包封有BMP-2的PLGA微囊支架联合PRF在制备用于促进腱骨愈合药物中的应用

摘要

本发明公开了包封有BMP‑2的PLGA微囊支架联合PRF在制备用于促进腱骨愈合药物中的应用。本发明将PLGA微囊支架缓释BMP‑2与PRF植入联合使用，其中缓慢释放的BMP‑2能够以相对均匀的速度促进腱骨愈合界面的骨细胞和软骨细胞生成，而PRF则通过缓慢释放细胞因子，从而使得细胞因子也能够以相对均匀的速度促进腱骨愈合界面血管发生，促进骨‑肌腱结合部的愈合；BMP‑2与PRF相互递进，协同增效，PRF能够有效地促进新生骨细胞和软骨细胞与肌腱结合部的愈合能力，而只有新生骨细胞和软骨细胞与肌腱结合部实现良好愈合，BMP‑2才能进一步促进骨细胞和软骨细胞有效地新生。

说明书

技术领域

本发明属于韧带重建术后腱骨愈合技术领域，具体涉及包封有BMP-2的 PLGA微囊支架联合PRF在制备用于促进腱骨愈合药物中的应用。

背景技术

前交叉韧带(ACL)是膝关节的重要静力稳定结构，参与前方及侧方旋转稳定的维护，对维持膝关节功能极为重要。由于ACL损伤后自行修复的能力极差，临床治疗的主要方法是手术重建，据估计美国每年有超过20万的ACL重建手术(Frobell RB，Roos EM，RoosHP.et a1.A randomized trial of treatment for acute anterior cruciate ligamenttears.N Engl J Med，2010，363：331-342.)。大部分替代移植物有自体移植物、同种异体移植物和人工韧带，目前使用最多的是自体或异体肌腱(Celiktas M，Gopiznar A，Kose O，eta1.Prediction of the quadruple hamstring autograft thickness in ACLreconstrucfion usin ganthropometrie measures.Acta Orthop Traumatol Ture，2013，47(1)：14-18.；Coumapeau J，Klouche S，Hardy P.Material costs of anteriorcrueiate ligament reconstruction with hamstring tendons by two differenttechniques.Orthop Traumatol Surg Res，2013，99(2)： 196-201.)。

近年来，自体胭绳肌肌腱重建ACL重建越来越受欢迎。该术式与“骨-髌腱- 骨”移植物重建手术相比，虽可避免膝前取腱并发症如髌前疼痛、髌股关节炎、下跪困难、股四头肌力量下降，甚至髌骨骨折等，但早期(术后3周)腱-骨界面愈合却比骨-骨愈合差(TomitaF，Yasuda K，Mikarni S，et al.Comparisons of intraosseous graft healing betweenthe doubled flexor tendon graft and bone-patellar tendon-bone graft inanterior cruciate ligament reconstruction.Arthroscopy，2001,17 (5)：461-476.；周平，赵其纯，尚希福.韧带重建术后胜骨界面愈合相关研究进展[J].国际骨科学杂志，2012,33(6)：392-394.)。

以往研究显示，肌腱在骨道内的愈合模式有两种，一种是具有腱骨间软骨过渡区特征的直接愈合模式，类似正常的ACL止点(Xie G，Huangfu X，Zhao J.Prediction of thegraft size of 4-stranded semitendinosus tendon and 4-stranded graeilis tendonfor anterior cruciate ligament reconstruction：a Chinese Han patient study.AmJ Sports Med，2012，40(5)：1161-1166.)；此愈合模式仅存在于愈合后期的骨道入口处(Petersen W，Laprell H.Insertion of autologous tendon grafts tO the bone：ahistological and immunohistochemical study of hamstring and patellar tendongraft.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2000，8(1)：26-31.)。另一种肌腱愈合模式为间接式，其特点为肌腱和骨界面之间存在Sharpey样纤维 (Kawamura S，Ying L，KimHJ，et a1.Macmphages accumulate in the early phase of tendon-bone healing.JOrthop Res，2005，23(6)：1425-1432.)。除了腱骨愈合能力较差外，肌腱移植物重建ACL的另一个主要问题是愈合时间长。因此，如何缩短骨道内肌腱腱骨愈合的时间并提高其愈合能力已逐渐成为了近年来国内外学者关注的热点。

目前研究提示，以下一些基本因素是导致肌腱与骨隧道之间不能有效愈合的原因(Gulotta LV，Rodeo SA.Biology of autngraft and allograft healing in anteriorcruciate ligament reconstruction.C1in Sports Med，2007，26(4)：509-524.)：①缓慢或有限的骨长入导致腱-骨界面连接薄弱；②腱-骨界面未分化的祖细胞数量不足；③愈合过程缺乏协调组织再生的信号分子级联反应，导致其向瘢痕组织形成方向发展。因此，促进骨长入、提供祖细胞及生长因子等方法有助于促进腱-骨界面愈合，此外还可通过物理方法及组织工程方法改善腱-骨界面局部愈合条件。

随着组织工程研究深入，目前促进腱-骨愈合的实验研究越来越多，如Kohno 等(Gulotta LV,Kovacevic D,Ying L,et al.Augmentation of tendon-to-bone healingwith a magnesium-based bone adhesive[J].Am J Sports Med.2008， 36(7):1290-1297.)在对兔ACL重建后腱-骨界面FGF-2、VEGF、BMP-2和BMP-7 表达情况的研究中发现，FGF-2、VEGF主要促进术后早期腱-骨界面的纤维整合，而骨形态发生蛋白2(BMP2)则可明显促进腱-骨的骨整合。Ma等(Ma CB， Kawamura S，Deng XH，et a1.Bone morphogeneticproteins-signaling plays a role in tendon-to-bone healing：a study of rhBMP-2and noggin.Am J Sports Med，2007， 35(4)：597—604.)报道采用可注射性磷酸钙骨水泥(CPC)作为载体，将重组人 BMP2注射至兔ACL重建模型腱-骨界面，发现可增加新骨形成量并提高生物力学强度，但效应具有剂量依赖性，采用不同载体的BMP2释放效应亦不相同。BMP2制剂如果使用剂量远高于生理水平、活性因子的释放动力学不够科学，可出现诸如局部软组织水肿、异位骨化、种植体周围骨吸收及引发癌症等一系列的并发症。故有关载体、最佳剂量及生长因子在人体释放的有效时间等争议仍未解决。所以如果证实一种生物材料作为载体能可控地释放BMP2，则可以在安全浓度范围内，以较低的浓度、较少的制备成本、最大限度地促进使腱骨愈合。

微型包囊技术系利用天然的或合成的高分子材料(囊材)作为囊膜壁壳，将固态药物或液态药物(囊心物)包裹而成的药库型微型胶囊。药物在囊内通过扩散和渗透等形式在特定的位置以适当的速度和持续的时间释放出来，以达到更大限度地发挥药效的作用。近年来己有不少学者尝试将BMP以不同的高分子聚合物包封成微囊制成缓释制剂，让其释放出的BMP最大限度地保留其诱导成骨活性，又不至于剂量过髙引起副作用(Jeon O,SongSJ,Kang SW,Putnam AJ,Kim BS. Enhancement of ectopic bone formation by bonemorphogenetic protein-2released from a heparin-conjugated poly(L-lactic-co-glycolic acid)scaffold.Biomaterials 2007；28(17):2763-2771.)。2007年AnaJaklenec等(Jaklenec A,Wan E,Murray ME,Mathiowitz E.Novel scaffolds fabricatedfrom protein-loaded microspheres for tissue engineering.Biomaterials,2008；29:185-192.)试验了全新的支架合成方法，将包封小牛血清蛋白(BSA)的聚乳酸-聚乙二醇-聚乳酸三嵌段共聚物 (polylactic-co-glycolicacid，PLGA)微囊通过二氯甲烷密闭熏蒸法直接融合成支架并获得成功。这为组织工程骨及软骨支架的制备提供了一条崭新的思路。然而其进一步的生物学实验成果并未见报道。

同时，近年来国外研究报道富血小板血浆(Platelet rich plasma，PRP)可促进骨隧道中骨-肌腱结合部的愈合(Alsousou J,Ali A,Willett K,et al.The role ofplatelet-rich plasma in tissue regeneration[J].Platelets.2013；24(3):173-82.；Zhai W, Wang N,Qi Z,et al.Platelet-rich plasma reverses the inhibition oftenocytes and osteoblasts in tendon-bone healing[J].Orthopedics.2012,35(4):520-525.)。但由于 PRP存在免疫排斥及交叉感染的危险(何通文，师爱萍，葛振林，等.富血小板纤维蛋白应用于骨缺损修复的基础及临床研究进展[J].中华创伤杂志，2013,29(12)：1243-1246.)。因此作为第二代的血小板浓缩制品，富血小板纤维蛋白 (Plateletrich fibrin，PRF)应运而生。研究表明，网络于PRF网架结构中的血小板激活后能够释放多种生长因子，这些因子相互协调，共同促进成骨效应，并且效果优于PRP(Ozdemir H，Ezirganli S，Isa Kara M,et al.Effects of platelet rich fibrin alone used withrigid titanium barrier[J].Arch Oral Biol,2013,58(5):537-544.)。 PRF的纤维蛋白网架能够将血小板及其细胞因子以化学键方式结合起来，通过缓慢释放来延长细胞因子的作用时间(何通文，韩耀辉，牟兰，等.富血小板纤维蛋白与富血小板血浆修复兔颅顶骨缺损的比较研究[J].中华创伤杂志，2014,30 (10)：1050-1054.)。但目前有关PRF的报道多见于促进新生骨研究中，尚未见将PRF应用于腱骨愈合的实验报道。

发明内容

本申请提供了包封有BMP-2的PLGA微囊支架联合PRF在制备用于促进腱骨愈合药物中的应用，其中包封有BMP-2的PLGA微囊支架不仅稳定性好，而且BMP-2蛋白包封率高，活性损失小，BMP-2控释效果理想；包封有BMP-2 的PLGA微囊支架与PRF联用能够在更大程度上促进前交叉韧带(ACL)重建术后腱骨愈合。

因此，本申请还提供了用于促进ACL重建术后腱骨愈合的药物。所述的药物即由PRF和包封有BMP-2的PLGA微囊支架组成。

其中，所述的包封有BMP-2的PLGA微囊支架通过包含有以下步骤的制备方法制备而成：

(1)将BMP-2溶解于水中，获得W1溶液；

W1溶液中BMP-2的浓度不可太低，否则最终PLGA微囊中BMP-2的包封量太少；但W1溶液中BMP-2的浓度也不可太高，太高会影响BMP-2的包封率，造成BMP-2浪费。优选地，W1溶液中BMP-2的浓度为10-20mg/mL。

(2)将PLGA溶于有机溶剂中，获得有机相；

所述的有机溶剂可以是由CH₂Cl₂和TFE(四氟乙烯)以1:4的体积比混合而成的共溶溶剂，PLGA与该共溶溶剂的质量体积比优选为200mg:5mL。

(3)将W1溶液与有机相混合均匀，乳化，获得初始乳液；

两相的乳化可以通过超声处理或磁力搅拌来实现，其中，超声乳化的时间一般为20min。W1溶液与有机相的体积比为(1-4):1。

(4)将聚乙烯醇溶于水中，获得W2溶液；

(5)将初始乳液滴加到W2溶液中，乳化，获得复乳液；

同样地，上述乳化也可以通过超声处理或磁力搅拌来实现，其中，超声乳化的时间一般为10min。

(6)搅拌复乳液，挥发掉有机溶剂，固化形成微囊，将微囊反复清洗后，冷冻干燥，获得包封有BMP-2的PLGA微囊；

作为优选，将复乳液在700-900rpm、室温下搅拌2-3h，以使复乳液中的有机溶剂挥发干净，从而微囊可以固化。通过循环进行“加蒸馏水-离心-收集”的清洗步骤对微囊进行清洗，循环次数为至少三次；其中离心条件可以控制为：在8000rpm下离心10min。对清洗完成的微囊进行过夜冷冻干燥，并密封干燥保存于-20℃冰箱中备用。

微囊的大小是影响PLGA微囊支架的孔隙率和孔隙大小的一个直接因素，作为优选，包封有BMP-2的PLGA微囊的粒径在40～50μm之间。

(7)将4-20mg所述的PLGA微囊溶融至聚四氟乙烯3D模具中，将带PLGA 微囊的聚四氟乙烯3D模具置于含有二氯甲烷的密闭容器中，使PLGA微囊融合成PLGA微囊支架，将所述的PLGA微囊支架从聚四氟乙烯3D模具取出，真空干燥，获得所述的包封有BMP-2的PLGA微囊支架。

作为优选，PLGA微囊的融合时间为5-8min，使得包封有BMP-2的PLGA 微囊支架上形成有BMP-2缓释孔，所述BMP-2缓释孔的孔径为200-300nm，所述BMP-2缓释孔的面积占PLGA微囊支架表面积的比例(即孔隙率)为10-15％。

本发明通过控制微囊大小和二氯甲烷熏蒸时间(即PLGA微囊的融合时间) 来控制微囊支架上缓释孔的孔径和孔隙率。在上述的孔径和孔隙率下，BMP-2 能够在整个缓释过程中具有相对均匀的缓释速度。

作为优选，PRF与PLGA微囊支架中BMP-2的质量比为(1-4):1。

作为进一步优选，PRF与PLGA微囊支架中BMP-2的质量比为2:1。

制备时，在抽真空条件下将PRF与PLGA微囊支架混合，使PRF被吸附入 PLGA微囊支架的孔隙中，完成两者的复合。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明将包封有BMP-2的PLGA微囊支架应用于ACL重建术后骨隧道内腱骨愈合界面，一方面，PLGA微囊支架具有良好的稳定性，能够填充骨隧道空隙，产生临时固定，减少移植物在骨隧道微动，同时防止关节液流入；另一方面，PLGA微囊支架对BMP-2的包封率高，通过控制微囊大小和二氯甲烷熏蒸时间可以控制微囊支架上缓释孔的孔径和孔隙率，在适宜的孔径和孔隙率下，BMP-2能够在整个缓释过程中具有相对均匀的缓释速度，BMP-2活性损失小，控释效果理想，释放出的BMP-2能最大限度地保留其诱导成骨活性，又不至于剂量过髙引起副作用。

(2)本发明将PRF与包封有BMP-2的PLGA微囊支架联用，PRF的纤维蛋白网架能够将血小板及其细胞因子以化学键方式结合起来，通过缓慢释放来延长细胞因子的作用时间；

PLGA微囊支架缓释BMP-2与PRF植入两种手段联合使用，其中缓慢释放的BMP-2能够以相对均匀的速度促进腱骨愈合界面的骨细胞和软骨细胞生成，而PRF则通过缓慢释放细胞因子，从而使得细胞因子也能够以相对均匀的速度促进腱骨愈合界面血管发生，促进骨-肌腱结合部的愈合；BMP-2与PRF相互递进，协同增效，PRF能够有效地促进新生骨细胞和软骨细胞与肌腱结合部的愈合能力，而只有新生骨细胞和软骨细胞与肌腱结合部实现良好愈合，BMP-2才能进一步促进骨细胞和软骨细胞有效地新生。

(3)PRF是吸附入PLGA微囊支架的孔隙中的，因此BMP-2与PRF的作用位点是一致的，PLGA微囊支架既成为了PRF的支撑物，也成为了控制PRF 缓释细胞因子的重要因素。

附图说明

图1为不同BMP-2浓度下PLGA微囊的BMP-2包封效率；

图2为在不同熏蒸时间下获得的PLGA微囊支架的BMP-2缓释速度比较结果图；

图3为采用不同治疗方案处理动物后各处理组血清中BMP-2的浓度；

其中，A为阴性对照组，B为PLGA微囊支架介导的BMP-2缓释体系联合 PRF组，C为PLGA微囊支架介导的BMP-2缓释组，D为PRF组；下同；

图4a为采用不同治疗方案处理动物后各处理组组损伤部位中VEGF的表达情况；

图4b为采用不同治疗方案处理动物后各处理组组损伤部位中FGF-2的表达情况；

图5为采用不同治疗方案处理动物后各处理组ACL的最大载荷测定情况。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。

实施例1

1、PLGA微囊支架介导的BMP-2缓释体系的制备

(1)PLGA微囊的制备

将BMP-2溶解于200μg蒸馏水中，为保证充分溶解，可以使用磁力搅拌器搅拌5min，分别制得具有不同BMP-2浓度的W1溶液；将200mg的PLGA溶于5mL共溶溶剂中(由CH₂Cl₂和TFE(四氟乙烯)以1:4的体积比混合而成)，制得有机相O；将W1溶液与有机相混合均匀，超声乳化20min，获得初始乳液；将聚乙烯醇(PVA)溶于40mL水中，获得PVA浓度为5％的W2溶液作为外水相；将初始乳液滴加到外水相中，超声乳化10min，形成复乳液；以800rpm的速度在室温下搅拌2h，使有机溶剂挥发，使微囊固化；将微囊予以反复离心>

将20mg微囊悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)中。将样品置于恒温振荡箱中(100rpm，37℃)振荡36小时。然后将样品离心，收集上清液，过滤，用BMP-2 ELISA试剂盒测定上清液中BMP-2浓度，由此推算出微囊包封的BMP-2的量。

PLGA微囊的BMP-2包封效率计算公式如下：

EE(％)＝【(BMP-2总量–BMP-2剩余量)/BMP-2总量】*100％。

不同BMP-2浓度的W1溶液对BMP-2包封效率的影响如图1所示。由图1 可见，BMP-2浓度在5-20mg/mL时，包封效率均达到80％以上；BMP-2浓度提高至30mg/mL时，包封效率降至70％以下，表明BMP-2浓度过高不利于包封。为了保证PLGA微囊中BMP-2的包封量，本实施例选择BMP-2浓度为15mg/mL 的W1溶液。

复乳液的搅拌时间对最终形成的PLGA微囊的粒径会存在影响，本实施例为了保证获得具有适宜孔隙率和孔隙大小的PLGA微囊支架，搅拌时间控制在2 h，使PLGA微囊的粒径在40～50μm之间。

(2)PLGA微囊支架的制备(参考文献：Jaklenec A,Wan E,Murray ME,MathiowitzE.Novel scaffolds fabricated from protein-loaded microspheres for tissueengineering. Biomaterials,2008；29:185-192.中公开的相关内容进行)

将PLGA微囊融合到由聚四氟乙烯制备的3D模具中。4-20毫克的微囊加入到盘状模具中(6mm直径)，并放在密封的含有3mL二氯甲烷的玻璃器皿中(玻璃器皿的体积为137.6mL)；将器皿密闭，使PLGA微囊在二氯甲烷的熏蒸(熏蒸不同时间)下融合形成具有BMP-2缓释孔的PLGA微囊支架；之后将含有 PLGA微囊支架的模具取出，室温下放置十分钟，之后将PLGA微囊支架从模具上取下，在真空中干燥过夜，所得的PLGA微囊支架保存于-20℃冰箱备用。

分别检测在不同熏蒸时间下获得的PLGA微囊支架的BMP-2缓释速度，检测在37℃的PBS(pH 7.4)缓冲液中进行。将10mg PLGA微囊支架放入盛有1ml PBS的EP管中，800rpm下离心30分钟，吸出缓释液，并储存于-20℃冰箱，至检测时解冻测其内BMP-2的浓度；加入1ml新的PBS至EP管中放回恒温箱，待下一次测量，缓释液中BMP-2浓度通过BMP-2ELISA试剂盒测定。检测结果如图2。

由图2所示，熏蒸6min获得的PLGA微囊支架具有良好的BMP-2缓释曲线。而熏蒸4min获得的PLGA微囊支架前期的BMP-2缓释速度较快，缓释量相对较大，BMP-2缓释后劲不足，可能是熏蒸时间过短，缓释孔孔径过大造成的。而熏蒸10min获得的PLGA微囊支架整体的BMP-2缓释较慢，且起始缓释量较小，缓释后劲仍旧不足；这可能是因为熏蒸时间过长，缓释孔孔径过小引起的。

电镜检测到熏蒸6min获得的PLGA微囊支架中，BMP-2缓释孔的孔径为 200-300nm，孔隙率为12％。

2、使用PLGA微囊支架介导的BMP-2缓释体系联合PRF治疗兔肩袖急性断裂

(1)PRF的制备

采用速眠新进行新西兰白兔静脉麻醉。用6号采血针头及负压采血管各采集10ml静脉血，将静脉血立即以3000r/min的速度于低速离心机中离心10min，静置大约3～5分钟后取出；取中间层PRF凝胶，弃上清液，并剪去凝胶状物质下端的红细胞碎片，剩下的即为PRF凝胶。

(2)包封BMP2的PLGA微囊支架与PRF复合物的制备

将包封BMP2的PLGA微囊支架和PRF凝胶在抽真空条件下混合，使PRF 被吸附入PLGA微囊支架的孔隙中，完成两者的复合。

(3)兔肩袖急性断裂术后腱-骨修复动物模型的建立及分组

选取健康成年新西兰白兔60只，雌雄不限，体质量(3.0±0.5)kg，兔普通饲料喂养，24h循环光照，自由摄食、饮水，所有动物均无手术区创伤、感染及畸形，也无其他全身疾病，所有操作程序均遵守动物实验准则。

60只白兔按照动物实验科研设计常用分组方法随机(随机数字表法)分为4 组，每组5只。其中A组为阴性对照组，B组为PLGA微囊支架介导的BMP-2 缓释体系联合PRF组、C组为PLGA微囊支架介导的BMP-2缓释组、D组为 PRF组。

用速眠新进行动物静脉麻醉，消毒、铺单，取右膝膑腱内侧切口，分离出半腱肌和股薄肌，保留远端止点，从腱和肌腹交界处切断，制作成单股肌腱移植物备用。切开膝关节囊，脱位髌骨，于止点处将ACL完整切除，查抽屉试验、 Lachman试验阳性。根据预试验结果，兔半腱肌肌腱直径约为1.5～2.0mm，选用2.0mm钻头自胫骨结节内上方骨面向原交叉韧带下止点钻直径约2.0mm 的隧道，通过该隧道再向上、向外、向后至股骨髁髁问侧面，靠近ACL止点处钻骨隧道，用钢丝将制作好的移植肌腱穿越胫骨、股骨隧道，于屈膝30°拉紧，屈伸膝关节20次，将外侧端移植肌腱与股骨隧道外口周围软组织逢合。

A组：骨隧道内单纯植入肌腱，不另外加入任何物质。B组：将包封BMP-2 的PLGA微囊支架及PRF复合物塞入股骨隧道内，每只需复合物4～6粒，压实，用手术线将移植肌腱与骨基质固定在一起。C组：将包封BMP-2的PLGA微囊支架塞入股骨隧道内。D组：在股骨隧道内填入PRF凝胶。

(4)术后处理

术后，新西兰大白兔均分笼喂养，并行切口换药处理。术后3d青霉素注射液80万单位肌肉注射。

(5)BMP-2和损伤部位中组织修复相关的因子的表达

术后第四周、第八周安乐死兔子，收取血液样本，1500rpm离心20min留取血清，检测不同处理组中BMP-2的浓度。收取损伤部位组织样本时，留取一部分(要求每组取得损伤部位应该保持一致)，使用组织破碎仪打碎组织，然后使用trizol提取其中的RNA，反转后使用RT-PCR技术检测损伤部位中组织修复相关的因子的表达(如IFN-γ，TNF-α，IL-1，VEGF，BMP-2，BMP-7和FGF-2 等)。

各处理组血清中BMP-2的浓度如图3所示。由图3可见，在各处理组中， B组在术后四周和术后八周的血清中都具有相对较高的BMP-2浓度，不仅优于 A组，而且均优于C组和D组。

各处理组损伤部位中组织修复相关的因子的表达情况如图4a和图4b所示。由图4a和图4b可见，在各处理组中，B组在术后四周和术后八周时损伤部位中 VEGF和FGF-2因子的表达水平均优于其他处理组。

(6)生物力学测定

实验对象分别于重建术后12周时取材，利用耳后空气栓塞处死。切取动物的术后关节，各保留股骨远端和胫骨近端4cm，去除周围软组织，切除半月板以及后交叉韧带，仅保留重建后的前交叉韧带，生理盐水冲洗关节标本，盐水敷料包裹，塑料袋封存置于-80°深低温冰箱保存。实验前把标本解冻，把各个标本用桶形卡具加横行钢钉固定胫骨及股骨骨性部分，牙膏粉包埋。股骨与胫骨分别固定于生物力学测试机。实验前进行预载，以清除组织松弛、蠕变效应的影响。试验过程中先观察重建ACL的断裂部位或是否从骨隧道内拉出，记录断裂最大负荷，通过试验机绘出载荷-位移曲线图，使用视频位移记录移植物的位移变化量(100帧/s)，软件计算最大载荷(maximus load，N)，测定结果见图 5。

由图5可见，处理组B术后四周的样品的最大载荷接近30N，术后八周样品的最大载荷达到36.2N，均远远高于其他处理组。