气体产生量较低的肠膜明串珠菌CJLM119菌株及利用它的辣白菜制造方法

摘要

本申请涉及一种气体产生量较低的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)CJLM119菌株(KCTC 13043BP)、包含它的发酵剂组合物及利用所述菌株的辣白菜的制造方法。

说明书

技术领域

本申请涉及一种气体产生量较低的肠膜明串珠菌菌株及利用它的辣白菜制造方法。

背景技术

辣白菜为利用微生物的发酵作用而制作的食品，其中通过微生物的作用而分解食品成分并合成新的成分，从而能提高营养价值、嗜好性和储存稳定性。

现有的辣白菜具有因在流通过程中产生气体(主要为二氧化碳)而发生容器膨胀、破损及漏液等问题，并且具有因由过度熟化(overaging)导致的强酸味而食味品质降低的问题。

为了解决这种问题，曾报道了利用诸如采用透气性较高的高分子膜(韩国专利申请公开第10-1999-0078725号)或采用止回方式(one-way)的阀(韩国实用新型专利公开第20-2013-0002058号)等多种包装技术来进行控制的方法，但在实际商用化时具有成本等方面的局限性，且该方法难以成为针对诸如因过度熟化而产生的强酸味等辣白菜品质变化的根本解决方案。

在这种背景下，本发明人为了开发能够在辣白菜的制造过程中缩减气体产生的方法而不懈地努力研究。其结果，确认在利用特定肠膜明串珠菌菌株来制造辣白菜时，能减少酸味增加的同时也能缩减气体产生，由此完成了本申请。

[现有技术文献]

[专利文献]

专利文献1：KR10-1999-0078725A(1999.11.05)

专利文献2：KR 20-2013-0002058A(2013.04.02)

发明内容

技术问题

本申请的目的在于提供一种气体产生量较低的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)菌株(KCTC 13043BP)。

本申请的另一目的在于提供一种包含肠膜明串珠菌CJLM119菌株的发酵剂(fermentation starter)组合物。

本申请的又一目的在于提供一种包含肠膜明串珠菌CJLM119菌株或本申请的发酵剂组合物的辣白菜。

本申请的又一目的在于提供一种辣白菜的制造方法，该制造方法包括步骤：使肠膜明串珠菌CJLM119菌株或本申请的发酵剂组合物与发酵对象物接触。

技术方案

下面，对本申请的内容进行具体说明。另外，在其他方面的说明及实施方式中也可以应用与本申请中公开的一方面的说明及实施方式共同的事项。此外，本申请中公开的多种要素的所有组合属于本申请的范畴。进而，以下记载的具体叙述不应被视为限制本申请的范围。

为了实现本申请的目的，作为一方面，本申请提供一种气体产生量较低的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)CJLM119菌株(KCTC 13043BP)。

根据本申请的其他实施方式，本申请的菌株可以是酸生成量较低的菌株，具体而言，本申请的酸可以是乳酸。因此，当利用本申请的菌株来制造辣白菜时，与利用其他肠膜明串珠菌菌株来制造辣白菜的情况相比能够进一步减少酸味增加而维持辣白菜的食味品质。

根据本申请的又一实施方式，本申请的菌株可以是甘露醇生成量较高的菌株。甘露醇对辣白菜赋予清凉感及清爽的味道，甘露醇不仅抑制酸味而且还抑制酸败菌的繁殖，从而防止辣白菜的过渡发酵。

根据本申请的又一实施方式，本申请的菌株在明胶液化反应、有害代谢产物(例如，氨)生成、苯基丙氨酸脱氨生成及融溶血现象检查中均显示阴性，从而即使应用到食品中也安全(参见实施例5)。

根据本申请的又一实施方式，本申请的菌株可以是包含序列号的1号序列的16srRNA。

本申请的菌株，即肠膜明串珠菌CJLM119菌株可包含上述菌株的破碎后的细胞壁分段、生菌或干燥菌。

作为另一方面，本申请提供一种包含肠膜明串珠菌CJLM119菌株(KCTC13043BP)或它的培养物的发酵剂(fermentation starter)组合物。

本申请的发酵剂组合物可包含至少10⁷cfu/ml的本申请的肠膜明串珠菌CJLM119菌株(KCTC13043BP)，具体而言，可包含10⁷cfu/ml至10¹³cfu/ml或10⁹cfu/ml至10¹²cfu/ml的本申请的肠膜明串珠菌CJLM119菌株。

本申请中的术语“培养物”是指将本申请的肠膜明串珠菌CJLM119菌株(KCTC13043BP)接种到培养基并进行培养而得到的结果物。具体而言，本申请的培养物可包含将本申请的菌株在培养基中培养而得的培养物自身(即，可包含本申请的肠膜明串珠菌CJLM119菌株、培养基或菌株的代谢产物)、通过对上述培养物进行过滤或离心分离而去除菌株后的滤液(例如，离心分离后的上清液)等。此外，本申请的培养液可包含对该培养液进行干燥(例如，冷冻干燥)后经粉末化的培养液。

根据本申请的一实施方式，本申请的培养可以在10℃至30℃下实施6小时至48小时，具体而言，可以在20℃至30℃下实施12小时至36小时或18小时至30小时。

本申请的培养基只要是公知的乳酸菌用培养基则可以无限制地使用。具体而言，本申请的培养基可包含碳源或氮源，更具体而言，上述碳源可以是选自由蔗糖、葡萄糖和果糖组成的组中的至少一个碳源，上述氮源可以是选自由酵母提取物、蛋白胨、牛肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、柠檬酸铵、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵组成的组中的至少一个氮源。本申请的培养基可进一步包含吐温80、柠檬酸钠、磷酸钾、醋酸钠、硫酸锰、硫酸镁和蒸馏水组成的组中的至少一个。

本申请中的术语“发酵剂”是指为了辅助发酵开始而人为地应用到发酵对象物中的制剂。

根据本申请的一实施方式，本申请的发酵剂组合物可以是液状或粉末。

根据本申请的另一实施方式，本申请的发酵剂组合物可进一步包含冷冻保护剂，更具体而言，可进一步包含选自由丙三醇、海藻糖、麦芽糊精、脱脂奶粉和淀粉组成的组中的至少一个冷冻保护剂。相对于本申请的发酵剂组合物的总重量，本申请的冷冻保护剂的含量可以是0.01重量％至20重量％或0.01重量％至10重量％，具体而言，在本申请的发酵剂组合物中，丙三醇的含量可以是5重量％至20重量％，海藻糖的含量可以是2重量％至10重量％，麦芽糊精的含量是2重量％至10重量％，脱脂奶粉的含量是0.5重量％至2重量％，且淀粉的含量可以是0.1重量％至1重量％。

根据本申请的又一实施方式，本申请的发酵剂组合物可进一步包含赋形剂。具体而言，本申请的赋形剂可以是选自由葡萄糖、糊精和脱脂牛奶组成的组中的至少一个。更具体而言，相对于本申请的发酵剂组合物的总重量，本申请的赋形剂的含量可以是75重量％至95重量％或85重量％至95重量％。

作为又一方面，本申请提供一种包含本申请的肠膜明串珠菌CJLM119菌株(KCTC13043BP)或本申请的发酵剂组合物的辣白菜。

本申请中的术语“辣白菜”是指用盐腌制蔬菜(例如，白菜、萝卜、葱、芥菜和黄瓜等)之后混合调料(例如，辣椒粉、蒜、生姜和鱼露等)并使其发酵而成的食品。

本申请的辣白菜可进一步包含作为食品可接受的公知的添加剂，具体而言，可进一步包含：诸如梅子香、柠檬香、菠萝香、香草香等的天然香料；诸如天然果汁、叶绿酸、类黄酮等的天然色素；诸如果糖、蜂蜜、糖醇、白糖等的甜味成分；或诸如柠檬酸、柠檬酸钠等的酸味剂。

作为又一方面，本申请提供一种辣白菜的制造方法，该制造方法包括以下步骤：使本申请的肠膜明串珠菌CJLM119菌株(KCTC 13043BP)或本申请的发酵剂组合物与发酵对象物接触。

根据本申请的又一实施方式，以发酵对象物的总体重量为基准，可以使0.01重量％至3重量％、0.1重量％至3重量％、0.5重量％至3重量％、0.5重量％至2重量％的本申请的肠膜明串珠菌CJLM119菌株(KCTC 13043BP)或本申请的发酵剂组合物与发酵对象物接触。

此外，本申请的接触可以在3℃至10℃或5℃至10℃下持续实施1日至90日、10日至90日、10日至60日、20日至60日或20日至40日。

作为又一方面，本申请提供一种通过本申请的制造方法制造的辣白菜。

发明效果

本申请的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)CJLM119菌株(KCTC13043BP)具有如下效果：由于气体产生量较低，因此当将上述菌株或它的培养物用作发酵剂而制造辣白菜时，降低流通过程中的气体产生量而预防因气体产生导致的包装破损等问题，从而能够稳定辣白菜的流通品质。此外，还具有如下效果：由于酸生成量较低而维持规定的酸味，并且由于甘露醇的生成潜力优异而提高辣白菜的食味品质。

具体实施方式

下面，通过下述实施例对本申请进行更具体说明。但是，这些实施例只是旨在有助于对本申请的理解，本申请的范围在任何意义上均不受限于这些实施例。

实施例1：气体产生量较低的菌株的分离

1-1)菌株分离及鉴定

使从大型超市购买的各种辣白菜在5℃的低温下熟化，并将达到pH3.8至4.5范围的辣白菜用作辣白菜试样。在用0.85％的食盐水将上述辣白菜试样稀释成10倍，并接种到PES琼脂培养基(苯乙醇蔗糖琼脂；胰蛋白胨5g、酵母提取物0.5g、蔗糖20g、硫酸铵2g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.244g、苯乙醇2.5ml、琼脂15g/蒸馏水1L)平板上之后，利用撒料机涂抹。然后，在25℃的恒温培养箱中培养上述平板持续24小时之后，将生成的各个菌落划线(streaking)至其他PES琼脂平板上而分离为单个菌落。

1-2)筛选气体产生量较低的菌株

将从上述实施例1-1分离出的菌株菌落分别接种到包含具有30mm高度的德拉姆管的试管内的10ml的MRS肉汤[Difco.MRS肉汤(broth)；细菌蛋白胨(bactopeptone)10g、牛肉提取物(beef extract)10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、吐温80(tween80)1g、柠檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、醋酸钠5g、硫酸锰0.1g、硫酸镁0.05g、蒸馏水1L]中，然后在25℃下静止培养24小时。通过测量德拉姆管内捕集到的气体高度而测量气体产生程度，并且筛选气体产生量为10mm以下的菌株。

1-3)筛选酸生成量较少的菌株

将从上述实施例1-2分离出的菌株菌落分别接种到10ml的MRS肉汤(Difco.MRS肉汤；细菌蛋白胨10g、牛肉提取物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、吐温80 1g、柠檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、醋酸钠5g、硫酸锰0.1g、硫酸镁0.05g、蒸馏水1L)中。为了测量酸生成程度，在25℃下静止培养24小时之后，利用pH计(SevenCompact/IonS 220，梅特勒-托利多(MettlerToledo))来测量pH，并且筛选pH为至少4.4的菌株。

1-4)筛选甘露醇生成量多的菌株

将从上述实施例1-3分离出的菌株菌落分别接种到10ml的包含2％的果糖(fructose)的最小培养基(细菌蛋白胨10g、果糖20g、吐温80 1g、柠檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、醋酸钠5g、硫酸锰0.1g、硫酸镁0.05g/蒸馏水1L)上，并且在25℃下静止培养24小时之后测量甘露醇生成量。甘露醇生成量用HPLC来测量，并且筛选出甘露醇生成量为至少16000mg/L的菌株。

1-5)鉴定筛选出的菌株

将由上述实施例1-4筛选出的菌株名称命名为CJLM119，并且对它的16srRNA碱基序列(序列号1)进行分析。其结果，可确认上述CJLM119菌株的16s rRNA碱基序列与肠膜明串珠菌NRIC 1517的16s rRNA碱基序列(序列号2)99％一致。由此，将上述CJLM119菌株命名为“肠膜明串珠菌CJLM119”，并且在2016年6月10日保藏到韩国生命工学研究院(韩国典型菌种保藏中心，Korean Collection for Type Cultures)并被给予保藏号KCTC 13043BP。

实施例2：比较气体产生能力

为了将由实施例1筛选出的肠膜明串珠菌CJLM119的气体产生程度与其他肠膜明串珠菌菌株进行比较，将作为肠膜明串珠菌标准菌株的肠膜明串珠菌KCTC3100和KCTC3722用作对照组并测量气体产生程度。将各菌株接种到包含具有30mm高度的德拉姆管的试管内的10ml的MRS肉汤中，并且在25℃下培养24小时之后，通过测量德拉姆管内捕集到的气体高度而比较气体产生程度。

气体产生程度被表示为：在没有气体产生的情况下为“-”，在德拉姆管内捕集到的气体高度为1mm至5mm的情况下为“+”，在该高度为6mm至10mm的情况下为“++”，在该高度为11mm至15mm的情况下为“+++”，在该高度为16mm至25mm的情况下为“++++”，在该高度为25mm以上的情况下为“+++++”。

其结果，确认肠膜明串珠菌CJLM119的气体产生程度为“++”，与作为对照组菌株的气体产生程度的“++++”或“+++”相比显著降低(表1)。

[表1]

实施例3：比较酸生成能力

将由实施例1筛选出的肠膜明串珠菌CJLM119的酸生成程度与作为对照组的肠膜明串珠菌KCTC3100和KCTC3722进行比较。将各菌株分别接种到10ml的MRS肉汤中，并且为了测量酸生成程度，利用pH计(SevenCompact/Ion S220，MettlerToledo)来测量在25℃下静止培养24小时后的pH。

其结果，确认肠膜明串珠菌CJLM119的酸生成量与对照组菌株相比显著降低(表2)。

[表2]

实施例4：比较甘露醇生成能力

将由实施例1筛选出的肠膜明串珠菌CJLM119的甘露醇生成能力与作为对照组的肠膜明串珠菌KCTC3100和KCTC3722进行比较。将各菌株分别接种到10ml的包含2％的果糖的最小培养基(细菌蛋白胨10g、果糖20g、吐温80 1g、柠檬酸铵2g、磷酸氢二钾2g、醋酸钠5g、硫酸镁0.1g、硫酸镁0.05g/蒸馏水1L)中，并且在25℃下培养24小时之后，利用HPLC测量上清液内的甘露醇含量。

其结果，确认肠膜明串珠菌CJLM119的甘露醇生成量与对照组菌株相比较分别增加147％及187％(表3)。

[表3]

实施例5：菌株的安全性评价

为了确认由实施例1筛选出的肠膜明串珠菌CJLM119在制造辣白菜时能否用作发酵剂，对菌株危害性进行分析。具体而言，根据由韩国生物风险投资协会团体标准提出的安全性评价试验法，执行溶血现象检查(Hemolysis)、明胶液化反应检查(Gelatinliquefaction)、有害代谢产物(氨)生成确认(氨生成，Ammonia Production)及苯基丙氨酸脱氨检查(Phenylalanine deaminase)。

其结果，确认肠膜明串珠菌CJLM119菌株在明胶液化反应、有害代谢产物(氨)生成、苯基丙氨酸脱氨生成及溶血现象检查中均显示阴性，从而该肠膜明串珠菌CJLM119菌株为能够施用到人体的安全的菌株，能够在食品制造中使用该菌株(表4)。

[表4]

明胶液化反应检查苯基丙氨酸脱氨酶检查溶血现象检查氨生成阴性阴性γ阴性

*γ(γ溶血)：无溶血现象

实施例6：辣白菜的制造

6-1)利用肠膜明串珠菌CJLM119菌株来制造辣白菜

在混合蔗糖2.5g、柠檬酸钠2.0g、蛋白胨1.5g、葡萄糖1.0g、酵母提取物1.0g、果糖0.5g、醋酸钠0.5g及蒸馏水1L之后进行灭菌的培养基中，接种约10⁹CFU/ml的肠膜明串珠菌CJLM119菌株，并且在25℃下培养24小时，从而制备菌株培养液，其中，相对于培养基的总重量，所接种的肠膜明串珠菌CJLM119菌株为1重量％。

然后，通过在混合辣椒面(2.5重量％)、蒜(2重量％)、生姜(0.4重量％)、大葱(1重量％)、萝卜(18重量％)及鱼露(5重量％)而成的普通辣白菜调料中添加上述制备出的菌株培养液来制造调料之后，与腌制白菜混合而制造辣白菜(实验例1)，其中，相对于辣白菜总重量，所添加的菌株培养液为0.1重量％。

6-2)利用标准菌株培养液来制造辣白菜

分别利用肠膜明串珠菌的标准菌株KCTC3100及KCTC3722培养液，并且以与上述实施例6-1相同的方法制造辣白菜(利用KCTC310培养液：比较例1，利用KCTC3722培养液：比较例2)。

6-3)制造未添加菌株培养液的辣白菜

除在辣白菜调料中未添加菌株培养液以外，以与上述实施例6-1相同的方法制造辣白菜(比较例3)。

实施例7：辣白菜的特性分析

7-1)酸生成量比较

将上述实验例1及比较例1至3的辣白菜在7℃下储存30日并测量各自的乳酸生成量。具体而言，在磨碎规定量的各辣白菜之后用纱布过滤一次而制造辣白菜榨汁液，并且为了分析上述辣白菜榨汁液内的乳酸量，提取辣白菜液3ml并进行离心分析(10000g、10分钟)后利用0.2μm的过滤器过滤两次，然后用HPLC分析该乳酸含量。

其结果，与未利用菌株培养液来制造的比较例3及利用同种的标准菌株培养液来制造的比较例1及2的辣白菜相比较，实验例1的乳酸生成量达到65％至67％的水平，即可确认在利用肠膜明串珠菌CJLM119菌株培养液来制造辣白菜的情况下，能减少酸味增加而维持辣白菜的食味品质(表5)。

[表5]

7-2)比较气体产生量

将规定量的上述实验例1及比较例1至3的辣白菜装入未附着有气体吸收剂的铝袋(Al pouch)中并在7℃下储存30日，并且通过测量增加的体积而测量各辣白菜的气体产生量。

其结果，与作为利用同种的标准菌株培养液制造的辣白菜的比较例1及2相比较，实验例1的气体产生量达到57％至62％水平，且低于作为未利用菌株培养液制造的辣白菜的比较例3，即可确认在利用肠膜明串珠菌CJLM119菌株培养液来制造辣白菜的情况下，能够显著降低气体产生量而增加流通便利性(表6)。

[表6]

7-3)比较甘露醇生成量

将上述实验例1及比较例1至3的辣白菜在7℃下储存30日并测量各自的甘露醇生成量。具体而言，在磨碎规定量的各辣白菜之后用纱布过滤而制备辣白菜榨汁液，并且提取上述辣白菜榨汁液3ml并进行离心分离(10000g、10分钟)后利用0.2μm的过滤器过滤两次，然后用HPLC分析该甘露醇含量。

其结果，与未利用菌株培养液制造的比较例3及利用同种的标准菌株培养液制造的比较例1及2相比较，实验例1的甘露醇生成量达到167％至199％的水平，可确认在利用肠膜明串珠菌CJLM119菌株培养液来制造辣白菜的情况下，能制造因包含大量甘露醇而具有优异的储存稳定性和食味品质的辣白菜(表7)。

[表7]

[保藏号]

保藏机构名称：韩国生命工学研究院

保藏号：KCTC 13043BP

保藏日期：2016年06月10日

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 气体产生量较低的肠膜明串珠菌CJLM119菌株及利用它的辣白菜制造方法

<130> PA17-0214

<150> KR 10-2016-0090284

<151> 2016-07-15

<160> 2

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 916

<212> RNA

<213> 未知

<220>

<223> 肠膜明串珠菌CJLM119的16s rRNA序列

<400> 1

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ctctaaaagg gggggg 916

<210> 2

<211> 1539

<212> RNA

<213> 未知

<220>

<223> 肠膜明串珠菌NRIC 1517的16s rRNA序列

<400> 2

tagagtttga tcatggctca ggatgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgaa 60

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tagtgtcgca tgacacaaag ttaaaaggcg cttcggcgtc acctagagat ggatccgcgg 240

tgcattagtt agttggtggg gtaaaggcct accaagacaa tgatgcatag ccgagttgag 300

agactgatcg gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggctgcagta 360

gggaatcttc cacaatgggc gaaagcctga tggagcaacg ccgcgtgtgt gatgaaggct 420

ttcgggtcgt aaagcactgt tgtatgggaa gaacagctag aataggaaat gattttagtt 480

tgacggtacc ataccagaaa gggacggcta aatacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540

tgtcccgagc gttatccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcagacggt ttattaagtc 600

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