肝硬化早期小分子标志物及其应用

摘要

本发明提供了一类全新的肝硬化诊断标志物在制备肝硬化早期诊断产品中的应用，这类标志物可以单独或两种或两种以上组合来进行肝硬化的早期诊断。本发明提供的肝硬化标志物共20种，具有准确性高，灵敏度高的特点，其中7种标志物，即焦谷氨酸，苹果酸，辛基葡萄糖苷，3‑氨基丁酸，甲基巴豆酰甘氨酸，环己烯四醇β环氧化物和核糖，其特征曲线线下面积AUC达到了1.0，提示其准确性与敏感度均达到99％以上，可以直接用作肝硬化的指标。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及肝硬化早期诊断标志物及其应用。

背景技术

中国是肝硬化多发的国家。肝硬化主要由酒精性脂肪肝，病毒性肝炎导致，在病理组织学上的表现为广泛的肝细胞坏死、残存肝细胞结节性再生、结缔组织增生与纤维隔形成。目前临床上采用的肝硬化分级标准是Child－Pugh。一般情况下，肝硬化代偿期属于Child－Pugh A级。由于肝脏代偿功能较强，处于该分期的肝硬化病人往往无明显症状。而肝硬化失代偿期则属于Child－Pugh B、C级，处于该分期的病人会出现肝损害相关的症状，主要表现为门静脉高压为及并伴有多系统受累。到了肝硬化晚期常出现上消化道出血、肝性脑病(HE)、继发感染、脾功能亢进、腹水、癌变等并发症，严重影响人类健康。

目前针对肝硬化晚期即失代偿期没有好的治疗手段，比如晚期肝硬化导致的肝性脑病(HE)其1年病死率大于64％，晚期肝硬化导致的功能性肾衰竭(HRS)其病死率大于95％。与晚期相反，早期肝硬化病人通过病因治疗(如乙肝病毒治疗)，生活习惯改善(如酒精性脂肪肝导致的早期肝硬化)等可以有效阻止肝硬化的恶性发展或逆转肝脏损伤以达到长期生存甚至治愈的效果。因此肝硬化的早发现早预防早治疗，防止疾病进展，避免临床失代偿性并发症的出现是肝硬化治疗的基本原则。但由于肝脏具有较强的代偿性，早期肝硬化往往并不表现出明显的临床症状，而到了症状较明显时，往往已到了肝硬化晚期。因此发现早期肝硬化的诊断标志物具有良好的临床意义及应用价值。

临床上用于确诊肝硬化的手段主要依靠超声影像并由肝穿刺进行确诊。超声诊断的灵敏度较低，而肝穿刺对患者的肝脏有损伤，存在风险，不易推广，导致很多患者直到肝硬化失代偿期才被确诊。最近有研究发现血清的HA、CG、PⅢNP、PCⅢ、CⅣ和LN等在肝硬化病人中升高，但由于其敏感度与特异性有待提高，目前尚未被临床采用作为早期肝硬化的指标。因此急需发现新的早期肝硬化标志物。

发明内容

本发明提供了一类全新的肝硬化诊断标志物，这类标志物可以单独或两种或两种以上组合来进行肝硬化的早期诊断。

本发明提供的肝硬化标志物共20种，包括：5-甲基硫代腺苷(5-Methylthioadenosine，简称MTA)，3-羟基丁酸(3-Hydroxybutyric acid，简称bhb)，焦谷氨酸(Pyroglutamic acid)，1-磷酸葡萄糖(Glucose-1-phosphate)，苹果酸(L-Malic acid)，辛基葡萄糖苷(beta-Octylglucoside)，3-氨基丁酸(3-Aminobutanoic acid)，凝血噁烷B2(Thromboxane B2)，别嘌醇核苷(Allopurinol riboside)，甲基巴豆酰甘氨酸(Tiglylglycine)，牛磺胆酸(Taurocholate)，半乳糖酸(Galactonic acid)，景天庚酮糖(Sedoheptulose)，D-半乳糖醛酸(D-galacturonic acid)，环己烯四醇β环氧化物(conduritol b epoxide)，十七烷酸(heptadecanoic acid)，花生四烯酸(arachidonicacid)，丙酮酸(Pyruvic acid)，肌苷(inosine)，核糖(ribose)。

所述20种肝硬化标志物中，在肝硬化病人中显著增加的是：5-甲基硫代腺苷，3-羟基丁酸，焦谷氨酸，1-磷酸葡萄糖，辛基葡萄糖苷，3-氨基丁酸，牛磺胆酸，半乳糖酸，景天庚酮糖，D-半乳糖醛酸，环己烯四醇β环氧化物共11种。

所述20种肝硬化标志物中，在肝硬化病人中显著降低的是：苹果酸，凝血噁烷B2，别嘌醇核苷，甲基巴豆酰甘氨酸，十七烷酸，花生四烯酸，丙酮酸，肌苷，核糖共9种。

本发明还提供了所述20种肝硬化标志物在制备肝硬化早期诊断产品中的应用，其特征在于，所述诊断产品包含检测所述一种或多种标志物的试剂，所述试剂通过检测受试者体液中所述一种或多种标志物的浓度来判断受试者是否患有早期肝硬化。

优选地，所述标志物是焦谷氨酸，苹果酸，辛基葡萄糖苷，3-氨基丁酸，甲基巴豆酰甘氨酸，环己烯四醇β环氧化物，核糖。

进一步地，所述体液是血清或血浆。

进一步地，所述试剂是基于化学分析法或质谱法检测所述一种或多种化合物浓度时所需的试剂。

进一步地，所述标志物5-甲基硫代腺苷和/或3-羟基丁酸和/或焦谷氨酸和/或1-磷酸葡萄糖和/或辛基葡萄糖苷和/或3-氨基丁酸和/或牛磺胆酸和和/或半乳糖酸和/或景天庚酮糖和/或D-半乳糖醛酸和/或环己烯四醇β环氧化物的浓度与正常标准浓度相比显著增高，则判断受试者患有早期肝硬化。

进一步地，所述标志物苹果酸和/或凝血噁烷B2和/或别嘌醇核苷和/或甲基巴豆酰甘氨酸和/或十七烷酸和/或花生四烯酸和/或丙酮酸和/或肌苷和/或核糖的浓度与正常标准浓度相比显著降低，则判断受试者患有早期肝硬化。

进一步地，所述诊断产品是试剂盒、芯片或检测平台。

用于本发明的组合物和方法的标志物的准确性可通过作特征曲线(“ROC曲线”)来表征。ROC是对于诊断标志物的不同可能的割点的真阳性率与假阳性率的曲线。ROC曲线显示灵敏性和特异性之间的关系。即是说，灵敏性的增加将伴随特异性的降低。曲线越靠近ROC空间的左轴，然后顶缘，标志物越准确。相反地，曲线越靠近ROC图的45度对角线，标志物越不准确。ROC下的面积(称为“AUC”)是标志物准确性的度量。标志物的准确性取决于标志物如何适当地将待测试的组分成具有所述疾病的组和不具有所述疾病的组。AUC为1表示完美的标志物，而面积为0.5表示有用性较差的标志物。

通过对10个肝硬化病人及9个正常病人血清的前瞻性研究，各标志物在肝硬化病人中的变化及对应的特征曲线线下面积AUC如表1。

表1.各标志物在肝硬化病人中的变化及对应的特征曲线线下面积AUC

从表1可见，所有的20个标志物特征曲线线下面积AUC都大于0.88，其中有7个标志物的特征曲线线下面积AUC＝1。AUC值表示标志物的预测能力，AUC＝1表示能100％准确鉴定早期肝硬化。因此，从表1可以看出本专利提供的肝硬化早期诊断标志物具有确性高，敏感度高的特点。

所述20种肝硬化标志物在健康志愿者和肝硬化病人血清中的详细变化见附图1-20(A)。

所述20种肝硬化标志物对应的分子式见附图1-20(B)。

本发明的有益效果是：目前还没有较好的早期肝硬化标志物，本发明提供的肝硬化标志物具有准确性高，灵敏度高的特点，其中7种标志物，即焦谷氨酸，苹果酸，辛基葡萄糖苷，3-氨基丁酸，甲基巴豆酰甘氨酸，环己烯四醇β环氧化物和核糖，其特征曲线线下面积AUC达到了1.0，提示其准确性与敏感度均达到99％以上，可以直接用作肝硬化的指标。

附图说明

图1-20(A)为所述20种肝硬化标志物在健康志愿者和肝硬化病人中的详细变化图。

图1-20(B)为所述20种肝硬化标志物对应的分子式。

具体实施方式

本发明通过以下实施例作进一步说明，实施例不应解释为进一步限制。参选以下本发明的实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。

具体实施方式一：以5-甲基硫代腺苷(5-Methylthioadenosine，简称MTA)为单标志物进行肝硬化早期诊断。具体实施方法如下：

1、获取受试者样品，并进行前处理：依据规范、合理的操作流程采集受试者血液样品后，取100μL血液加入350μL甲醇中，进行涡旋混匀，高速离心，取上清液，进行浓缩干燥，加入100μL乙腈进行复溶，经过滤塞，可直接进行UHPLC-QTOFMS测试。

2、所用主要试剂1)甲醇(Methanol，LOT#1230，LCMS级，CAS：67-56-1)购自CNWTechnologies(ANPEL Laboratory Technologies(Shanghai)Inc.)；乙腈(Acetonitrile，LOT#1646，LCMS级，CAS：75-05-8)购自CNW Technologies(ANPEL LaboratoryTechnologies(Shanghai)Inc.)；水(纯水仪提供)；醋酸铵(Ammonium acetate，LOT#1350K100，LCMS级，CAS：631-61-8)购自CNW Technologies(ANPEL LaboratoryTechnologies(Shanghai)Inc.)；氨水(Ammonium hydroxide，LCMS级，CAS：1336-21-6)购自CNW Technologies(ANPEL Laboratory Technologies(Shanghai)Inc.)；L-2-氯苯丙氨酸(2-Chloro-L-phenylalanine，CAS:103616-89-3，纯度≥98％)，购自上海恒柏生物科技有限公司，中国。

3、所用主要仪器平台：1)UHPLC-QTOFMS(Agilent 1290UHPLC+AB Triple TOF6600)；2)色谱柱：Waters Acquity UPLC,HSS T3 1.8um,2.1*101mm：3)离心机：HeraeusFresco17centrifuge,Thermo Scientific；4)涡旋仪：VORTEX-5,其林贝尔仪器制造有限公司；5)纯水仪：明澈D24UV,Merck Millipore,Germany；6)超声仪：PS-60AL，深圳市雷德邦电子有限公司，中国。

4、数据处理：UHPLC-QTOFMS测试后，收集UHPLC-QTOFMS数据进行分析。数据处理使用XCMS程序，参数设置参照软件说明。XCMS程序处理后，我们将获得所有代谢物的荷质比、保留时间、峰面积和二级质谱等指标。

5、5-甲基硫代腺苷的浓度确定：根据质荷质比和质谱二级片段通过比对二级质谱数据库来确定。甲基硫代腺苷在血液中的浓度通过其峰面积和标准品的峰面积的比值来确定。

6、肝硬化的诊断：将上述测得的受试者血液中的5-甲基硫代腺苷浓度和正常数据作比较。如果数值超过健康人群的阈值，那么该受试者具有较高肝硬化风险。其中5-甲基硫代腺苷在健康人群血液中的阈值为4.0nmol/L。结果显示其特征曲线线下面积为0.911。

具体实施方式二：以3-羟基丁酸(3-Hydroxybutyric acid，简称bhb)为单标志物进行肝硬化早期诊断。受试者3-羟基丁酸浓度的确定同实施方式一中的1-5步。将上述测得的受试者血液中的3-羟基丁酸浓度和正常数据作比较。如果数值超过健康人群的阈值，那么该受试者具有较高肝硬化风险。其中3-羟基丁酸在健康人群血液中的阈值为100umol/L。结果显示其特征曲线线下面积为0.889。

具体实施方式三：以表一的多种代谢物质联合进行肝硬化早期诊断。受试者的多种代谢物浓度的确定同实施方式一中的1-5步。将上述测得的受试者血液中的多种代谢物浓度和正常数据作比较。如果一个或多个数值超过健康人群血液的阈值，那么该受试者具有较高肝硬化风险。