基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子的方法

摘要

本发明公开了基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子的方法。采用的传感器包括适体DNA、分子信标；适体DNA的中部含有能够对PDGF‑BB进行特异性识别的适体序列，当适体DNA未与PDGF‑BB结合时，适体DNA呈现的构象含有至少3个小茎‑环结构，当适体DNA与PDGF‑BB结合时，适体DNA呈现的构象含有一个大茎‑环结构，且大茎‑环结构的环结构含有至少2个小茎‑环结构，且大茎‑环结构的5′端和3′端均具有未杂交的自由序列；分子信标的DNA序列与大茎‑环结构的5′端和3′端的自由序列互补，互补后分子信标的5′端长于大茎‑环结构的3′端。本发明能够进行简单、快速、高灵敏、高选择性的定量检测。

说明书

技术领域

本发明属于荧光检测生物分子技术领域，具体涉及基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)的方法。

背景技术

蛋白质作为机体细胞的重要组成部分，是人体组织更新和修补的主要原料。在生物体的各项生命活动扮演及其重要的角色，尤其是与癌症相关蛋白质的识别、筛选、检测和定量分析在临床医疗诊断、预防、治疗显得格外重要。一般来说，肿瘤标志物检测的通用方法都是基于其与相应抗体的特意识别。通过与其他技术的联合，如拉曼散射、分子信标、电化学传感器、功能化的金属纳米粒子和滚环扩增，各种各样的检测策略得到发展。然而这些方法通常受限于窄的线性范围、多重分析步骤、酶标记以及精密的实验设备。因此发展简单、快速、高灵敏、高选择性以及不费时的蛋白质定量方法依然备受期待，尤其在一些资源相对匮乏的地区。

核酸适体是一种通过指数富集的配基系统进化技术人工合成的短链核酸(DNA或RNA),能与相应的蛋白质或靶标特异性结合。在电化学、场效应晶体管、压电晶体的基础上，许多适配体传感器得以构建。

分子信标技术是一种建立在碱基互补配对和荧光共振能量转移原则上的分析策略，具有极好地专一性以及选择性使得它在基础医学、生物学上得到广泛应用。当没有靶标存在时，分子信标处于发夹状，荧光基团与猝灭基团之间的距离足够近可发生荧光共振能量转移。荧光被猝灭基团吸收以热量的形式消散，此时的荧光背景很低。然而随着靶标加入，分子信标环状区碱基与靶标互补配对形成刚性的DNA双螺旋结构使得茎秆区被打开导致荧光基团与猝灭基团分离，阻碍了荧光共振能量转移过程，最终荧光得以恢复。

PDGF-BB作为人体血小板中含有的一种促进细胞有丝分裂、趋化活性的生长因子，在正常细胞中含量较少，但在一些人类肿瘤细胞中却常常发生基因过表达，是癌症诊断中的一种标志物。然而，现有文献中极少关于如何利用适体、分子信标对PDGF-BB进行简单、快速、高灵敏、高选择性的定量检测。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子BB的传感器。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子BB的传感器，包括适体DNA、分子信标；

所述适体DNA的中部含有能够对PDGF-BB进行特异性识别的适体序列，当适体DNA未与PDGF-BB结合时，适体DNA呈现的构象含有至少3个小茎-环结构，当适体DNA与PDGF-BB结合时，适体DNA呈现的构象含有一个大茎-环结构，且大茎-环结构的环结构含有至少2个小茎-环结构，且大茎-环结构的5′端和3′端均具有未杂交的自由序列；

所述分子信标的DNA序列能够与大茎-环结构的5′端和3′端的自由序列互补，且互补后分子信标的5′端长于大茎-环结构的3′端。

分子信标(Molecularbeacon)是一种荧光标记的寡核苷酸链。即两端分别连接荧光基团和猝灭基团，常规状态下的分子信标呈现茎-环结构，5′端和3′端齐平，没有荧光产生，而当分子信标与目标序列杂交后，茎-环结构打开，猝灭基团原料荧光基团，从而产生荧光。本发明通过适体DNA与PDGF-BB产生的构象变化，使得目标序列能够随着适体DNA构象的变化而裸露出来，从而诱导分子信标由产生荧光的变化，进而对PDGF-BB产生传感作用。

优选的，所述DNA序列由5′端至3′端的序列为：

TGCACCTCAGCAGCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGCATCCGAGCAGGAACGA(详见SEQ ID NO.1)。

优选的，所述分子信标由5′端至3′端的序列为：

CGACTCGTTCCTGCTCGGATCTGAGGTGCAGTGAAAACGAGTCG(详见SEQ ID NO.2)。

本发明的目的之二是提供一种与上述传感器配合的引物DNA，所述引物DNA能够引发脱氧核糖核苷酸以分子信标的DNA序列为模板进行聚合，且引物DNA中含有DNA剪切酶的识别位点。

能够获得更多与分子信标杂交的DNA序列，使更多的分子信标产生荧光。

优选的，引物的序列为：CGACTCGT(详见SEQ ID NO.3)。

本发明的目的之三是提供一种基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子BB的传感系统，包括上述传感器、上述引物DNA。

本发明的目的之四是提供一种基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子BB的方法，将含有PDGF-BB的待测物与上述传感器混合，PDGF-BB与适体DNA结合后，适体DNA产生构象变化，使其在5′端和3′端裸露出能够与分子信标1的DNA序列互补的自由序列，并与分子信标1的DNA序列杂交，然后上述引物DNA与分子信标1的5′端的序列结合，在DNA聚合酶的作用下，以分子信标1为模板生成DNA序列并替换适体DNA，从而形成双链DNA，被替换的适体DNA与分子信标2的DNA序列杂交，然后在引物DNA和DNA聚合酶的作用下循环产生大量双链DNA，双链DNA在DNA剪切酶以及DNA聚合酶的作用下再次以分子信标为模板形成双链DNA并替换出分子信标1的互补链，产生的互补链与分子信标3杂交，从而放大荧光信号。

本发明中通过适体DNA的构象变化，不断的将分子信标打开产生荧光信号，同时通过分子信标的DNA序列作为模板，在引物DNA、DNA聚合酶和DNA剪切酶的作用下进一步聚合出更多的能够与分子信标的DNA序列互补的互补DNA单链，从而打开更多的分子信标，从而增强荧光信号。

本发明的目的之五是提供一种荧光检测PDGF-BB的试剂盒，包括上述传感器、上述引物DNA、DNA聚合酶、DNA剪切酶、dNTPs。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种新的检测PDGF-BB的传感器，传感器中包括适体DNA和分子信标，适体DNA有两个目的：1.与PDGF-BB特异性结合，2.构象转变裸露出与分子信标互补的DNA序列；分子信标有两个目的：1.提供荧光信号，2.提供模板序列。巧妙利用适体构象变化和分析信标的茎秆区打开导致荧光基团与猝灭基团的分离，从而使传感器对对PDGF-BB产生荧光信号，从而对PDGF-BB进行定量检测。

本发明提供的方法步骤简单，仅需要将含有PDGF-BB的待测物添加至含有传感器、引物、DNA聚合酶、DNA剪切酶、dNTPs等的试剂盒中，进行一步操作即可完成对PDGF-BB的检测。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1为本发明荧光检测的原理图；

图2为不同反应阶段的荧光强度，a为水，b为空白，c为PDGF-BB、适体DNA和分子信标，d为PDGF-BB、适体DNA、分子信标和DNA聚合酶，e为PDGF-BB、适体DNA、分子信标、DNA聚合酶和DNA剪切酶；

图3为不同PDGF-BB浓度的荧光测试题，A为荧光强度曲线(a和g的浓度分别为1ng/mL、100ng/mL)，B为浓度与荧光强度的线性关系图；

图4为本发明荧光检测方法的特异性柱状图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本申请中所述的适体DNA、分子信标的DNA序列、引物DNA均为单链DNA。

本申请中所述的分子信标1、分子信标2、分子信标3的化学结构相同，仅仅为了区别方法中并非采用一个分子信标，并不是对分子信标先后顺序作出的限定。

正如背景技术所介绍的，现有技术中存在极少有关于如何利用适体、分子信标对PDGF-BB进行简单、快速、高灵敏、高选择性的定量检测报道的不足，为了解决如上的技术问题，本申请提出了基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子的方法。

本申请的一种典型实施方式，提供了一种基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子BB的传感器，包括适体DNA、分子信标；

所述适体DNA的中部含有能够对PDGF-BB进行特异性识别的适体序列，当适体DNA未与PDGF-BB结合时，适体DNA呈现的构象含有至少3个小茎-环结构，当适体DNA与PDGF-BB结合时，适体DNA呈现的构象含有一个大茎-环结构，且大茎-环结构中的环结构中含有至少2个小茎-环结构，且大茎-环结构的5′端和3′端均具有未杂交的自由序列；

所述分子信标的DNA序列能够与大茎-环结构的5′端和3′端的自由序列互补，且互补后分子信标的5′端长于大茎-环结构的3′端。

分子信标(Molecularbeacon)是一种荧光标记的寡核苷酸链。即两端分别连接荧光基团和猝灭基团，常规状态下的分子信标呈现茎-环结构，5′端和3′端齐平，没有荧光产生，而当分子信标与目标序列杂交后，茎-环结构打开，猝灭基团原料荧光基团，从而产生荧光。本申请通过适体DNA与PDGF-BB产生的构象变化，使得目标序列能够随着适体DNA构象的变化而裸露出来，从而诱导分子信标由产生荧光的变化，进而对PDGF-BB产生传感作用。

优选的，所述DNA序列由5′端至3′端的序列为：

TGCACCTCAGCAGCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGCATCCGAGCAGGAACGA(详见SEQ ID NO.1)。

优选的，所述分子信标由5′端至3′端的序列为：

CGACTCGTTCCTGCTCGGATCTGAGGTGCAGTGAAAACGAGTCG(详见SEQ ID NO.2)。

本申请的另一种实施方式，提供了一种与上述传感器配合的引物DNA，所述引物DNA能够引发脱氧核糖核苷酸以分子信标的DNA序列为模板进行聚合，且引物DNA中含有DNA剪切酶的识别位点。

能够获得更多与分子信标杂交的DNA序列，使更多的分子信标产生荧光。

优选的，引物的序列为：CGACTCGT(详见SEQ ID NO.3)。

本申请的第三种实施方式，提供了一种基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子BB的传感系统，包括上述传感器、上述引物DNA。

本申请的第四种实施方式，提供了一种基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子BB的方法，将含有PDGF-BB的待测物与上述传感器混合，PDGF-BB与适体DNA结合后，适体DNA产生构象变化，使其在5＇端和3′端裸露出能够与分子信标1的DNA序列互补的自由序列，并与分子信标1的DNA序列杂交，然后上述引物DNA与分子信标1的5′端的序列结合，在DNA聚合酶的作用下，以分子信标1为模板生成DNA序列并替换适体DNA，从而形成双链DNA，被替换的适体DNA与分子信标2的DNA序列杂交，然后在引物DNA和DNA聚合酶的作用下循环产生大量双链DNA，双链DNA在DNA剪切酶以及DNA聚合酶的作用下再次以分子信标为模板形成双链DNA并替换出分子信标1的互补链，产生的互补链与分子信标3杂交，从而放大荧光信号。

本申请中通过适体DNA的构象变化，不断的将分子信标打开产生荧光信号，同时通过分子信标的DNA序列作为模板，在引物DNA、DNA聚合酶和DNA剪切酶的作用下进一步聚合出更多的能够与分子信标的DNA序列互补的互补DNA单链，从而打开更多的分子信标，从而增强荧光信号。

优选的，步骤为：将适体DNA加入至含有PDGF-BB的待测物中预反应一段时间，然后加入KF缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、DNA剪切酶、NEB 2缓冲液、分子信标、引物DNA培育一段时间后进行荧光检测。

进一步优选的，预反应的时间为15～20min。预反应温度为37±0.5℃。

进一步优选的，培育的时间为1±0.1h。培育的温度为37±0.5℃。

进一步优选的，培育后进行终止聚合反应后进行荧光检测。

本申请的第五种实施方式，提供了一种荧光检测PDGF-BB的试剂盒，包括上述传感器、上述引物DNA、DNA聚合酶、DNA剪切酶、dNTPs。

优选的，包括KF缓冲液、dNTPs、NEB 2缓冲液。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

仪器与试剂

荧光光谱由Hitachi F-7000荧光光谱仪记录(Hitachi Ltd.,Japan)。激发和发射下风设置为5nm。激发波长为640nm，采集范围为650～750nm。选取670nm处的荧光强度评估该策略的性能。前列腺特性抗原、癌胚抗原、牛血清白蛋白以及葡萄糖订购自上海生工生物技术有限公司。脱氧核苷酸混合液、Klenow fragment exo以及其培养液购买于上海Generay生物技术有限公司。血小板源性生长因子BB由南京Peprotech生物技术有限公司提供。本实验采用超纯水(18.25MΩcm,24℃)，其他试剂均为分析纯。寡聚核苷酸购于上海Invitrogen生物技术有限公司。其DNA序列如表1中所示：

表1：本实验中用到的DNA序列

DNA保存溶液：去离子水稀释。PDGF-BB蛋白质保存于4mM HCl，0.1％牛血清白蛋白中。使用前DNA和PDGF-BB蛋白用PBSM缓冲液稀释(137mM NaCl，10.1mM Na₂HPO₄,1.8mMKH₂PO₄,pH7.4,2.7mM>2)。

步骤

(1)样品检测：PDGF-BB适体(5μL，1μM)中加入特定浓度的PDGF-BB样品(5μL)，37℃下反应15min,然后加入2.5×KF缓冲液(2.5μL)，2.5μL，2mM dNTPs，2.5uL KF聚合酶(2u/μL)，5μL剪切酶(2u/μL)，1×NEB 2缓冲液(2.5uL)，50nM分子信标,500nM DNA引物在37℃下培育1h。

(2)荧光检测：样品反应1h后，加入0.5M EDTA(1μL)室温反应10min终止聚合反应，然后加入0.25×KF缓冲液(74μL或174μL)进行荧光检测。

结果与讨论

原理见图1，5'端、3'端分别带有Cy5和BHQ3的分子信标，聚合酶，剪切酶，引物DNA，以及适体DNA组成。在没有PDGF-BB的情况下，DNA适配体主要第一种构象形式存在于溶液中，一旦PDGF-BB蛋白与其特异性结合就会诱导适配体构象改变为第二种构象。此时适配体两端的DNA正好与分子信标环状区碱基互补使其处于自由展开状态释放荧光；随后引物DNA与分子信标5'端的序列结合在DNA聚合酶的作用下，以分子信标为模板生成新的DNA单链并替换适体。随之溶液中的其他分子信标又迅速的与被替换的适体杂交释放荧光触发一个循环放大。同时第一步循环中生成的双链DNA在剪切酶的作用下被切开，在聚合酶的帮助下再一次以分子信标为模板生成新的DNA双链并取代之前的互补链；而被取代下来的DNA链与分子信标中碱基大部分配对并打开溶液中其他的信标分子，随着反应的不断进行两个循环不断放大产生的荧光信号直到溶液中原料耗尽或者人为终止反应。

通过检测不同反应阶段的荧光强度来证明该方法中是否可行，如图2所示，在曲线a和b中几乎没有荧光信号被检测到表明在整个反应阶段中水没有影响，背景信号也极低。未加入PDGF-BB蛋白时，适体以第一种构象存在导致整个反应链在最初即处于禁止状态。曲线c显示随着PDGF-BB加入诱导适体构象变化释放与靶标浓度相关的荧光，基于此种构象诱导的信号“开”模式许多方法得到提出；与c相比较，聚合酶被引入曲线d所对应的溶液中。曲线d的荧光强于c归因于循环1中反应，说明方案中的第一次循环反应是成功的；随后，d体系的基础上，剪切酶被加入曲线e的溶液中。荧光信号的增强说明设计中的第二次循环是有效的。在靶标浓度相同的情况下，本申请的方法可以产生最高的荧光信号，这意味着更低的检出限和更高的灵敏度。

通过对PDGF-BB蛋白检测可用来检测本申请方法的性能。适体DNA与靶标混合使之转变为可激活反应链的构象，随后加入脱氧核糖核苷酸原料、DNA聚合酶、引物DNA和DNA剪切酶孵育适当时间后加入EDTA终止反应，进行荧光测试。如图3，所示荧光强度与靶标浓度之间的关系可用方程式y＝5.89x+142.80(R ²＝0.991)表示；线性范围在1～100ng/mL，检出限为0.74ng/mL良好的性能归功于设计中的高放大效率。

专一性和灵敏度是评价分析方法两个必不可少的因素。为避免假阳性结果的出现，在相同的分析条件下，分别检测前列腺特性抗原、癌胚抗原、牛血清白蛋白以及葡萄糖。如图4，所示该方法具有极好的专一性。一定浓度的PDGF-BB蛋白以标准加样法分别加入5％牛血清蛋白和人血清中。如表1所示，加标回收率位于97.0～110.4％之间，表明该方法在复杂样品中也有很好的选择性。

结论

总而言之，基于PDGF-BB蛋白质与适体的特异性识别和DNA链的等温扩增技术，建立了一种无须多重洗涤步骤、无须昂贵仪器设备、简单、具有高选择性和灵敏性的检测平台，并应用于PDGF-BB蛋白的定量分析。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛大学

<120> 基于适体构象变化的荧光检测血小板源性生长因子的方法

<130> 2018

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgcacctcag cagcaggcta cggcacgtag agcatcacca tgatcctgca tccgagcagg 60

aacga 65

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgactcgttc ctgctcggat ctgaggtgca gtgaaaacga gtcg 44

<210> 3

<211> 8

<212> DNA

<213> 引物

<400> 3

cgactcgt 8