一种嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株及其应用和应用方法

摘要

本发明涉及一种嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株，所述菌株为嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)R2D2‑6.626069934，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.15478。利用该菌株可以在堆肥发酵高温期间，保持活性并大量繁殖，促进堆肥中有机物的快速分解，且极大限度地缩短腐熟所需要的时间，提升完整的腐熟程度，减少氮元素因时间或是高温所引发的损耗，达到国家认定NY 525‑2012有机肥行业标准。有利于提升禽畜养殖业有机废弃物资源化再利用，不仅可以大幅减少禽畜养殖业对环境的破坏，也是乡村振兴与绿色环境农业永续环境的经营法则。

说明书

技术领域

本发明属于微生物堆肥技术领域，涉及一种嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株及其应用和应用方法。

背景技术

目前我国每年生产肉蛋奶1.5亿多吨，产生畜禽粪污约38亿吨，且畜禽废弃物有40％未得到有效处理和利用，成为农村环境治理难题。农业部将加快推进畜禽废弃物资源化利用，促进畜牧业绿色发展，到2020年建立畜禽养殖废弃物资源化利用制度，使全国畜禽粪污综合利用率达到75％以上。而目前为了处理这些畜禽粪污废弃物，许多养殖户将其直接排放到江河湖海。畜禽粪污废弃物不仅污染了环境，而且严重浪费资源，破坏生态。为了从根本上解决这一矛盾，我国进行了“畜禽粪污废弃物循环利用”方面的研究，其主要目的就是选择使用好的畜禽粪污废弃物腐熟剂来实现畜禽粪污废弃物的发酵进行生物有机肥的生产，实现畜禽粪污废弃物资源的循环利用。

目前处理有机废弃物的方法主要采用一次发酵方式，周期30天左右，一次发酵是堆肥的中温与高温两个阶段的微生物代谢过程，具体从发酵开始，经中温、高温然后到达温度开始下降的整个过程，一般需要25-40天，高温阶段持续时间较长。在高温阶段的发酵温度平均高于60℃，会造成分解菌株活性降低，延迟发酵分解时间，且堆肥化过程中氮素损失比较严重，有些甚至可达到30-50％。粪便与垃圾堆肥中的有机物在分解的同时，大分子含氮化合物转化为低分子含氮化合物而挥发，从而降低了肥效。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株及其在分解有机废弃物生产有机肥中的应用，目的之三在于提供一种具体的应用方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株，所述菌株为嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)R2D2-6.626069934，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.15478。

2.利用所述的嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株分解有机废弃物生产有机肥的应用。

进一步，所述有机废弃物为畜禽粪污废弃物或秸秆。

3.嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株分解有机废弃物生产有机肥应用的方法，所述方法为：将所述嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株活化，扩大培养后制备成粉剂，将所述粉剂和米糠，葡萄糖，酵母蛋白粉混合成菌粉分解剂，再配制成有机废弃物分解剂，最后加入有机废弃物中进行分解、腐熟。

进一步，所述有机废弃物中C/N为20-40。

进一步，所述粉剂，米糠，葡萄糖和酵母蛋白粉的质量比为2:11:2:3。

进一步，所述有机物分解剂的配制方法为：

a.将水煮开，并开盖沸腾5分钟以上，停止加热，放入粉状的秸秆；

b.水温冷至40～50℃时，放入糖蜜和蛋白补充剂；

c.水温冷至30～35℃时，放入菌粉分解剂和麦芽糊精；混均后，温度维持在30～35℃，

48小时以上，得到有机废弃物分解剂。

进一步，按质量分数计，所述秸秆为0～11％，糖蜜为12～23.5％，蛋白补充剂为30％，菌粉分解剂为2.1％，麦芽糊精为2.4～12％，其余为水。

进一步，所述有机物分解剂和有机废弃物的质量比为1.6～2:1000。

进一步，所述有机物分解剂和有机废弃物的质量比为1.8:1000。

本发明的有益效果在于：1、提供一种能在高温环境下存活生长的嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株；2、通过本发明提供的菌株可以在堆肥发酵高温期间，保持活性并大量繁殖，促进堆肥中有机物的快速分解，且极大限度地缩短腐熟所需要的时间，提升完整的腐熟程度，减少氮元素因时间或是高温所引发的损耗，提高碳氮比，达到国家认定NY 525-2012有机肥行业标准。有利于提升禽畜养殖业有机废弃物资源化再利用，不仅可以大幅减少禽畜养殖业对环境的破坏，也是乡村振兴与绿色环境农业永续环境的经营法则。有利于促进养殖废弃物资源化利用工作的推广，进一步统筹发展农业畜牧业生产和保护环境的关系。

生物材料保藏

本发明中嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)R2D2-6.626069934，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏日期为2018年3月22日，保藏编号为CGMCCNo.15478，分类命名为嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1菌株筛选

1)培养基成分和制备：

大豆蛋白胨5g、氯化钠5g、胰水解蛋白15g、琼脂15g和1000g蒸馏水，各成分加入蒸馏水中，搅拌均匀，调节pH至7.3，121℃高压灭菌15min。液体培养基不加琼脂。

2)取60℃以上高温禽畜粪污发酵堆肥中的有机质，加水250ml后放入60℃高温培养箱震荡培养24小时，震荡频率小于20转/分钟。

取培养后的菌液1mL加入9mL的无菌水中，再进行10倍梯度稀释，分别稀释到10^-2、10^-3，10^-4，无菌吸取每个稀释度的菌液0.1mL，涂布于所述培养基平板上，每个稀释度2个平行，置于60℃培养箱中恒温培养24h。观察涂抹后的菌落分布，以菌落及孢子形态为依据，挑取具有典型芽孢杆菌形态的单菌落，在所述培养基平板上进行4-5次划线传代，从中分离得到55株菌株R2D2-6.626069900～R2D2-6.626069954。首先对55株菌株涂片，芽孢染色镜检芽孢情况，挑取具有典型芽孢的初筛菌株，从中选择出生长快、菌落大的菌株R2D2-6.626069934。

将以上挑选的菌株命名嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)R2D2-6.626069934，并于2018年3月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.15478，分类命名为嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)。

实施例2

对实施例1中所分离的菌株R2D2-6.626069934，通过生物学特性观察，进行形态鉴定，结果如下：

在培养基上60℃培养4小時，形成大而圆白色菌落，菌落直径约1-3mm。镜检，菌体杆状，平均0.8×2.8μm，芽孢卵形，位于菌体末端膨大处。

实施例3 16S rDNA分子生物学鉴定

使用Illumina MiSeq测序仪，其读取长度可达2×250bp，每次反应能产生1-8Gb的测序结果。

引物：

GEOBAC-F：5′—TAAGCGTGAGGTCGGTGGTTC—3′，SEQ ID NO：3

GEOBAC-R：5′—GCGCTCTCGGCTTCTTCCTT—3′；SEQ ID NO：4

PCR反应体系(50μl)为：Premix Taq(Takara Taq TM Version 2.0plus dye)25μl，引物GEOBAC-F和GEOBAC-R各2μl，模板DNA1.0μl，去离子水20μl。

扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性60s，55℃退火90s，72℃延伸2min，循环35次，然后72℃延伸7min，得到扩增后的DNA样品。将PCR扩增产物送交中心大学生物科技发展中心处纯化、16S rDNA测序，测序结果如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。

实施例4

利用嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)R2D2-6.626069934分解有机废弃物生产有机肥中的方法。

(1)菌株活化

嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)R2D2-6.626069934菌株接种于培养基上，调节培养基的pH值为7.3，并在60℃条件下进行优化培养，每周转种一次。扩大发酵后再喷雾干燥为嗜热脂肪地芽孢杆菌菌粉。

将200g嗜热脂肪地芽孢杆菌菌粉，1100g米糠，200g葡萄糖和300g酵母蛋白粉混合成菌粉分解剂。

(2)有机废弃物分解剂制备：

a.将水28Kg煮开，并开盖沸腾5分钟以上，停止加热；

b.水中投放磨研磨成微细粉状的秸秆9.0Kg；

c.水温冷至50℃时，投放糖蜜10.0Kg；蛋白补充剂25Kg；

d.水温冷至30℃时，投放步骤(1)制备的菌粉分解剂1800g，麦芽糊精10Kg；

e.混合均匀后，温度维持在30～35℃，48小时以上，得到有机废弃物分解剂。

(3)处理有机废弃物的方法

将秸秆500kg和蛋白补充剂(氮源)100kg混合，利用粉碎机粉碎，加入步骤(2)得到的有机废弃物分解剂，作用72小时，再加入秸秆150kg，充分搅拌24小时，再加入秸秆250kg，再在陈化区静止堆放，最终形成吸附介质(即有机肥)。

实施例5

利用嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)R2D2-6.626069934分解有机废弃物生产有机肥中的方法。

(1)菌株活化

嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)R2D2-6.626069934菌株接种于培养基上，调节培养基的pH值为7.3，并在60℃条件下进行优化培养，每周转种一次。扩大发酵后再喷雾干燥为嗜热脂肪地芽孢杆菌菌粉。

将200g嗜热脂肪地芽孢杆菌菌粉，1100g米糠，200g葡萄糖和300g酵母蛋白粉混合成菌粉分解剂。

(2)有机废弃物分解剂制备：

a.将水36Kg煮开，并开盖沸腾5分钟以上，停止加热；

b.水温冷至50℃时，投放糖蜜20Kg、蛋白补充剂25Kg；

c.水温冷至30℃时，投放步骤(1)制备的菌粉分解剂1800g、麦芽糊精2KG；

d.混合均匀后，温度维持在25～30℃，72小时以上，得到有机废弃物分解剂。

(3)处理有机废弃物的方法

取含水量为40-50％畜禽粪污500kg，加入步骤(2)得到的有机废弃物分解剂，作用72小时，再加入秸秆150kg，充分搅拌24小时，再加入秸秆250kg，置于陈化区静止堆放，最终形成吸附介质(即有机肥)。

对比实施例对照组(无添加菌株)

将畜禽粪污废弃物和辅料(发酵基料)混合，调整其C/N为35，调节含水率为65％，直接进行发酵，从第三天开始，每隔2～3天翻堆一次，直至堆肥完全腐熟。

表1添加本发明菌株和对照的分解有机废弃物的对比数据

本发明的嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)R2D2-6.626069934分解有机废弃物达到完全腐熟的程度时间一般在10-20天，比不添加本菌的腐熟时间至少少了10天，如果进一步利用具有发酵槽的搅拌器进行搅拌的话，达到完全腐熟可缩短至3天，72小时即可。大大缩短的腐熟时间，并且N元素损失较少。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 叶荫人

<120> 一种嗜热脂肪地芽孢杆菌菌株及其应用和应用方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 450

<212> DNA

<213> 嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)

<400> 1

gccggctgcc ctcacggtcg cttcggtcct gccgtggcgg caatagcctc ctcgcaggcc 60

ctccagcacc tatcggggct aaccgcggcg cctccgcttt tccttccggt tatctagttt 120

tcaaggaacg aagctactac tttgagtttg cttctctgca gctttgtgcc gaggaaccta 180

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tctgcgtcga ggaatccagc ttctctgaat ccactcgtag acacagacac aaggctactt 300

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<210> 2

<211> 454

<212> DNA

<213> 嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)

<400> 2

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gaagctagac aaaggaagaa gcgaaagagc gcaa 454

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taagcgtgag gtcggtggtt c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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