一种原位修复受污染沉积物的固定化菌剂及制法与应用

摘要

一种原位修复受污染沉积物的固定化菌剂，由杭锦土2#负载导电微生物构成，通过下述方法得到：1)杭锦土2#经过预处理得到颗粒态填料；2)将导电微生物菌种扩大培养至待接种菌液，按比例添加步骤1预处理的杭锦土2#，厌氧条件下混合，静置后去除上清液，得到固定化菌剂；所述导电微生物菌种为硫还原地杆菌、金属还原地杆菌和希瓦氏菌。本发明还公开了上述固定化菌剂的制备方法和原位修复受污染沉积物的应用。

说明书

技术领域

本发明属于水生态修复领域，具体地涉及一种原位修复受污染沉积物的固定化菌剂。

本发明还涉及上述材料的制备方法。

本发明还涉及上述材料在原位修复受污染沉积物方面的应用。

背景技术

近些年来随着国家对生态环境保护工作的重视，特别是湖长制、河长制的实施有效地推动了水域岸线管理、水污染防治、水环境治理等工作的开展。对于湖泊生态系统而言，外源输入的营养物进入水体后除部分被降解和吸收外，大部分富集于沉积物中，并在适当的条件下在水体与沉积物中迁移、转化，因而湖泊的治理既要关注水环境质量的改善，也要关注沉积物中污染物的去除。国内的一些湖泊沉积物治理通常采用底泥疏浚的方式，短期内能够很好地改善水质效果，但对底泥的生境破坏较大，很难恢复。

原位覆盖和修复技术通过在底泥表面铺放一层或多层覆盖物，将底泥与上层水体隔离开来，同时利用填料本身的化学性质与底泥中的污染物相互作用，达到去除污染物并阻止营养物由底泥向水体释放的目的。

原位覆盖技术主要应用于一些流动性不大、水动力条件较弱的水体中，最初采用沙子、砂砾等天然材料物理隔离受污染沉积物和水体，后来慢慢发展到改性粘土、膨润土、人工沸石、灰渣、土工织物等具有一定吸附性能、价格低廉的材料，能够有效降低沉积物中有机物的含量。例如，以湖泊沉积物为原料，辅以沸石和聚合氯化铝改性、造粒和焙烧等过程控制沉积物内源磷负荷(CN106277673A)；或采用磁性颗粒活性炭作为覆盖材料固定沉积物中持久性有机污染物(CN105923963A)。

近年来固定化微生物菌剂的发展，使得微生物修复受污染沉积物成为了研究热点。例如，将菌株经沸石负载并用絮凝剂包覆后投入受石油污染的海域，一个月后大部分站位石油降解效率在50％以上(CN106698672A)；采用河沙和固定高效硝化细菌和反硝化细菌、天然沸石协同作用的生物活性多层覆盖削减沉积物中污染物向水体的释放(CN102531197A)。然而，上述技术所采用的固定化载体仅起到吸附菌体的作用，并不能参与到微生物对有机物的降解过程中，使得污染物的降解效率受到限制。

2007年科学家们首次在海洋沉积物中发现了天然生物地球电池效应，即微生物在沉积物厌氧区域氧化有机碳、硫化物等电子供体，产生的电子经胞外介体“长距离”传输至好氧区，从而与上覆水中的氧气等电子受体发生空间上隔离的还原反应的过程。这一胞外电子传递过程主要是通过微生物纳米导线和细胞色素c来实现的，具有类似结构的微生物主要是地杆菌和希瓦氏菌。然而，如何将这一机理在实际水环境中进行应用，促进多种污染物的降解，是当前环境微生物和环境工程研究者面临的重要挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种原位修复受污染沉积物的固定化菌剂。

本发明的又一目的是提供一种上述材料的制备方法。

为实现上述目的，本发明提供的原位修复受污染沉积物的固定化菌剂，由杭锦土2#负载导电微生物构成，通过下述方法得到：

1)杭锦土2#经过预处理得到颗粒态填料；

2)将导电微生物菌种扩大培养至待接种菌液，按比例添加步骤1预处理的杭锦土2#，厌氧条件下混合，静置后去除上清液，得到固定化菌剂；所述导电微生物菌种为硫还原地杆菌、金属还原地杆菌和希瓦氏菌。

所述的固定化菌剂中，杭锦土2#颗粒填料的粒径小于0.15mm。

所述的固定化菌剂中，每30ml菌液添加15-20g杭锦土2#，得到菌体吸附率≥90％的固定化菌剂。

本发明提供的制备上述固定化菌剂的方法：

1)杭锦土2#经过预处理得到颗粒态填料；

2)将导电微生物菌种扩大培养至待接种菌液，按比例添加步骤1预处理的杭锦土2#，厌氧条件下混合，静置后去除上清液，得到固定化菌剂；所述导电微生物菌种为硫还原地杆菌、金属还原地杆菌和希瓦氏菌。

所述的制备方法中，杭锦土2#颗粒填料的粒径小于0.15mm。

所述的制备方法中，每30ml菌液添加15-20g杭锦土2#，得到菌体吸附率≥90％的固定化菌剂。

所述的制备方法中，杭锦土2#的预处理方法是：将杭锦土2#研磨后过100目筛，加入H₂SO₄于90℃下酸化，碱溶液调节pH值至7.5，将产物离心去除上清液，水洗涤，于80-90℃烘干，700-800℃灼烧，得到粒径小于0.15mm的颗粒填料。

所述的制备方法中，导电微生物菌种的扩大培养是：

1)在厌氧的无菌环境下将硫还原地杆菌、金属还原地杆菌和希瓦氏菌三种原始菌株分别挑涂在培养基平板上，置入厌氧培养箱中于25-30℃下培养，并验证目标菌的纯度；

2)将验证后的单菌落接种到固体培养基斜面上，25-30℃培养，在厌氧的无菌环境中接种到液体培养基中，25-30℃、200r/min培养；

液体培养基为：20g/L NaCl、0.77g/L KCl、0.25g/L NH₄Cl、0.1g/L>2PO₄、0.2g/LMgSO₄·7H₂O、1％DL维生素、1％DL矿物和2.0g/L>3，电子受体为12.25g/L柠檬酸铁，电子供体为0.6g/L乙酸；

3)将上述三种菌液分别以2％-6％的接种量同时接种在发酵罐中厌氧培养，培养条件为：pH值在7.0-7.5，温度为25-30℃，振荡速度为150r/min，至菌体细胞密度达到10⁸个/mL以上，培养结束。

所述的制备方法中，导电微生物菌种扩大培养前，用体积比80:20的 N₂:CO₂除去灭菌前液体培养基中的氧气后，再于121℃灭菌15min。

本发明的固定化菌剂可以用于原位修复受污染沉积物：将固定化菌剂以0.5％-5％的比例接种于沉积物中，加入经0.45μm滤膜过滤后的湖水，利用天然生物地球电池效应来降解沉积物中的污染物。

本发明的显著效果是：

将其应用于受污染沉积物中，能够提高沉积物中希瓦氏菌和地杆菌的丰度，强化对有机污染物的去除。同时，采用杭锦土2#作为载体，使得微生物能够利用其中的Fe₂O₃作为电子受体完成胞外电子传递过程，加快了反应速率，有效地提高了污染物的去除效果。

附图说明

图1是本发明固定化菌剂的工艺流程。

图2是沉积物中TN去除率随时间变化曲线图。

图3是沉积物中TOC去除率随时间变化曲线图。

具体实施方式

以下对本发明作详细说明。

本发明固定化菌剂的制备方法，包括如下步骤：

1)将杭锦土2#进行预处理：用研钵将杭锦土2#粗碎、研磨后直接过 100目筛，以1:10(质量：体积)比例用2.5mol/L H₂SO₄在90℃下酸化2h，再加入5mol/L>

2)菌株的筛选：所筛选的微生物包括硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducensstrain DL1,ATCC52573)、金属还原地杆菌(Geobacter metallireducens,ATCC53774)、希瓦氏菌(Shewanella oneidensis strain MR-1，ATCC700500)。

3)菌株的分纯和培养：在厌氧的无菌环境下将冻存的原始菌株挑涂在灭菌干燥的培养基平板上，反复划线，并置入厌氧培养箱中在30℃下培养，24h后通过观察有无杂菌，以验证目标菌的纯度。用灭菌的接种环挑取验证正确的单菌落一环，接种到固体培养基斜面上，反复划线，30℃下培养72h后备用。将上述斜面上的菌种，在厌氧的无菌环境中，接种到液体培养基中，30℃，200r/min下培养。

4)菌株的混合：将上述3种菌液分别以2％-6％的接种量同时接种在发酵罐中厌氧培养。培养条件为：pH值在7.0-7.5之间，温度为30℃，振荡速度为150r/min。至菌体细胞密度达到10⁸个/mL以上，培养结束。

5)固定化菌剂的吸附：将所制得的杭锦土填料以一定比例与菌液混合，在厌氧条件下，摇床中振荡24h，静置一段时间后倒掉上清液，制得菌体吸附率≥90％的固定化菌剂。

其工艺流程可参阅图1。

本发明固定化菌剂在受污染沉积物中的应用方法：

即将制备好的固定化菌剂以0.5％-5％的比例接种于沉积物中，加入经0.45μm滤膜过滤后的湖水，利用天然生物地球电池效应来降解沉积物中的污染物。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，然而本发明的范围不以具体实施方式为限。

实施例1

1)杭锦土2#负载基体的制备

将购置的杭锦土2#用研钵粗碎、研磨后过100目筛，称取200g研磨后的杭锦土2#，加入2000ml 2.5mol/L H₂SO₄，在水浴锅中90℃下酸化2h，再加入5mol/L>

2)菌株的筛选

本实施例从30余种胞外产电菌种中筛选出3种能够以铁氧化物、腐殖质等为电子受体的细菌，所选定的菌株包括硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens strain DL1,ATCC52573，记为T1)、金属还原地杆菌(Geobacter metallireducens,ATCC53774，记为T2)、希瓦氏菌(Shewanella oneidensis strain MR-1，ATCC700500，记为T3)。

3)菌株的平板分纯、斜面培养、扩大培养

①在厌氧的无菌环境中，将冻存的三种原始菌株分别以灭菌接种环接种到灭菌后的LB固体培养基平板上，反复划线，在厌氧环境中30℃下培养24h，观察有无杂菌，以验证目标菌的纯度。

其中，LB固体培养基平板制备方法为：分别称取10g胰蛋白胨、5g 酵母提取物、10g氯化钠搅拌溶解于1000ml纯水中，搅拌均匀后用NaOH 调节pH值为7.4。取100ml LB培养基向其中加入1.5g琼脂粉，煮沸溶解后，于121℃下灭菌20min后降至60℃以下，以每15ml倒入并平铺于培养皿(d＝9cm)底部，冷却后得到固体培养基平板。

②在厌氧的无菌环境中，将验证正确的单菌落以灭菌后的接种环挑取一环，接种到LB固体培养基斜面上，反复划线，30℃下培养72h后备用。

③在厌氧的无菌环境中，用接种环将菌落从平板上挑选至装有200mL 液体培养基的500mL锥形瓶中，30℃，200r/min下培养到细胞密度达到 10⁸个/mL以上即停止培养，备用。

液体培养基的成分为20g/L NaCl、0.77g/L KCl、0.25g/L NH₄Cl、 0.1g/L>2PO₄、0.2g/L>4·7H₂O、1％DL维生素、1％DL矿物和2.0g/L>3，电子受体为12.25g/L柠檬酸铁，电子供体为0.6g/L乙酸，调节>

4)菌株的混合：在厌氧无菌环境下，将上述3种菌液分别以2％-6％的接种量同时接种在发酵罐的液体培养基中，在水浴振荡器中扩大培养。培养条件为：温度为30℃，振荡速度为150r/min。培养至菌体细胞密度达到10⁸个/mL以上。

发酵罐材质为高硼硅玻璃，能够承受较大的压力，四周用锡纸包裹以避光；发酵罐体积为2.5L，向其中加入1.5L液体培养基，并用N₂：>2(80:20，体积比)通气15min，通气结束后罐口用丁基橡胶塞封口，在>

5)固定化菌剂的吸附：

本实施例采用不同的比例将所制得的杭锦土填料与菌液混合，具体比例见表1。将混合液在厌氧条件下，摇床中振荡24h，静置一段时间后倒掉上清液，通过筛选最终制得菌体吸附率≥90％的固定化菌剂。

由表1可以看出，各组实验中，杭锦土2#对三种菌液的吸附率都类似。随着杭锦土2#添加量的增加，杭锦土2#对三种菌液的吸附率增加，其中，第7组中杭锦土2#对三种菌液的吸附率最高。即将30ml菌液与15g杭锦土2#混合，杭锦土2#占比为33.33％(菌液与杭锦土2#混合比例为2:1) 时，厌氧振荡24h后，杭锦土2#的吸附率最高，对T1的吸附率为93.8％、对T2的吸附率为92.2％、对T3的吸附率为91.3％。此后杭锦土2#投加量再增大时，吸附率不再增大。

6)固定化菌剂的接种：

本实施例中将制备好的固定化菌剂以0.5％-5％的比例接种于沉积物中，加入经0.45μm滤膜过滤后的湖水，利用天然生物地球电池效应来降解沉积物中的污染物。

采集沉积物中营养物含量较高的湖泊沉积物和湖水，将沉积物用孔径为1mm的不锈钢筛过滤，去除枯枝、树叶、碎石等粗颗粒物，将湖水用 0.45μm滤膜过滤去除悬浮物和藻类。在5个7.5L的广口瓶(口径10.4cm、高度34cm、直径20.7cm)中，分别加入2.5kg沉积物(填充高度约为8cm) 及2.2L湖水(水体高度约为7cm)，在人工气候室内30℃下敞口培养30d。在加入湖水前，向沉积物中分别添加质量为0.0g、12.5g、25.0g、50.0g和 125.0g的固定化菌剂(接种比例分别为0.0％、0.5％、1％、2％和5％)，用玻璃棒搅拌均匀。反应周期结束后，用无菌采样器分别采集0-2cm、2-4cm 及4cm以下的沉积物，测定沉积物中TN、TP、TOC含量。

结果：

如表2所示，接种初期，5个广口瓶中沉积物TN、TP和TOC分别在 5461-5643mg/kg、1560-1723mg/kg和15.34-17.56g/kg之间，由于菌液本身含有一定的C、N、P，随着接种比例的增加，沉积物中TN、TP、TOC 含量略有增加。

经过30d培养后，0-2cm深度沉积物TP含量在1496-1619mg/kg之间， 2-4cm深度沉积物TP含量在1502-1622mg/kg之间，4cm以下深度沉积物 TP含量在1500-1624mg/kg之间，与第0d相比，不同深度下沉积物TP含量变化较小，这主要是因为除少部分磷经过沉积物与水体之间的交换作用释放到上覆水体外，在缺氧条件下导电微生物能够将沉积物中有机磷分解为无机磷，但并不会削减沉积物中磷的总量。

经过30d培养后沉积物TN和TOC呈现不同程度的下降，结果分别如图2和图3所示。

如图2所示，经过30d的培养，空白组(接种比例为0.00％)沉积物 TN去除率在5.38％-12.34％之间，这说明培养过程中沉积物本身具有的微生物也能够在缺氧条件下分解利用沉积物中有机氮化合物，并发生反硝化反应从而降低沉积物TN含量。随着接种比例的增加，沉积物TN去除率逐渐增大，接种比例为5％时，沉积物TN含量下降最快，30d后沉积物 TN在3419-4280mg/kg之间，TN去除率在24.15％-39.42％之间。每个接种比例下，0-2cm沉积物TN含量最低，明显低于2-4cm和4cm以下沉积物TN含量，这说明位于表层的沉积物中导电微生物能够在较短的距离内利用沉积物中有机物与上覆水中溶解氧发生氧化还原反应，从而提高了表层沉积物TN的降解效率。如图3所示，经过30d的培养，沉积物TOC含量也得到了一定的削减，呈现出与沉积物TN类似的变化规律。接种比例为5％时，沉积物TOC削减量最大，削减率为22.39％-35.98％，由接种前的17.56g/kg降至11.24-13.63g/kg。

结论：从上述实施例中可以看出，本发明的原位修复受污染沉积物的材料能够有效地提高沉积物中碳、氮的去除效果，适用于受污染沉积物的修复。

表1杭锦土2#对混合菌液的吸附作用

表2接种前不同接种比例下沉积物中TN、TP、TOC含量

组别接种比例TN(mg/kg)TP(mg/kg)TOC(mg/kg)10.00％5461156015.3420.50％5495158515.7531.00％5526160916.3842.00％5580164617.0555.00％5643172317.56