鸡白痢的试剂盒相比，本发明的试剂盒能够同时检测禽白血病和鸡白痢，只要检测为阳性的鸡即淘汰，达到同时净化的目的，极大地减轻临床检测净化的工作。

作为优选，酶标记的第二抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG。

作为优选，包被液为pH为9.6的包被液。

作为优选，封闭液为脱脂乳。

优选地，封闭液为质量百分浓度为5％的脱脂乳。

作为优选，BSA为质量百分浓度为0.5％的BSA。

作为优选，显色液为TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色液。

在本发明中，p27蛋白的制备方法为：采用SEQ ID NO：1所示上游引物和SEQ IDNO：2所示下游引物扩增得到p27基因片段，将p27基因插入原核表达载体，转入表达宿主，经诱导表达、收集菌体、裂解、纯化，得到p27蛋白。

在本发明中，GroEL-Δ8-1蛋白的制备方法为：采用SEQ ID NO：3所示上游引物和SEQ ID NO：4所示下游引物扩增得到GroEL-Δ8-1基因片段，将GroEL-Δ8-1基因插入原核表达载体，转入表达宿主，经诱导表达、收集菌体、裂解、纯化，得到GroEL-Δ8-1蛋白。

作为优选，p27蛋白和GroEL-Δ8-1蛋白在包被时的总浓度为4μg/mL。

作为优选，GroEL-Δ8-1蛋白与p27蛋白在包被时的质量比为1:2。

作为优选，试剂盒还包括酶标板和/或PBST缓冲液。

本发明提供了一种同时检测禽白血病和鸡白痢的方法，包括如下步骤：

(1)抗原包被：以GroEL-Δ8-1蛋白与p27蛋白作为抗原，包被液稀释抗原，包被总浓度为0.25～8μg/mL，GroEL-Δ8-1蛋白与p27蛋白的质量比为1:0.125～1:8，4℃包被8～12h；

(2)洗涤；

(3)封闭：酶标板内加入封闭液脱脂乳，37℃封闭0.5～3h。

(4)洗涤；

(5)抗原抗体反应：用BSA稀释血清至1：50～1：800，加入酶标板内，37℃孵育30～90min；

(6)洗涤；

(7)酶标抗体反应：用BSA稀释酶标记的第二抗体母液至1：2000～1：16000，加入酶标板内，37℃孵育15～90min；

(8)洗涤；

(9)显色：将显色液加入酶标板内，在15～30℃条件下显色5～20min；

(10)终止：加入终止液终止反应；

(11)读数：检测OD450nm值；

(12)判断：当检测血清的OD450nm值大于阴阳性临界值(标准阴性样品的均值+3×标准阴性样品的标准差)，则检测血清中含有禽白血病病毒抗体或鸡白痢沙门氏菌抗体中的一种或两种。

作为优选，包被液为pH为9.6的包被液。

作为优选，封闭液为质量百分浓度为5％的脱脂乳。

作为优选，封闭的温度为37℃，封闭的时间为2h。

作为优选，BSA为质量百分浓度为0.5％的BSA。

作为优选，显色液为TMB显色液。

作为优选，p27蛋白和GroEL-Δ8-1蛋白在包被时的总浓度为4μg/mL。

作为优选，GroEL-Δ8-1蛋白与p27蛋白在包被时的质量比为1:2。

作为优选，在步骤(5)中，用BSA稀释血清至1：200，加入酶标板内，37℃孵育75min。

作为优选，在步骤(7)中，用BSA稀释酶标记的第二抗体母液至1：4000，加入酶标板内，37℃孵育45min。

作为优选，显色的时间为5min。

本发明提供了一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒。该试剂盒包括：p27蛋白、GroEL-Δ8-1蛋白、酶标记的第二抗体、BSA、包被液、封闭液、显色液和终止液。本发明具有的技术效果为：

本发明用禽白血病病毒保守区p27的原核表达蛋白和鸡白痢沙门氏菌优势抗原GroEL的截短体GroEL-Δ8-1的原核表达蛋白为包被抗原开发出能够同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的间接ELISA试剂盒。通过摸索最佳的p27和GroEL-Δ8-1包被条件，优化ELISA的反应条件建立检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的间接ELISA方法。与目前常用的单独检测禽白血病或鸡白痢的试剂盒相比，本发明的试剂盒能够同时检测禽白血病和鸡白痢，只要检测为阳性的鸡即淘汰，达到同时净化的目的，极大地减轻临床检测净化的工作。

具体实施方式

本发明公开了一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明中，包被缓冲液为pH9.6、0.05M的碳酸盐缓冲液，配方为：

在本发明中，洗涤缓冲液为pH7.4的PBST缓冲液，配方为：

在本发明中，封闭液配方为：

试剂用量

脱脂乳5g

洗涤缓冲液100mL

在本发明中，样品及二抗稀释液为0.5％的BSA，配方为：

试剂用量

牛血清白蛋白(BSA) 0.5g

洗涤缓冲液100mL

在本发明中，终止液(2M H₂SO₄)的配方为：

试剂用量

浓硫酸22mL

水178mL

本发明提供的同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

p27蛋白、GroEL-Δ8-1蛋白、HRP标记的兔抗鸡IgG母液、0.5％的BSA、包被液(pH9.6)、封闭液(5％脱脂乳)、TMB显色液、终止液、酶标板、PBST缓冲液。

试验例1

根据禽白血病病毒的p27基因构建p27重组原核表达载体，用IPTG诱导表达融合p27蛋白，镍柱纯化p27蛋白。以纯化的p27蛋白和GroEL-Δ8-1蛋白为包被抗原，通过摸索最佳的包被条件、封闭条件、血清稀释比例及作用时间、二抗稀释度及作用时间和显色时间，建立检测禽白血病和鸡白痢两种抗体的间接ELISA方法，并对所建立的方法的有效性进行验证。具体技术方案：

1.p27蛋白和GroEL-Δ8-1蛋白的制备

(1)禽白血病病毒p27原核表达载体的构建及蛋白表达纯化

根据Genbnak中己登录的禽白血病基因全序列(M37980)中p27基因的序列设计带酶切位点的特异性引物：

上游引物(SEQ ID NO：1)：CGGGATCCATGCCTGTAGTGATTAAGAC；

下游引物(SEQ ID NO：2)：CGCTCGAGCTAGGGCTGGATAGCAGACG。

PCR扩增p27基因片段，用酶切酶连的方法将p27基因插入pET-30a原核表达载体。将测序正确的pET-30a-p27转化入Transetta(DE3)，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6至0.8，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，37℃，200rpm诱导表达6h，离心收集菌体。菌体经超声裂解(超声功率比35％，超声2秒，暂停2s，超声时间(包含超声和暂停时间)共1800秒)，后12000r/min离心20min，收取上清。用带有Ni离子的亲和层析柱对上清进行亲和层析纯化，纯化得到p27蛋白。

(2)鸡白痢沙门氏菌GroEL-Δ8-1原核表达载体的构建及蛋白表达纯化

根据Genbnak检索到的鸡白痢沙门氏菌GroEL基因序列(gene ID:CP003047.1)设计上游和下游酶切位点分别为BamH I和Xho I的特异性引物：

上游引物(SEQ ID NO：3)：CGCGGATCCCTGATCATCGCTGAAGAT；

下游引物(SEQ ID NO：4)：CCGCTCGAGTTCCATTGCACGCAGCGC。

PCR扩增GroEL-Δ8-1基因片段，用酶切酶连的方法将GroEL-Δ8-1基因插入pGEX-6p-1原核表达载体。将测序正确的pGEX-6p-1-GroEL-Δ8-1转化入Transetta(DE3)，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6至0.8，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，30℃，200rpm诱导表达10h，离心收集菌体。菌体经超声裂解(超声功率比35％，超声2秒，暂停2s，超声时间(包含超声和暂停时间)共1800秒)，后12>

2.间接ELISA检测方法的建立及条件的优化

检测方法步骤如下：

(1)抗原包被：pH9.6的包被液稀释抗原，包被总浓度为0.25～8μg/mL且GroEL-Δ8-1:p27为1:0.125～1:8，加入96孔酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜。

(2)洗涤：PBST洗板，300μL/孔，拍干，洗涤三次。

(3)封闭：酶标板内加入封闭液(5％脱脂乳、1％BSA、5％标准胎牛血清、0.7％明胶)，200μL/孔，37℃封闭0.5～3h)。

(4)洗涤：重复步骤(2)。

(5)抗原抗体反应：用0.5％的BSA稀释血清至1：50～1：800，加入酶标板内，100μL/孔，37℃孵育30～90min。

(6)洗涤：重复步骤(2)。

(7)酶标抗体反应：用0.5％的BSA稀释HRP标记的兔抗鸡IgG母液至1：2000～1：16000，加入酶标板内，100μL/孔，37℃孵育15～90min。

(8)洗涤：重复步骤(2)。

(9)显色：将TMB显色液加入酶标板内，100μL/孔。

(10)终止：室温显色5～20min，每孔加入50μL终止液终止反应。

(11)读数：提前1分钟打开酶标仪预热，设置酶标仪参数(参考波长：620nm，测量波长：450nm，震动3s，间歇2s)，读取OD450nm值。

2.1最佳抗原包被条件的确定

按p27和GroEL-Δ8-1蛋白终浓度为0.25、0.5、1、2、4和8μg/mL，并且GroEL-Δ8-1：p27蛋白比例为1:0.125、1:0.25、1:0.5、1：1、1：2、1：4和1：8的不同抗原包被条件组合，各个抗原包被组合分别用包被液稀释混合p27和GroEL-Δ8-1抗原包被酶标板，100μL/孔。每个抗原包被组合分别检测鸡白痢阳性血清和禽白血病阳性血清的效价，用0.5％BSA稀释鸡白痢阳性血清和禽白血病阳性血清，稀释度分别为1:200，1:400，1:800，1:1600，1：3200，1：6400，1：12800，1：25600，每个组合2条酶标板重复，100μL/孔，用样品稀释液作为阴性对照。其余操作按ELISA常规操作进行，计算各个抗原包被组合的血清效价值，取测出来的鸡白痢阳性和禽白血病阳性血清效价值都较高的抗原包被组合作为最佳抗原包被条件。

表2不同抗原包被条件检测ALV和SP单阳性血清的效价值

注：“*”代表检测鸡白痢阳性血清最高效价值，“^△”代表检测禽白血病阳性血清最高效价值。

表3不同抗原包被条件下检测ALV和SP单阳性血清的效价与最高效价之比

注：“*”代表检测ALV和SP单阳性血清的效价值都较高的抗原包被组合

如表2和表3，结果发现有几个抗原包被组合较好，结合效价值选取抗原包被总浓度为4μg/mL且GroEL-Δ8-1:p27为1:2作为最佳抗原包被条件。

2.2最佳封闭液和封闭时间的确定

以最佳的抗原包被浓度包被酶标板，分别用5％脱脂乳、1％BSA、5％标准胎牛血清、0.7％明胶在4℃过夜封闭，37℃封闭时间分别设为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h和3h，按照棋盘法进行布局，其余操作按ELISA常规操作进行。分别计算检测鸡白痢阳性血清和禽白血病阳性血清的P/N值，确定最佳封闭液和封闭时间。

结果对检测鸡白痢阳性血清和禽白血病阳性血清的P/N值都是以5％脱脂乳37℃封闭2h最高，因此封闭条件为5％脱脂乳37℃封闭2h。

2.3最佳血清稀释度和酶标二抗稀释度的确定

按照已优化的条件进行，以棋盘法的方式布局，血清稀释度分别设为1：50、1：100、1：200、1：400和1：800，酶标二抗稀释度分别设为1：2000、1：4000、1：8000和1：16000。分别计算检测鸡白痢阳性血清和禽白血病阳性血清的P/N值，确定最佳血清稀释度和酶标二抗稀释度。

结果对检测鸡白痢阳性血清和禽白血病阳性血清的P/N值都在血清稀释度为1：200且酶标二抗稀释度为1：4000最高，因此确定血清稀释度为1：200且酶标二抗稀释度为1：4000。

2.4一抗最佳孵育时间的确定

在已优化的反应条件下，将抗原抗体作用时间分别设为30min，45min，60min，75min，90min，其余操作按ELISA常规操作进行。分别计算检测鸡白痢阳性血清和禽白血病阳性血清的P/N值，确定抗原抗体反应的最佳时间。

结果P/N值对检测鸡白痢阳性血清和禽白血病阳性血清都是在37℃孵育75min时都较高，最终确定37℃孵育75min为一抗反应条件。

2.5酶标二抗最佳孵育时间的确定

HRP标记的兔抗鸡IgG在37℃反应，分别设置反应时间为15min，30min，45min，60min，75min，90min，比较检测鸡白痢阳性血清和禽白血病阳性血清的P/N值。

结果P/N值对检测鸡白痢阳性血清和禽白血病阳性血清都是在37℃孵育45min时最高，最终确定37℃孵育45min为二抗反应条件。

2.6显色时间的确定

根据已优化的条件进行试验，显色时间分别设为5min，8min，10min，15min，20min，比较检测鸡白痢阳性血清和禽白血病阳性血清的P/N值。

结果在显色时间为5min时对检测鸡白痢阳性血清和禽白血病阳性血清的P/N值都最高，因此确定显色时间为5min。

2.7最终确定的间接ELISA检测方法的最优条件操作方法

(1)抗原包被：pH9.6的包被液稀释抗原，包被总浓度为4μg/mL且GroEL-Δ8-1:p27为1:2，加入96孔酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜。

(2)洗涤：PBST洗板，300μL/孔，拍干，洗涤三次。

(3)封闭：酶标板内加入5％脱脂乳，200μL/孔，37℃封闭2h。

(4)洗涤：重复步骤(2)。

(5)抗原抗体反应：用0.5％的BSA稀释血清至1:200，加入酶标板内，100μL/孔，37℃孵育75min。

(6)洗涤：重复步骤(2)。

(7)酶标抗体反应：用0.5％的BSA稀释HRP标记的兔抗鸡IgG母液至1：4000，加入酶标板内，100μL/孔，37℃孵育45min。

(8)洗涤：重复步骤(2)。

(9)显色：将TMB显色液加入酶标板内，100μL/孔。

(10)终止：室温显色5min，每孔加入50μL终止液终止反应。

(11)读数：提前1分钟打开酶标仪预热，设置酶标仪参数(参考波长：620nm，测量波长：450nm，震动3s，间歇2s)，读取OD450nm值。

3.鸡白痢阳性血清和禽白血病阳性血清混合样品检测

将鸡白痢阳性血清和禽白血病阳性血清分别按照1:0、100:1、50：1、20:1、10:1、1:1、1:10、1:20、1:50、1:100和0:1的不同比例混合，分别用已优化的鸡白痢沙门氏菌抗体ELISA检测方法、禽白血病病毒抗体ELISA检测方法和鸡白痢沙门氏菌抗体与禽白血病病毒抗体ELISA共检测方法检测不同混合血清的效价。

表4以不同包被抗原检测SP阳性血清与ALV阳性血清不同混合比例的效价结果

结果跟预期的一致，如表4，单检测的ELISA方法检测血清的效价随着对应阳性血清的比例增高而不断升高，而共检测的ELISA方法检测的血清效价无显著变化，表明建立的鸡白痢沙门氏菌抗体与禽白血病病毒抗体ELISA共检测方法能很好的检测此两种病。

4.感染实验鸡血清样品检测

感染实验鸡血清：禽成髓性白血病病毒(AMV)感染组、鸡白痢沙门氏菌(SP)感染组、AMV和鸡白痢沙门氏菌共感染组和空白对照组在雏鸡感染后的1、4、7、15和21天采集的鸡血清。分别用已优化的自建的鸡白痢沙门氏菌抗体ELISA检测方法(用GroEL-Δ8-1包被)、自建的禽白血病病毒抗体ELISA检测方法(用p27包被)、自建的禽白血病病毒和鸡白痢沙门氏菌抗体ELISA共检测方法(GroEL-Δ8-1和p27共包被)、IDEXX公司生产的ALV A/B亚群和J亚群抗体检测试剂盒、鸡白痢平板凝集试验检测104份感染实验的鸡血清样品。

表5自建的禽白血病病毒和鸡白痢沙门氏菌抗体ELISA共检测方法检测感染实验血清阳性率

表6 IDEXX的ALV A/B亚群和J亚群抗体检测试剂盒与自建的禽白血病病毒抗体ELISA检测方法的符合率

表7鸡白痢平板凝集试验与自建的鸡白痢沙门氏菌抗体ELISA检测方法的符合率

表8自建的鸡白痢沙门氏菌抗体ELISA检测方法和自建的禽白血病病毒抗体ELISA检测方法跟自建的禽白血病病毒和鸡白痢沙门氏菌抗体ELISA共检测方法的符合率

表9 IDEXX的ALV A/B亚群和J亚群抗体检测试剂盒和鸡白痢平板凝集试验跟自建的禽白血病病毒和鸡白痢沙门氏菌抗体ELISA共检测方法的符合率

如表6和表7，结果IDEXX的ALV A/B亚群和J亚群抗体检测试剂盒与自建的禽白血病病毒抗体ELISA检测方法符合率达91.3％，鸡白痢平板凝集试验与自建的鸡白痢沙门氏菌抗体ELISA检测方法的符合率达90.4％，说明用p27单独包被与GroEL-Δ8-1单独包被建立的ELISA方法与商品化的检测方法符合率都较高。如表8和表9，结果p27和GroEL-Δ8-1分别单独包被与共包被比较符合率达94.2％，IDEXX的ALV A/B亚群和J亚群抗体检测试剂盒/鸡白痢平板凝集试验跟自建的禽白血病病毒和鸡白痢沙门氏菌抗体ELISA共检测方法的符合率达89.4％，表明用p27与GroEL-Δ8-1共包被建立的间接ELISA方法能够达到与商品化的检测方法的效果，并且能够同时检测禽白血病病毒和鸡白痢沙门氏菌抗体，能够检测禽白血病病毒和鸡白痢沙门氏菌的感染如表5。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种同时检测禽白血病病毒抗体和鸡白痢沙门氏菌抗体的试剂盒

<130> MP1731682

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgggatccat gcctgtagtg attaagac 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgctcgagct agggctggat agcagacg 28

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatccc tgatcatcgc tgaagat 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagt tccattgcac gcagcgc 27