一株控制桃果采后病害的膜醭毕赤酵母

摘要

本发明公开了一株控制桃果采后病害的膜醭毕赤酵母Y4，属于水果采后病害生物防治领域。该酵母经鉴定为膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018110。使用时将膜醭毕赤酵母Y4在NYDA培养基、28℃培养2‑3天进行活化，然后在NYDB培养基、28℃发酵培养20‑24h,该活化过程重复2次，离心获得菌体，洗涤2次后用无菌水稀释制备成的菌悬液；将桃果打洞后加入上述菌悬液，2h后接种匍枝根霉孢子悬浮液；室温下晾干，放于消毒后的塑料筐中，用保鲜膜密封后，置于恒温培养箱中贮藏。经该酵母处理的水蜜桃软腐病发病率和腐烂直径均显著降低。膜醭毕赤酵母Y4可以用于防治水蜜桃软腐病，可减少化学杀菌剂的使用，避免因使用化学杀菌剂造成对人的危害及对环境的污染。

说明书

技术领域

本发明涉及一株膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)Y4，该菌株可以控制水蜜桃采后软腐病，属于水果采后病害生物防治领域。

背景技术

水蜜桃，学名Prunuspersica，蔷薇科、桃属植物，为桃类水果中的优良品种，是我国主要经济型水果之一，具有巨大的农业经济价值，对提高我国农民收入和促进当地经济和产业发展具有重要意义。水蜜桃因外形美观、颜色鲜艳、多汁多肉、味道甜美及营养价值高等诸多特点，深受消费者的喜爱，并且在销售市场上具有很强的竞争力。水蜜桃的蛋白质和矿物质含量较高，富含多种维生素和多种人体所需的必须氨基酸，其食用和药用营养价值高，蕴含巨大的商业价值。

据报道，在发达国家，水果采后病害导致的腐烂率约占10％-30％，而在缺乏保鲜技术的发展中国家，有高达40％-50％的腐烂率是由采后病害造成的。果实采后病害是全球性的问题，无论在发达国家还是发展中国家，由采后病害导致的果实腐烂都相当严重。水蜜桃果实肉质多汁，成熟期集中，采摘后不耐贮存，极易受到病原菌侵染而发生采后病害，尤其是以霉菌为主的病原菌的侵染。据统计，水蜜桃采后病害达10多种，常见的病害有软腐病、灰霉病、褐腐病、白粉病、果腐病、溃疡病、黑星病等。其中，软腐病是水蜜桃采后的主要病害之一，而引起水蜜桃软腐病的主要病原菌为广泛存在于自然界中的葡枝根霉(Rhizopusstolonifer)。

水蜜桃采后病害严重损害了其食用价值和商业价值，造成了巨大的经济损失。因此，必须采取合适的方法控制水蜜桃的采后病害。目前，国内外对水果采后病害的控制法主要有物理法、化学法和生物控制法三种。物理法控制水果采后病害优点是没有残留，对人和环境无危害，但是大部分物理控制方法对设备和技术的要求较高，间接地提高了控制水果采后病害的成本。低温贮藏为物理控制法中最为常见的方法，利用冷库和冰柜等制冷设备对桃果进行低温贮藏，操作简单，能有效缓解桃果的腐烂变质，对水果安全性无不良影响。据研究报道：桃果在1℃低温贮藏条件下，可使其保持较好的硬度、颜色，提高贮藏效果。但该方法所需制冷设备成本和能源消耗较高，且桃果在贮藏期间容易出现风味丧失及质地变软等情况。除此之外，用于控制桃果采后病害的物理方法还有：气调包装、热处理、变温处理、减压处理、辐射处理等。自1960年开始，使用化学杀菌剂成为控制水果采后病害最重要的手段。化学杀菌剂以其高效、低价、使用方便等优点，很长的一段时间内一直被大量使用，但该方法具有引起病原菌的抗药性、危害人体健康并污染环境等缺点。而随着人们对环境、生态、健康的关注，针对化学杀菌刹使用的政策将越来越严格。因而，积极寻找可替代化学杀菌剂的、高效、安全的水果采后病害防治方法显得尤为重要。生物控制法因能有效控制水果采后病害，具有安全、无毒、对环境无污染和不引起病原菌产生抗药性等优点，逐渐成为控制水果采后病害的研究热点，并有望在未来取代化学控制法。目前，已研究可作为水果采后病害拮抗菌的微生物主要有细菌、霉菌和酵母菌。其中，酵母菌因其遗传稳定，抑菌谱广、效价高等优点而成为主要的研究对象。酵母菌通过在果实表面快速增殖与病原菌竞争营养与空间，从而来抑制果实上病原菌生长。酵母菌能耐受低温、对大多数化学杀菌剂不敏感、与某些化学物质(如水杨酸)等一同使用还能提高其防治效果，也能与其他控制方法相容。因此近年来拮抗酵母作为水果采后病害生防菌，在国际上受到广泛关注。

目前，应用于水果采后病害生物防治的拮抗酵母约有40多种，主要来自7个属，分别为假丝酵母属(Candida spp.)、隐球酵母属(Cryptococcus spp.)、毕赤酵母属(Pichiaspp.)、梅奇酵母属(Metschnikowia spp.)、红酵母属(Rhodotorula spp.)、丝孢酵母属(Trichosporon spp.)、克勒克酵母属(Kloechera spp.)。林丽等在“大久保”桃的每个伤口处接种30μL浓度为1×10⁸cells/mL的罗伦隐球酵母(C.laurentii)，2h后，每个伤口处加入20μL浓度为1×10⁴spores/mL的匍枝根霉孢子悬浮液，然后在20℃储藏5d，结果表明，处理组的腐烂率和腐烂直径(24％、43mm)显著低于对照组(91％、63mm)(林丽，中国农业科学，2003，36)。徐柏田用1×10⁸cells/mL卡利比克毕赤酵母(P.caribbica)处理“大久宝”桃(每个伤口接种30μL的酵母菌，2h后再接种30μL浓度为1×10⁴spores/mL的葡枝根霉孢子悬浮液)，25℃贮藏3d后，处理组发病率和腐烂直径(50％，31mm)显著低于对照组(100％，57mm)(徐柏田，江苏大学，2013)。秦国政等将采收的“绿化3号”桃果当天运回实验室，在0℃下贮藏10d后，用接种针在果实腰部刺4mm(深)×3mm(宽)的伤口，接种30μL浓度为1×10⁸cells/mL的膜醭毕赤酵母悬浮液,4h后,再接种15μL浓度为5×10⁴spores/mL的病菌孢子悬浮液后，置于恒温恒湿培养箱中，4d后处理组腐烂率和腐烂直径(48％，42mm)显著低于对照组(100％，83mm)(秦国政，中国农业科学,2003,36(1):89-93)。范青等用5×10⁸cells/mL的季也蒙假丝酵母悬液处理大连黄桃(每个伤口接种30uL的酵母菌，4h后在接种12ul浓度为5×10⁴spores/mL的葡枝根霉孢子悬浮液)，25℃下贮藏4d后，处理组发病率和腐烂直径(5％，0.32mm)显著低于对照组(100％，85mm)(范青，植物学报(英文版)，2000，43(10):1033-1038)。

本发明中的膜醭毕赤酵母被认为是安全的酵母之一，研究证明，该酵母能显著降低水蜜桃采后病害的发生，降低水蜜桃的腐烂率和腐烂直径，从而达到水蜜桃贮藏保鲜的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一株分离筛选自江苏省镇江市农科院有机农业生态园的膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)Y4，该酵母能够有效控制水蜜桃采后病害的发生，减少采后病害造成的损失，具有潜在的应用价值。

本发明采用的技术方案

本发明所提供的防治水蜜桃采后病害的酵母菌株Y4筛选分离自江苏省镇江市农科院有机农业生态园，在NYDA固体培养基平板上28℃培养2-3天，进行形态学观察；对该菌株的5.8S rDNA-ITS区序列分析，进行分子生物学鉴定。

本发明所提供的防治水蜜桃采后病害的酵母菌株Y4，现保存位于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M2018110，保藏日期为2018年3月11日，建议的分类命名为膜醭毕赤酵母Y4(Pichia membranaefaciens Y4)。

利用膜醭毕赤酵母Y4对水蜜桃采后病害进行防治及贮藏保鲜的方法，按照下述步骤进行：将膜醭毕赤酵母Y4在NYDA培养基、28℃培养2-3d进行活化，然后在NYDB培养基、28℃发酵培养20-24h，离心洗涤得到菌体。用无菌水稀释制备成1×10⁸cells/mL的菌悬液；将桃果打洞后加入上述菌悬液，2h后接种匍枝根霉孢子悬浮液；室温下晾干，放于消毒后的塑料筐中，用保鲜膜密封后，置于恒温培养箱中(湿度95％、20℃)贮藏。

其中所述的NYDA培养基成分如下：牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，121℃湿热灭菌20min。

其中所述的NYDB培养基成分如下：牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，蒸馏水1000mL，pH自然，121℃湿热灭菌20min。

本发明的优点：

(1)本发明所使用的膜醭毕赤酵母(P.membranaefaciens)Y4为本实验室自主分离筛选，经急性毒性动物实验证明为实际无毒类，对人体健康无危害。(2)本发明所使用的膜醭毕赤酵母(P.membranaefaciens)Y4可以显著抑制水蜜桃采后软腐病的发生并且能显著降低桃果的发病程度，从而降低桃果采后病害造成的经济损失。(3)本发明所使用的膜醭毕赤酵母(P.membranaefaciens)Y4目前尚未有在水蜜桃上应用的报道，具有一定的新颖性。

本发明使用膜醭毕赤酵母(P.membranaefaciens)Y4，可以代替化学杀菌剂防治水蜜桃采后病害，避免使用化学杀菌剂对人体的危害，具有显著的经济效益和社会效益。

通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。

附图说明

图1为根据本发明中膜醭毕赤酵母Y4 5.8S rDNA-ITS区序列构建的进化树。

图2为膜醭毕赤酵母Y4对的水蜜桃软腐病腐烂率和腐烂直径的影响。A为膜醭毕赤酵母Y4对水蜜桃软腐病发病率的影响；B为膜醭毕赤酵母Y4对水蜜桃腐烂直径的影响。CK：无菌水处理组，即对照组；Y：1×10⁸cells/mL的膜醭毕赤酵母Y4菌悬液处理组。不同字母代表差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

实施例1：Y4菌株微生物学特性如下：

一)形态学特征

(1)NYDA培养基上28℃培养2-3天，菌落呈圆形、乳白色、稍隆起、边缘光滑、较湿润、易挑起。细胞形态呈椭圆形或卵圆形，一端或两端芽殖。

(2)在NYDB液体培养基中培养24h后，菌液浑浊，有沉淀，有特殊气味。在NYDB液体培养基中静置3天后，能形成醭，有气泡产生。

二)分子生物学鉴定

对分离筛选出的酵母菌株Y4的5.8S rDNA-ITS区序列分析，在GenBank检索，确定为膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)。根据检索到的同源菌株，应用DNAStar软件的Mege5.1程序，构建生物进化关系树如图1。

本发明所提供的防治水蜜桃采后病害的拮抗酵母菌株Y4，现保存于中国武汉市武汉大学，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M 2018110，保藏日期为2018年3月11日，建议的分类命名为膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)Y4。

实施例2：膜醭毕赤酵母Y4安全性实验

一)实验方案

酵母菌泥的制备：将膜醭毕赤酵母Y4接种在装有50ml NYDB培养基的250ml三角瓶中，28℃摇床培养20h后，离心获得菌泥，洗涤后用无菌水稀释成所需浓度。每次小鼠灌胃的菌液均来自新鲜的菌泥稀释。

试验品种为ICR小鼠，购买于江苏大学动物实验中心合格证编号NO.201613561，许可证号SCXK(苏)2013-0011，执行标准GB15193.3-1994。选择体重范围18g～22g清洁级的ICR小鼠40只，雌雄各半。试验前，小鼠放置于动物实验中心正常喂食3天，并在试验前禁食4h，将小鼠分为4组，每组10只，雌雄各5只。将配制好的酵母菌菌液按照5000mg/kg，10000mg/kg，15000mg/kg的剂量进行一次经口灌胃，随后观察14天，整个实验过程中，观察并记录小鼠的活动情况、有无异常行为及中毒或死亡的现象。若出现死亡现象，必要时可延长到28d。求出半数致死量，并确定急性毒性分级。

二)实验结果

按照上述试验步骤，统计膜醭毕赤酵母Y4安全性实验结果如下：

灌入膜醭毕赤酵母Y4的小白鼠14d内未出现死亡现象，整个实验过程中小白鼠未出现中毒和其它异常现象。由表1可以看出，该实验小鼠雌、雄性经口LD 50均大于10000mg/kg体重，根据急性毒性分级标准可知，膜醭毕赤酵母Y4属于安全无毒类酵母。

表1膜醭毕赤酵母Y4对小鼠经口急性毒性实验结果

实施例3：膜醭毕赤酵母Y4对水蜜桃软腐病的控制效果

一)实验方案

膜醭毕赤酵母Y4接种在装有NYDB培养基的三角瓶中，于摇床中180rpm、28℃培养20h后，离心获得菌体，洗涤后用无菌水重悬并调节浓度至1×10⁸cells/mL。葡枝根霉在PDA培养基上于28℃培养5-7d，以无菌水配制浓度为1×10⁵spores/mL的孢子悬浮液。

供试的品种江苏省句容市绿色生态基地种植的“白凤”水蜜桃，该桃果未喷洒任何化学农药。采摘时，选取表面无明显病菌感染或损伤、果实成熟度和大小等相关指标基本一致的桃果，果实成熟度为七到八成熟，当天运回实验室进行实验。用灼烧过的打孔器在桃果果实表面赤道位置打出3个均匀分布且大小、深度一致的伤口(5mm×3mm)。每个伤口处均加入30μL浓度为1×10⁸cells/mL的膜醭毕赤酵母Y4菌悬液，2h后，向桃果伤口处再分别接种30μL>5spores/mL的匍枝根霉孢子悬浮液。自然晾干后，将果实置于塑料筐内并用保鲜膜密封，置于恒温培养箱中(湿度95％、20℃)贮藏。同时以等体积的无菌蒸馏水代替膜醭毕赤酵母Y4菌悬液的处理作为对照。每处理重复3次，每次重复12个果实。整个试验重复2次。经过3天的贮藏，记录果实的发病率和腐烂直径，以此评价膜醭毕赤酵母Y4对水蜜桃软腐病的抑制效果。

发病率的计算公式如下：

发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％

二)实验结果

按照上述试验步骤，统计水果的腐烂率结果如下：

如图2所示，对照组桃果的发病率为94.23％，腐烂直径为35.86mm，经膜醭毕赤酵母Y4处理的桃果发病率为23.33％，腐烂直径为11.2mm,处理组发病率显著低于对照组(P<0.05)，表明膜醭毕赤酵母Y4在常温下能够有效控制由匍枝根霉导致的桃果采后软腐病。本试验用膜醭毕赤酵母Y4菌悬液对“白凤”水蜜桃软腐病的控制效果显著高于卡利比克毕赤酵母对“大久宝”桃、膜醭毕赤酵母对“绿化3号”桃果软腐病的控制效果(处理组腐烂率和腐烂直径分别为50％，31mm；48％，42mm)(徐柏田，江苏大学，2013；秦国政,中国农业科学,2003,36(1):89-93)。林丽等利用罗伦隐球酵母控制“大久保”桃软腐病，虽然贮藏5d桃果的腐烂率(24％)与本试验结果接近，但本试验所用桃果为水蜜桃，其品质特性决定该品种桃果更易被致病菌侵染，而且处理水蜜桃所用匍枝根霉孢子悬浮液为浓度为1×10⁵spores/mL，体积为30μL，而林丽等所用匍枝根霉孢子悬浮液剂量和浓度(20μL，1×10⁴spores/mL)均低于本试验(林丽，中国农业科学，2003，36(12):1535-1539)。虽然范青等用季也蒙假丝酵母处理大连黄桃，其控制效果高于本专利中膜醭毕赤酵母Y4菌悬液对“白凤”水蜜桃软腐病的控制效果，但处理条件差异较大，范青首先用5×10⁸cells/mL的季也蒙假丝酵母悬液处理大连黄桃，4h后才接种12uL浓度为5×10⁴spores/mL的葡枝根霉孢子悬浮液。(范青，植物学报(英文版)，2000，43(10):1033-1038)。

实施例4：膜醭毕赤酵母Y4的保存

首选培养基为NYDA培养基，也可以使用马铃薯琼脂培养基：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂15～20克，自来水1000毫升，pH 7.0～9.0。膜醭毕赤酵母Y4在上述培养基斜面上于28℃，培养48h后，于4℃低温保藏。