蓝细菌及其膜外囊泡在制备治疗疾病药物中的应用

摘要

本发明提供一种蓝细菌及其膜外囊泡在制备治疗疾病药物中的应用，所述蓝细菌为

说明书

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，具体来说，涉及一种蓝细菌及其膜外囊泡(extracellular vesicles；EVs)在制备治疗疾病药物中的应用，尤其是涉及Synechococcus elongatusPCC 7942(细长聚球藻，以下简称S.elongatus)及其EVs在制备用于促进伤口、创面愈合、皮肤组织细胞再生和治疗烧伤等疾病的药物中的应用。

背景技术

烧伤是一种由热力、化学物质、电力、放射线等导致的急性组织损伤，损伤部位主要是皮肤和/或黏膜。据统计，每年因意外伤害的死亡人数，烧伤位列前五之一。全国烧伤年发病率约为1.5％～2％，每年遭受不同程度烧伤的人数约有2500万，以儿童和青壮年男性为主，其中约5％需要住院治疗，给个人、社会、家庭带来义重的负担。过去数十年中，归功于液体复苏、感染控制等治疗手段，因烧伤而死亡的人数有所下降。但是烧伤病人治疗过程中，伤口愈合及瘢痕形成程度是最重要的评价治疗效果的标准。目前，针对深二度及其以上的烧伤的治疗手段以组织移植为主。组织移植包括自体移植和异体移植。自体移植确实改善了烧伤机体的代谢亢进反应和存活率，但是对烧伤创面很大或创面恢复有美容要求的患者并非最佳的选择。在这些病人中，已有使用尸体皮肤或合成材料的案例，即异体移植。尸体皮肤移植是一种较易执行且廉价的方式，同时也存在被HIV、HSV和肝炎等传染性疾病传播的风险。应用合成材料覆盖伤口，临床结果表现出很好的生物相容性和促愈合特性，缺陷在于价格过于昂贵，不利于普遍性推广及应用。因此，探寻一种相对廉价且又能促进伤口愈合的药物显得十分必要。

S.elongatus是一种可以进行光合自养的原核生物。以往研究者将它作为一种研究光合作用和昼夜节律的模式生物。2017年，Cohen等发现将进行光照处理的S.elongatus注射到大鼠的心肌梗死区域能够明显地增加局部区域的供氧、维持心肌代谢及改善梗死区的心肌功能，且未发现有明显的免疫反应。皮肤义重烧伤的区域提供组织氧气和养分的血管等遭到破坏，不利于损伤组织的恢复。

不论是真核生物还是原核生物都会分泌EVs。EVs主要由微泡(microvesicles，MVs)和外泌体(exosomes)组成。微泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径约为100nm-1000nm；MVs是细胞释放到微环境中的质膜囊泡。普遍认为，EVs通过传递来源细胞的功能蛋白、脂质或核酸到靶细胞来实现细胞与细胞之间的交流。近来，Biller等首次提出蓝细菌Prochlorococcus通过持续释放EVs来支持异养细菌的生存。Pardo等发现Synechocystis PCC 6803也能释放EVs。目前没有报道显示，S.elongatus能够释放EVs，也没有相关的报道能够证明该细菌释放的EVs具有任何功效。

发明内容

针对相关技术中的上述技术问题，本发明提供了一种蓝细菌及其EVs在制备治疗疾病药物中的应用，所述蓝细菌及其EVs能促进伤口、创面愈合，能促进皮肤组织再生，可有效治疗烧伤病症。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一方面，本发明提供一种由蓝细菌分泌的EVs，其中，所述蓝细菌为S.elongatus。

另一方面，本发明提供一种上述的EVs的制备方法，具体过程如下：

将S.elongatus加入培养基中进行传代，光照培养、第一次离心，取上清再次离心过滤，滤液进一步经超速离心，所得沉淀为EVs。

进一步地，所述培养基的制备过程如下：将BG-11溶于双蒸水，加热加压消毒，冷却即得。

所述BG-11与双蒸水的质量比为1.7:1000。

所述加热的温度为121℃，所述压力为101.33kPa，所述消毒时间为30min。

进一步地，所述光照培养的条件为30℃下以2000lux光照12小时/天。

进一步地，所述第一次离心的条件为4000×g，4℃离心30min。

进一步地，所述再次离心的条件为10000×g，4℃离心30min。

进一步地，所述过滤的条件为：将上清液用0.22μm孔径的过滤器过滤。

进一步地，所述超速离心的试验过程为：100000×g，4℃离心60min；去上清，PBS重悬沉淀，再次100000×g，4℃离心60min。

又一方面，本发明提供一种蓝细菌及其EVs在制备治疗疾病药物中的应用，其中，所述治疗疾病药物用于促进伤口、创面愈合，促进皮肤组织细胞再生和治疗血管生成相关疾病。

进一步地，所述蓝细菌为S.elongatus。

优选地，所述血管生成相关疾病是指烧伤等疾病。

进一步地，所述蓝细菌或其EVs用于提升烧伤区域皮肤愈合度。

进一步地，所述蓝细菌或其EVs用于增加烧伤皮肤区域血管数量。

进一步地，所述烧伤包括深二度烧伤。

进一步地，所述烧伤包括由于各种物理或者化学因素导致的皮肤急性烧伤。

进一步地，所述药物通过皮下注射给药。

进一步地，所述皮下注射给药的剂量如下：1×10⁶S.elongatus/100μl每次，分别在第一天、第七天各干预一次；或100μg>

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。优选地，所述辅料为载体、赋形剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂以及防腐剂中的一种或多种。

进一步地，所述药物还包括抗炎剂、抗氧化剂、抗老化剂、促进细胞血管生长剂、抗肿瘤剂、肽类、蛋白质、核酸等。

本发明所述蓝细菌或其EVs可用于增加烧伤皮肤周围血管数量，提升烧伤后皮肤的愈合度。所述蓝细菌或其EVs可用于制备治疗烧伤的药物。本发明公开的应用为治疗烧伤尤其是深二度烧伤提供了新的安全有效的生物治疗方向。

本发明通过将光照处理的S.elongatus产生的EVs输送入损伤区域，加速损伤区域的愈合；或者直接将S.elongatus输送入损伤区域，也能明显加速小鼠烧伤区域的愈合。说明蓝细菌及其EVs均可促进伤口、创面愈合，促进皮肤组织细胞再生、治疗血管生成相关疾病；尤其是烧伤疾病，对深二度烧伤治疗疗效好，为烧伤的治疗提供一种新的途径。

本发明治疗的创面愈合快，愈合面均匀，应用于临床效果好，感染率低，利于创面健康组织的快速生长，因而具有广阔的临床应用前景。

本发明的有益效果：

本发明提供一种蓝细菌及其EVs在制备治疗疾病药物中的应用。

通过动物实验证明了S.elongatus对于深二度的烧伤非常有效，皮肤愈合度比溶剂对照组有显著提升(P＜0.01)，烧伤皮肤区域血管数量比溶剂对照组有显著提升(P＜0.01)。

通过动物实验证明了S.elongatus的EVs对于深二度的烧伤非常有效，皮肤愈合度比溶剂对照组有显著提升(P＜0.001)，烧伤皮肤区域血管数量比溶剂对照组有显著提升(P＜0.001)。

应用S.elongatus进行治疗，因其成分单一，且容易获得，应用前景广泛。

应用S.elongatus的EVs进行治疗，疗效比S.elongatus更好，且具有易于保存、减少副作用发生率等优势。因此，S.elongatus和(或)其EVs可以用于治疗深二度烧伤的药物中，为治疗烧伤提供了新的安全有效的生物治疗策略。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是S.elongatus EVs的透射电镜图。

图2是动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)测量的EVs粒径分布图。

图3是本发明实施例1中小鼠皮下注射S.elongatus及其EVs第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第12天烧伤区域皮肤愈合度的对比图。

图4是本发明实施例1中小鼠皮下注射S.elongatus及其EVs 12天后皮下血管对比图。

图5是本发明实施例1中小鼠皮下注射S.elongatus及其EVs 12天后，烧伤区域CD31免疫组化对比图。

图中，intensity(percent)：强度(百分比)；size：尺寸。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定佉，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含佉相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。

实施例1

(1)S.elongatus的获取和培养：

S.elongatus的获取和培养：我们从中国科学院淡水藻种库购买S.elongatus藻种，按照官网说明书将藻种培养传代：BG-11(海博生物)1.7g加双蒸水1000ml，加热使其充分溶解，101.33kPa、121℃高温消毒30min。用约50ml BG-11稀释5ml藻种原液，放入在光照培养箱中，3-4天传代培养。以上操作均需在无菌环境下进行。

(2)S.elongatus EVs的提取：

1.7g BG-11加双蒸水1000ml，121℃高温消毒30min。用约50ml BG-11稀释5ml藻种原液，放入光照培养箱中培养3-4天后传代，用新鲜的BG-11重悬S.elongatus，放入光照培养箱中培养。24h后，4000×g，4℃离心30min。取上清，再次10000×g，4℃离心30min，将上清液用0.22μm孔径的过滤器(Millipore)过滤。取过滤液，100000×g，4℃离心60min。去上清，PBS重悬沉淀，再次100000×g，4℃离心60min。完全去除上清，所得沉淀即为EVs。根据沉淀大小加入不同量的PBS(索莱宝)溶解，吸取20μl用来进行BCA法蛋白定量，其余样本放入-80℃中保存。液态时，包含10⁵～10⁹个/ml的蓝细菌或20～400mg/ml的蓝细菌EVs。

用透射电镜对S.elongatus EVs进行检测，检测结果如图1所示。

运用DLS测量的EVs粒径分布，检测结果如图2所示。如图1和图2可知，蓝细菌EVs大致呈球形，80％集中在80nm至250nm之间。

(3)蓝细菌及其EVs的功效验证

小鼠模型：选取12周龄的C57BL/6雌性SPF级小鼠，体重为20～22g，均从湖南斯莱克景达动物实验有限公司购买。每组7～10只小鼠，自由进食水，维持昼夜节律。

分组实验：将C57BL/6雌性SPF级小鼠随机分为S.elongatus干预组(S.elongatus组)，S.elongatus EVs干预组(S.elongatus-EVs组)，溶剂对照组(PBS组)，每组7～10只，进行实验。

造模：对S.elongatus组、S.elongatus-EVs组、PBS组小鼠造烧伤模型。

给药方式：

S.elongatus组：每次皮下注射含1×10⁶个S.elongatus的PBS重悬液(溶解于100μl>

S.elongatus-EVs组：每次皮下注射100μg S.elongatus EVs(溶解于100μl>

PBS组：每次注射100μl PBS，分别在第一天、第七天各干预一次。

按上述干预方案干预12天。

干预过程中，记录各组小鼠第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第12天烧伤区域皮肤愈合状况。脱臼处死小鼠，采集皮肤等标本进行检测对比。结果如图3～5所示：

从图3～5中可以看出，S.elongatus和S.elongatus-EVs对促进烧伤皮肤愈合非常有效。S.elongatus组较PBS组，皮肤愈合度显著增加(P＜0.01)，烧伤区域周围血管数量显著增加(P＜0.01)。S.elongatus-EVs组较PBS组，皮肤愈合度显著增加(P＜0.001)，烧伤区域周围血管数量显著增加(P＜0.001)。对小鼠皮下注射S.elongatus和S.elongatus-EVs后，明显加速皮肤愈合度及增加烧伤区域周围血管数量，说明S.elongatus和S.elongatus-EVs具有显著的促皮肤愈合功效，可以用于治疗烧伤的药品中，为深二度烧伤提供了新的安全有效的生物治疗手段。图5所示的烧伤区域CD31免疫组化对比图，说明本发明实施例中小鼠皮下注射S.elongatus及其EVs 12天后，相较于PBS能够明显增加烧伤区域的血管生成，进而有利于促进烧伤皮肤的愈合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。