一种受外源糖添加诱导表达的GSM2启动子

摘要

本发明公开了一种受外源糖添加诱导表达的GSM2启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明克隆到了拟南芥中与番茄ToTAL1同源的基因GSM2的启动子，并对其进行了序列分析及功能的验证。证实GSM2启动子序列可由ATG上游1.5kb的序列组成，该启动子不仅能够启动外源基因GUS在拟南芥和烟草中表达，并且其启动的强度可被外源糖信号所增强。本发明利用诱导型启动子代替组成型启动子，获得诱导型启动子的双元表达载体；利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得可诱导表达目的基因的转基因植株。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种受外源糖添加诱导表达的启动子。

背景技术

启动子是基因的一个组成部分，启动子可以被RNA聚合酶辨认，并开始转录。诱导型启动子不同于组成型的启动子，其只在某些信号的刺激下才启动外源基因的转录，能使目的基因的表达产物在一定时空积累，增加区域表达量，提高植株的抗逆性。一定程度上解决转基因应用中食品安全性问题，是应用植物转基因技术进行基因工程育种的理想启动子。

糖不仅作为能量和碳骨架的来源，也是调控植物生长和发育的重要信号分子。糖响应基因对于植物逆境适应具有重要意义。Caillau等人证实番茄中ToTAL1基因表达于植物中的各组织，并且能被多种信号所诱导，但未克隆ToTAL1的启动子。周勇等人发现水稻中TAL-like的蛋白大量积累于维管束中的韧皮部，推测其对维管束的发育具有重要作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种新的收外源糖添加诱导表达的启动子。

本发明的技术方案为：一种受外源糖添加诱导表达的GSM2启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

扩增SEQ ID No.1所示GSM2启动子的引物对，引物对的前向引物序列如SEQ IDNo.2所示，引物对的后向引物序列如SEQ ID No.3所示。

一种重组载体，其特征在于，含有SEQ ID No.1所示的GSM2启动子。

进一步地，所述重组载体为融合有权利要求1所述的GSM2启动子和报告基团GUS的两元表达载体。

SEQ ID No.1所示的GSM2启动子在转基因植物上的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明克隆到了拟南芥中与番茄ToTAL1同源的基因GSM2的启动子，并对其进行了序列分析及功能的验证。证实GSM2启动子序列可由ATG上游1.5kb的序列组成，该启动子不仅能够启动外源基因GUS在拟南芥和烟草中表达，并且其启动的强度可被外源糖信号所增强。本发明利用诱导型启动子代替组成型启动子，获得诱导型启动子的双元表达载体；利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得可诱导表达目的基因的转基因植株。

附图说明

图1GSM2启动子片段电泳图；

图2GSM2启动子序列，灰色背景标注为起始密码子ATG，灰色字体为部分GSM2基因序列。

图3GSM2启动子序列分析；

图4AtGSM2-GUS2转基因拟南芥植株，野生型(Col-0)与-1.5kb-AtTRA2-GUS转基因植株的表型。图片所示生长于MS培养基上7d大的幼苗。

图5AtGSM2-GUS转基因拟南芥糖处理后GUS染色分析；

图6烟草中瞬时表达AtGSM2-GUS糖处理后GUS染色分析。

具体实施方式

1.启动子克隆

从TAIR(https://www.arabidopsis.org/)数据库中下载GSM2基因DNA序列，选择ATG上游1.5kb长度作为GSM2启动子区域，设计引物(表1)。通过PCR获得GSM2启动子片段，其核苷酸序列见图2，(GSM2启动子片段电泳图如图1所示，片段长度为1500bp)，连入T-vector，通过测序获得正确无突变的GSM2启动子片段，转接入含有报告基因GUS的二元表达载体中。

表1GSM2启动子扩增所用的引物序列。

Primer namePrimer sequences(5`-3`)TRA2pro-FGGTACCTCAGGCGAAGAACAGAAGATG(SEQ>TRA2pro-RGTCGACTTTTTTCGTCGAGGGAAATACG(SEQ>

下划线所标注的序列为引入的限制性内切酶识别位点。

2.GUS染色

GUS检测试剂盒(LEAGENE)进行GUS表达分析。将需染色的植物材料用GUS染色液浸泡，37℃温育，然后用75％酒精脱色后，观察拍照。

3.转基因拟南芥植株

将构建成功的含AtGSM2-GUS的二元载体转入农杆菌中，通过花絮浸染法转入野性型拟南芥(Col-0)。收取T₀种子，通过筛选，拥有潮霉素抗性的为转基因拟南芥植株，见图4。进一步进行GUS染色鉴定(图5)。转基因拟南芥植株表型上与野生型无明显差异，并且可检测到GUS基因的表达，证明GSM2启动子序列是具有启动子功能的，并能启动外源基因的表达。

4.烟草瞬时表达

将构建成功的含AtGSM2-GUS的二元载体转入农杆菌，菌检鉴定阳性克隆。将阳性克隆扩大培养，用MS培养液将菌液稀释至OD600＝0.1。用1ml注射器将菌液注射入烟草叶片中，22℃，黑暗条件下培养三天。

5.糖诱导实验

将进行瞬时表达的烟草叶片及转基因拟南芥植株分别放入糖及MS培养液中，120rpm进行培养。收取材料进行GUS染色。结果见图6。

6.启动子序列分析

利用PLACE数据库(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)进行启动子调控元件分析，结果见表2和图3。

表2 GSM2启动子所含有的启动子必需元件及响应环境胁迫的元件汇总表

N＝A/G/C/T,W＝A/T,R＝A/G.

以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

序列表

<110>申请人名称：西南大学

<120>一种受外源糖添加诱导表达的GSM2启动子

<160>3

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>1500

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

tcaggcgaag aacagaagat gacatcaagc tggccaatag tgtggatgtt ggatccctga60

gggacccaca agaagactcg gttagggtca agaatccaga atggttagtg gttgttggag 120

tgtgcactca tttggggtgc atccccttgc ctaatgctgg tgattatggt ggttggtttt 180

gtccgtgtca cggatcacat tacgatatat ctggaagaat taggaaaggt cctgcaccat 240

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<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

ggtacctcag gcgaagaaca gaagatg27

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

gtcgactttt ttcgtcgagg gaaatacg 28