一种通过高效液相检测桂美辛相关产品中有关物质的方法

摘要

一种应用于药物检测领域中的通过高效液相检测桂美辛相关产品中有关物质的方法，该方法采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；乙腈和磷酸二氢钾缓冲溶液为梯度洗脱流动相：能够对桂美辛合成过程中产生的杂质进行追踪、溯源，与现有技术相比具有专属性好，灵敏度高，耐用性、检测限等均能符合要求，能够广泛地应用于药物分析领域，同时为产品质量控制和工艺优化提供重要依据。

说明书

技术领域

本发明涉及药物分析领域中的一种通过高效液相检测桂美辛相关产品中有关物质的方法。

背景技术

桂美辛又名吲哚拉新、吲哚新、桂吲乙酸，为抗炎镇痛药，是通过对环氧酶的抑制而减少前列腺素的合成，而产生镇痛作用。通过抑制白细胞的趋化性及溶酶体的释放，抑制炎性症状。由于抑制下视丘体温调节中枢前列腺素合成和释放，引起外周血管扩张及出汗，使散热增加而产生解热作用。桂美辛适应症为急、慢性风湿性关节炎、类风湿关节炎、强直性脊柱以及其他炎症性疼痛，在治疗肾绞痛疾病方面也取得了显著疗效。桂美辛具有抗炎活性强，抗水肿作用明显，毒性低，服用安全的特点，在临床上得到了应用广泛。

依照国家药品标准WS-10001-(HD-0272)-2002规定，目前桂美辛有关物质的检验方法采用薄层色谱法，此法专属性差、灵敏度低、重复性差，只能进行有关物质的限度检测，无法定量。而关于桂美辛相关产品(合成桂美辛的起始原料、中间体以及桂美辛成品)中有关物质定量的检验方法未见相关文献报道。因此，研制开发一种简单、高效，适用于桂美辛相关产品中有关物质检测的方法是亟待解决的新课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过高效液相检测桂美辛相关产品中有关物质的方法。该方法同时适用于合成桂美辛的起始原料、中间体和桂美辛成品的有关物质检测，专属性好，灵敏度高，可对杂质进行定量检测。该方法采用梯度洗脱，并通过调节流动相B磷酸二氢钾缓冲溶液的pH值，使合成桂美辛的起始原料、中间体和桂美辛成品都具有合理的保留时间，能够很好地对各组分进行分离，利于桂美辛合成过程中对产生的杂质进行追踪、溯源，同时为产品质量控制和工艺优化提供重要依据。

本发明的目的是这样实现的：一种通过高效液相检测桂美辛相关产品中有关物质的方法，该检测方法包括如下步骤：

(1)色谱条件：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：流动相A:乙腈；

流动相B:磷酸二氢钾缓冲溶液：

所述流动相采用梯度洗脱的方式；

(2)供试品溶液的制备：

精密称取样品适量，加乙腈溶解并稀释，作为供试品溶液；

(3)对照溶液的制备：

精密量取供试品溶液适量，用流动相稀释，作为对照溶液；

(4)测定方法：

取对照溶液注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20％；再精密量取供试品溶液与对照溶液，注入液相色谱仪，记录图谱，用主成分自身对照法测定，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍，计算单个杂质和总杂质的含量；

一种通过高效液相检测桂美辛相关产品中有关物质的方法，该检测方法包括如下步骤：

(1)色谱条件：

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；

流动相：流动相A:乙腈；

流动相B:磷酸二氢钾缓冲溶液：

所述流动相采用梯度洗脱的方式；

(2)供试品溶液的制备：

精密称取样品适量，加乙腈溶解并稀释，作为供试品溶液；

(3)测定方法：

取供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色图谱，用面积归一法进行测定，计算单个杂质和总杂质的含量；

所述流动相B为磷酸二氢钾缓冲水溶液，用氢氧化钾水溶液调节pH至4.0；所述流动相B为0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲水溶液，用20％氢氧化钾水溶液调节 pH至4.0；在步骤(2)中，所述的样品为桂美辛成品；所述对照溶液的进样量为10μl-100μl，优选的对照溶液的进样量为20μl；所述对照溶液的配制方法为：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀；在步骤(2)中，所述的样品为合成桂美辛的原料或合成桂美辛的中间体；所述合成桂美辛的原料包括对氨基苯甲醚，所述合成桂美辛的中间体包括对甲基苯肼磺酸钠、肉桂肼；所述梯度洗脱的具体方法为：0分钟，流动相A为10％-50％，流动相B为90％-50％；6分钟，流动相A为10％-50％，流动相B为90％-50％；26 分钟，流动相A为50％-90％，流动相B为50％-10％；30分钟，流动相A为50％-90％，流动相B为50％-10％；40分钟，流动相A为10％-50％，流动相B为90％-50％；50 分钟，流动相A为10％-50％，流动相B为90％-50％；优选的所述梯度洗脱的具体方法为：0分钟，流动相A为30％，流动相B为70％；6分钟，流动相A为30％，流动相B为70％；26分钟，流动相A为70％，流动相B为30％；30分钟，流动相A为70％，流动相B为30％；40分钟，流动相A为30％，流动相B为70％；50分钟，流动相A为30％，流动相B为70％；所述检测方法的检测器为紫外检测器，所述紫外检测器的检测波长为291nm，所述流动相的流速为0.8ml/min-1.2ml/min，优选流动相的流速为1.0ml/min，所述柱温为25℃-45℃，优选柱温为35℃，所述供试品溶液的进样量为10μl-100μl，优选的供试品溶液的进样量为20μl；所述供试品溶液的制备方法为精密称定供试品适量，加乙腈溶解并定量稀释制成每 1ml中含0.2mg的溶液，作为供试品溶液；所述方法中，单个杂质和总杂质的计算方法为：

本发明的要点在于建立了一种通过高效液相检测桂美辛相关产品中有关物质的方法，该方法同时适用于合成桂美辛的起始原料对氨基苯甲醚，主要中间体对甲基苯肼磺酸钠、肉桂肼和桂美辛成品的有关物质检测，能够对桂美辛合成过程中产生的杂质进行追踪、溯源，该检测方法与现有技术相比，专属性好，灵敏度高，耐用性、检测限等均能符合要求，能够广泛地应用于药物分析领域，同时为产品质量控制和工艺优化提供重要依据。

附图说明

图1是桂美辛成品有关物质检测的高效液相色谱图

图2是中间体肉桂肼有关物质检测的高效液相色谱图

图3是中间体对甲基苯肼磺酸钠有关物质检测的高效液相色谱图

图4是合成桂美辛的起始原料对氨基苯甲醚有关物质检测的高效液相色谱图

具体实施方式

以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。

实施例一

流动相的选择

选择醋酸水溶液--乙腈、磷酸盐缓冲液--乙腈两种流动相体系。用醋酸水溶液--乙腈体系时，无法将各组分完全分离；磷酸盐缓冲液--乙腈体系，由于选取缓冲盐的浓度较小，在保证色谱峰保留时间有较好重复性的同时，对色谱柱的损伤较小，峰型对称，分离效果好。因此，选择磷酸盐缓冲液--乙腈体系作为流动相。

实施例二

方法学的建立

1.专属性试验

1.1合成桂美辛的主要起始原料、中间体、降解产物与桂美辛主峰的分离

精密量取桂美辛、对氨基苯甲醚、对甲基苯肼磺酸钠、肉桂肼和酸、碱降解产物的溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，谱图显示各组分的分离度均符合要求。

表1：合成桂美辛的主要起始原料、中间体、降解产物和桂美辛主峰出峰时间

1.2酸、碱、热破坏试验

酸破坏供试品溶液：精密量取桂美辛(批号：20150815)10mg置50ml量瓶中，加1.0mol/L盐酸溶液2.0ml，静置2h，加1.0mol/L氢氧化钠溶液2.0ml 中和，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为酸破坏供试品溶液。

碱破坏供试品溶液：精密量取桂美辛(批号：20150815)10mg置50ml量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠溶液2.0ml，静置5min，加0.1mol/L盐酸溶液2.0ml 中和，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为碱破坏供试品溶液。

热破坏供试品溶液：取桂美辛(批号：20150815)放置在105℃烘箱中，5h 后取出，精密量取10mg置50ml量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为热破坏供试品溶液。

精密量取上述各供试品溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果表明桂美辛样品中各降解产物与桂美辛主峰分离度均符合高效液相色谱法分析测定要求。

表2：酸、碱、高温(热)破坏试验结果(按面积归一计算)

结果表明，桂美辛在酸、碱破坏条件下均不稳定，特别是对碱极不稳定；高温破坏条件下，杂质略有增加；另从以上数据可以判定，破坏前后物料平衡，此方法可用于桂美辛有关物质的检验。

2.耐用性试验

2.1溶液的稳定性考察

精密称定桂美辛10mg，置于50ml容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液，在室温下放置0-8小时，精密量取20μl注入液相色谱仪，测定各杂质峰面积，结果表明供试品溶液在8小时内稳定。

表3：溶液的稳定性考察结果

2.2不同色谱柱的考察

选择两种不同品牌的C18色谱柱，对有关物质进行测定，最大单杂和总杂的测定结果基本一致，色谱柱品牌对检测结果无影响。

表4：不同色谱柱的考察结果

3.检测限

取桂美辛适量，精密称定，加乙腈溶解并稀释成一系列浓度，精密量取20μl 注入高效液相色谱仪，记录色谱图，当S/N≈3时的进样浓度即为桂美辛的检测限，此时进样浓度为0.04μg/ml。结果显示，采用高效液相色谱的方法，按上述条件测定桂美辛有关物质，经验证方法准确可行。

实施例三

桂美辛成品有关物质的测定。

1.色谱条件：

色谱柱：WatersC18(4.6×250mm,5μm)；检测波长291nm；流速1.0ml/min；柱温：35℃；流动相A:乙腈，流动相B:0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液(用20％氢氧化钾溶液调节至PH4.0)；

流动相采用梯度洗脱的方式，按下表进行梯度洗脱：

表5：梯度洗脱表

2.相关溶液及流动相的配制：

2.1相关溶液的配制

2.1.1 20％氢氧化钾溶液的制备

称取氢氧化钾20g，加水溶解并稀释至100ml。

2.1.2 0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液的制备

称取磷酸二氢钾1.3609g，加水溶解并稀释至1000ml，用20％氢氧化钾调节 pH至4.0。

2.1.3供试品溶液的制备

精密称定桂美辛适量，加乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.2mg的溶液，作为供试品溶液。

2.1.4对照溶液的制备

精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作对照溶液。

2.2流动相的配制

将上述0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液和乙腈按照梯度洗脱的体积比例混合，作流动相。

3.桂美辛有关物质测定方法：

取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％；再精密量取供试品溶液20μl与对照溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色图谱，用主成分自身对照法测定，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1.5倍，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2倍。

4.计算单个杂质和总杂质的含量

计算公式：

计算结果：

实施例四

合成桂美辛的原料对氨基苯甲醚中有关物质的测定。

1.色谱条件：

色谱柱：WatersC18(4.6×250mm,5μm)；检测波长291nm；流速1.0ml/min；柱温：35℃；流动相A:乙腈，流动相B:0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液(用20％氢氧化钾溶液调节至PH4.0)；

流动相采用梯度洗脱的方式，按下表进行梯度洗脱：

表6：梯度洗脱表

2.相关溶液及流动相的配制：

2.1相关溶液的配制

2.1.1 20％氢氧化钾溶液的制备

称取氢氧化钾20g，加水溶解并稀释至100ml。

2.1.2 0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液的制备

称取磷酸二氢钾1.3609g，加水溶解并稀释至1000ml，用20％氢氧化钾调节 pH至4.0。

2.1.3供试品溶液的制备

精密称定对氨基苯甲醚适量，加乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中约含 0.2mg的溶液，作为供试品溶液。

2.2流动相的配制

将上述0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液和乙腈按照梯度洗脱的体积比例混合，作流动相。

3.对氨基苯甲醚有关物质测定方法：

取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色图谱，用面积归一法测定。

4.检测结果

单个杂质＝0.06％

总杂质＝100％-99.88％＝0.12％

实施例五

合成桂美辛的中间体对甲基苯肼磺酸钠中有关物质的测定。

1.色谱条件：

色谱柱：WatersC18(4.6×250mm,5μm)；检测波长291nm；流速1.0ml/min；柱温：35℃；流动相A:乙腈，流动相B:0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液(用20％氢氧化钾溶液调节至PH4.0)；

流动相采用梯度洗脱的方式，按下表进行梯度洗脱：

表7：梯度洗脱表

2.相关溶液及流动相的配制：

2.1相关溶液的配制

2.1.1 20％氢氧化钾溶液的制备

称取氢氧化钾20g，加水溶解并稀释至100ml。

2.1.2 0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液的制备

称取磷酸二氢钾1.3609g，加水溶解并稀释至1000ml，用20％氢氧化钾调节 pH至4.0。

2.1.3供试品溶液的制备

精密称定对甲基苯肼磺酸钠适量，加乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.2mg的溶液，作为供试品溶液。

2.2流动相的配制

将上述0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液和乙腈按照梯度洗脱的体积比例混合，作流动相。

3.对甲基苯肼磺酸钠有关物质测定方法：

取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色图谱，用面积归一法测定。

4.检测结果

单个杂质＝13.35％

总杂质＝100％-86.45％＝13.55％

实施例六

合成桂美辛的中间体肉桂肼中有关物质的测定。

1.色谱条件：

色谱柱：WatersC18(4.6×250mm,5μm)；检测波长291nm；流速1.0ml/min；柱温：35℃；流动相A:乙腈，流动相B:0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液(用20％氢氧化钾溶液调节至PH4.0)；

流动相采用梯度洗脱的方式，按下表进行梯度洗脱：

表8：梯度洗脱表

2.相关溶液及流动相的配制：

2.1相关溶液的配制

2.1.1 20％氢氧化钾溶液的制备

称取氢氧化钾20g，加水溶解并稀释至100ml。

2.1.2 0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液的制备

称取磷酸二氢钾1.3609g，加水溶解并稀释至1000ml，用20％氢氧化钾调节 pH至4.0。

2.1.3供试品溶液的制备

精密称定肉桂肼适量，加乙腈溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.2mg的溶液，作为供试品溶液。

2.2流动相的配制

将上述0.01mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液和乙腈按照梯度洗脱的体积比例混合，作流动相。

3.肉桂肼有关物质测定方法：

取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色图谱，用面积归一法测定。

4.检测结果

单个杂质＝1.07％

总杂质＝100％-96.96％＝3.04％。