一种杂合肽及其在抑菌中的应用

摘要

本发明公开了一种杂合肽及其在抑菌中的应用，本发明杂合肽具有广谱抗菌活性，对多数革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有不同程度的抑菌活性，同原始抗菌肽相比，杂合后抗菌肽对常见致病菌的抑菌活性显著增强。抑菌特别是同时又具有热稳定性和酸稳定性的特点，使其在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显示很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种杂合肽及其在抑菌中的应用。

背景技术

抗菌肽是一类具有广谱抑菌活性的多肽类物质，部分抗菌肽还能激活免疫系统，参与细胞信号传导，调节细胞增殖，具有抗肿瘤、抗病毒、抗寄生虫功能。抗菌肽可通过破坏细菌细胞膜，造成胞内物外溢使细菌死亡，机理不同于抗生素，具有广谱的杀菌抑菌效果，同时抗菌肽可作为免疫细胞的趋化因子，刺激宿主细胞趋化因子的释放，激活免疫系统对抗原的识别和呈递，提高免疫细胞的分化增殖和应答水平。抗菌肽因其具有独特的杀菌机制和优良的理化性质成为安全绿色抗生素添加剂替代品的研究热点，抗菌肽在畜牧业生产中具有广阔的应用前景。其中将抗菌肽应用到畜牧养殖中的研究较多，人工设计杂合抗菌肽也是目前研究的热点之一。

然而，抗菌肽的研发中存在着诸多限制因素，由于天然生物资源中抗菌肽含量低，且提取分离纯化工艺繁琐，因此从天然资源中提取受到很大限制。而采用化学方法合成的成本仍然很高，目前仅满足于抗菌肽用量较少的基础实验研究。而生产抗生素替代品用于医疗以及畜牧养殖，对于生产成本的要求就比较高。通过微生物发酵和基因工程技术是规模化获得抗菌肽的有效途径，其可以规模化发酵生产，有效降低成本。

蜂毒肽(Melittin)亦称蜂毒溶血肽，是意大利蜂蜂毒的主要成分之一，不仅具有抗菌、消炎、抗关节炎等作用，对辐射还有预防和治疗作用。蜂毒肽的结构蜂毒肽由26个氨基酸残基组成，具有强碱性，溶于水，在水中存在2种形式，即在低浓度、低离子强度形成单体的自由结构，在高浓度、高离子强度则形成四聚体。蜂毒肽具有广谱杀菌作用，能抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性病原微生物的发育，尤其对耐药菌株有明显抑杀作用，然而其溶血活性限制了其发展为高效抗菌药物的应用。Ranatuerin-2抗菌肽家族首先在北美牛蛙的皮肤中得到鉴定，此家族抗菌肽在北美、亚洲蛙中有广泛的分布，Ranatuerin-2肽链N端相对保守。其中，Ranatuerin-2Cb富有广谱的抗菌活性，对大肠杆菌的最小抗菌浓度(MIC)从2μmol/L到30μmol/L。

随着抗生素残留，耐药菌株不断出现，人们意识到有必要开发一类新的抗生素。抗菌肽有着许多抗生素无法比拟的优点，具有广谱的生物学活性，杀菌迅速，不受传统抗生素耐药菌株影响，与典型的抗生素具有协同作用，中和内毒素等，在医药、农业、食品工业等领域具有广泛的应用前景。改造已有抗菌肽和设计新抗菌肽分子是提高其活性的有效途径。采用基因工程技术生产抗菌肽具有活性高、产量大、成本低廉、生产速度快、易于规模化生产等优点。目前，抗菌肽的抗菌活性较抗生素还存在一定的差距，且很多抗菌肽还存在着毒性强、稳定性差、成本高等诸多问题。因此，对抗菌肽进行分子设计、结构改造和修饰、降低其溶血活性、提高其抑菌效果及广泛性、提高其热稳定性、酸碱稳定性等成为抗菌肽研发的重要内容之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种杂合肽及其在抑菌中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

杂合肽Mel-Ran2Cb，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

编码上述所述杂合肽Mel-Ran2Cb的基因序列，如SEQ ID NO:2所示。

上述所述杂合肽Mel-Ran2Cb在制备饲料添加剂中的应用。

上述所述杂合肽Mel-Ran2Cb在制备抑菌产品中的应用。

进一步的，上述所述抑菌产品包括防腐剂、保健品、药。

进一步的，上述所述抑菌产品为能够抑制大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的抑菌产品。

能够表达上述所述杂合肽Mel-Ran2Cb的菌株。

含有上述所述杂合肽Mel-Ran2Cb基因序列的菌株。

本发明的有益效果是：

(1)本发明杂合肽Mel-Ran2Cb是一小分子肽，具有热稳定性，可以在100℃的高温保持45min，具有较好的热稳定性。可以满足饲料制粒的高温要求。

(2)革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌混合感染所致疾病的治疗，一直是兽医领域面临的难题。本发明中，重组杂合肽Mel-Ran2Cb对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌活性，但是改造后的杂合抗菌肽对芽孢杆菌类益生菌的抑制效果较弱，这对维持动物胃肠道菌群平衡及健康方面具有重要的意义。

(3)本发明杂合肽具有广谱抗菌活性，对多数革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有不同程度的抑菌活性，同原始抗菌肽相比，杂合后抗菌肽对常见致病菌的抑菌活性显著增强。抑菌特别是同时又具有热稳定性和酸稳定性的特点，使其在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显示很好的应用前景。

附图说明

图1为重组Mel-Ran2Cb的Tricine-SDS-PAGE电泳检测；1，重组酵母菌株诱导后72h样品；M，低分子量Marker；

图2为重组杂合肽Mel-Ran2Cb的热处理稳定性；

图3为重组杂合肽Mel-Ran2Cb的酸碱稳定性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

1材料与方法

1.1材料

1.1.1质粒及菌株：

毕赤酵母X-33(His-Mut+)、表达载体pPICZα-A购于Invitrogen公司；Escherichia coli ATCC25922、Staphylococcus aureus ATCC25923、Staphylococcus aureus ATCC6538、Salmonella enterica ATCC13076、Salmonella typhimurium ATCC14028、Bacillus subtilis ATCC6633E为本实验室保存。

1.1.2主要试剂

限制性内切酶XholⅠ、XbalⅠ、SacⅠ、T4连接酶(购自Takara(大连)有限公司)；Zeocin、Tricine、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA分子质量Marker、小分子质量蛋白Maker(购自上海生工生物工程技术服务有限公司)；pMD18-T由本实验室保藏；其他试剂为国产分析纯；多核苷酸及DNA测序由华大基因完成。

1.2杂合抗菌肽Mel-Ran2Cb基因的克隆

选用酵母偏爱密码子设计Mel-Ran2Cb杂合肽基因，其基因序列为GGTGCTGTTTTGAAGGTTTTGACTACTGGTTTGCCAGCTGGTAAGTTGTTGCAAGGTTTGAAGTGTATCAAGGCTGGTTGTAAGCCA(SEQ ID NO 2)，其编码的氨基酸序列为GAVLKVLTTGLPAGKLLQGLKCIKAGCKP(SEQ ID NO 1)。在Mel-Ran2Cb杂合肽N端加上α信号肽Kex2裂解位点(-Glu-Lys-Arg-)。化学合成具有酵母密码子偏爱性编码基因，并在编码基因5'和3'端分别引入XholⅠ、XbalⅠ酶切位点。应用SOE-PCR的方法(两次PCR)合成所需要的目的基因。反应体系(25μL):10×PCR Buffer(Mg²⁺free)2.5μL，MgCl₂(25mmol/L)1.5μL，dNTP(10mmol/L)0.5μL，上下游引物(100pmol/L)各0.5μL，TaKaRa>TM>

1.3重组酵母表达载体的构建和Mel-Ran2Cb的诱导表达

经SOE合成好的基因经XhoⅠ、XbaⅠ双酶切，定向插入酵母表达载体pPICZα-A中，构建Mel-Ran2Cb重组质粒，缺失酶切位点鉴定阳性的质粒命名为pPICZα-A-Mel-Ran2Cb，送深圳华大基因测序。将测序正确的重组质粒转化酵母菌X-33，重组酵母的电击转化、筛选按Invitrogen公司酵母表达操作手册进行，略有改进。将筛选到的阳性酵母菌接种于20mL YPD培养基，30℃，300r/min培养至A₆₀₀达到3～5，离心收集菌体转接于50mL>

1.4重组杂合肽Mel-Ran2Cb最小抑菌浓度(MIC)测定

采用微量肉汤稀释法测定重组Mel-Ran2Cb抑菌活性。0.02％乙酸溶液(含0.4％牛血清白蛋白)稀释重组杂合肽，得到2倍梯度稀释抗菌肽贮存液(2560，1280，…，20和10μg/mL)，存放于聚丙烯离心管中。测试菌接种于MHA培养基中过夜培养，将测试菌过夜培养物稀释至2×10⁵～7×10⁵cfu/mL，分别取100μL加到96孔细胞培养板每行1～10号孔，将按梯度稀释抗菌肽10μL对应加到1～9号孔，10号孔不加抗菌肽，作为阳性对照，11号孔加入100μL新鲜MHB培养基作为空白对照，37℃培养18至24h后，用酶标仪测490nm吸光值。吸光度比10号孔低50％以上孔内浓度即定义为对该测试菌最小抑菌浓度MIC。试验在无菌条件下操作，重复3次。

1.5重组Mel-Ran2Cb的表达优化

为提高重组酵母的表达效率，对Mel-Ran2Cb重组酵母菌株的摇瓶发酵条件进行了优化，包括其诱导起始时种菌的OD值、诱导时间、诱导温度、培养基的pH值控制、甲醇浓度及营养成分的追加等多种参数。

1.6表达产物的SDS-PAGE分析

重组杂合肽Mel-Ran2Cb的分子量约为2.9kD，理论上，分子量低于15kD的多肽在常规Tris-甘氨酸电泳系统中难以得到理想的电泳分辨率。因此，我们使用Tricine(三羟甲基氨基甘氨酸)代替甘氨酸作为终止离子，并增加电泳缓冲液的摩尔浓度，使重组Mel-Ran2Cb多肽得到了较好的分辨率及带型。

1.7重组杂合肽Mel-Ran2Cb的热稳定性和酸碱稳定性检测

将杂合抗菌肽Mel-Ran2Cb分别煮沸10min、1h、2h、3h、4h，再以金黄色葡萄球菌为指示剂进行抑菌试验。实验同时，配置pH 2～12的缓冲液。取20μL表达上清，分别加入20μL不同pH值缓冲液，以不加抗菌肽的不同pH值缓冲液为对照，做抑菌实验。

2结果

2.1序列验证

根据测序核苷酸序列推导出氨基酸序列，重组杂合肽Mel-Ran2Cb编码的氨基酸序列为：GAVLKVLTTGLPAGKLLQGLKCIKAGCKP(SEQ ID NO 1)，已正确插入表达载体的Kex2蛋白酶裂解位点之后，使用了酵母偏好密码子。通过提取酵母阳性转化子的基因组DNA。

2.2重组杂合肽Mel-Ran2Cb的表达优化参数和表达产物的Tricine-SDS-PAGE

通过对重组酵母菌发酵条件的优化，得到一组发酵参数：BMMY发酵培养基pH 6.0，表达后期BMMY培养基pH控制在5.0～6.0，25℃培养72h，其间每6h添加2mL/L的甲醇。在诱导72h时其表达量达到高峰。在Tris-Tricine电泳系统中，杂合肽Mel-Ran2Cb大小为2.9kD(图1)。

2.3重组杂合肽Mel-Ran2Cb的抑菌效价

重组杂合肽Mel-Ran2Cb的热稳定性和酸稳定性结果显示，重组杂合肽Mel-Ran2Cb煮沸40min以内抑菌圈没有变化。煮沸40min～1h的杂合肽Mel-Ran2Cb抑菌圈出现轻微下降。煮沸1h～2h，其抑菌直径出现显著下降，由最初的21mm下降至6.6mm。表明抗菌肽具有很强的热稳定性(图2)。在酸碱稳定性方面，结果显示，pH7～2下降时时，抑菌直径较原来出现轻微下降，pH8～11时，随着pH值增高，抑菌直径逐渐减小。说明此抗菌肽对酸具有较好的抵抗力，而当pH值高于10，则对其抗菌活性有显著的影响(图3)。

2.4重组杂合肽Mel-Ran2Cb的最小抑菌浓度(MIC)检测

最小抑菌浓度是从定量的角度来分析抗菌肽对待供试菌株的抑菌能力。本实验对本发明杂合肽Mel-Ran2Cb同原始抗菌肽Melittin(简称Mel)、Ranatuerin-2Cb(简称Ran2Cb)间的抑菌活性进行了比较，其中原始抗菌肽Mel的氨基酸序列为GLGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO:3)，Ranatuerin-2Cb的氨基酸序列为GLFLDTLKGLAGKLLQGLKCIKAGCKP(SEQ ID NO:4)。

由表1可知，杂合肽Mel-Ran2Cb对大肠杆菌、沙门氏菌的MIC为3.0μg/ml、3.5μg/ml和5.0μg/ml，显著低于原始抗菌肽Mel和Ran2Cb；杂合肽Mel-Ran2Cb对2种金黄色葡萄球菌的MIC均为2.5μg/ml，显著低于原始抗菌肽Mel和Ran2Cb。此外，还检测了抗菌肽枯草芽孢杆菌的抑菌效应，MIC为42.0μg/ml。由表1的结果可知，抗菌肽对常见致病菌具有较好的抑菌活性，其抑菌活性相比原始抗菌肽Mel和Ran2Cb显著增强；同时本发明杂合肽Mel-Ran2Cb对供试的有益菌的抑菌作用相对较弱。

表1杂合抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC)

目前，畜牧养殖行业普遍将添加剂在饲料制粒前进行混料加工，这对添加剂的耐热性提出了较高的要求。本发明杂合肽Mel-Ran2Cb是一小分子肽，具有热稳定性，可以在100℃的高温保持45min，具有较好的热稳定性。可以满足饲料制粒的高温要求。另外，革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌混合感染所致疾病的治疗，一直是兽医领域面临的难题。本发明中，重组杂合肽Mel-Ran2Cb对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌活性，但是改造后的杂合抗菌肽对芽孢杆菌类益生菌的抑制效果较弱，这对维持动物胃肠道菌群平衡及健康方面具有重要的意义。

本发明成功构建基因工程菌P.pastoris X-33/pPICZα-A-Mel-Ran2Cb，杂合肽具有广谱抗菌活性，对多数革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有不同程度的抑菌活性，特别是同时又具有热稳定性和酸稳定性的特点，使其在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显示很好的应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州格拉姆生物科技有限公司

<120> 一种杂合肽及其在抑菌中的应用

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<170> PatentIn version 3.5

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<213> 人工序列

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