一种白酒中八种生物胺的UPLC-MS/MS检测方法

摘要

本发明公开了一种白酒中八种生物胺的UPLC‑MS/MS检测方法，可在白酒中同时定性定量分析腐胺、尸胺、组胺、酪胺、苯乙胺、亚精胺、色胺及精胺8种生物胺。本发明前处理简单，无需衍生化，线性相关系数大于0.99，回收率80％‑120％之间，相对标准偏差在10％以内，说明本发明方法能运用于白酒中的八种生物胺的定量分析。

说明书

技术领域

本发明涉及一种白酒中八种生物胺的UPLC-MS/MS检测方法，属于白酒检测分析领域。

背景技术

生物胺是一类含氮的脂肪族(腐胺、尸胺、精胺、亚精胺)、芳香族(酪胺、苯乙胺)或杂环类(组胺、色胺)低分子化合物，主要是通过氨基酸的脱梭或醛和酮的胺化和转氨基作用形成的，对动植物和微生物活性细胞有重要的生理作用，适量的生物胺有助于人体正常的生理功能，过量则会引起不良的生理反应，可导致血压升高，头痛，脸色潮红，出现皮疹；有时主要是胃肠功能紊乱，包括突然出现呕吐和腹泻，并伴随腹痛等症状。生物胺往往是在食品腐烂或发酵过程中产生的，与食物中毒有关的主要生物胺及其前体为：组氨酸(组胺)、酪氨酸(酪胺)、色氨酸(色胺)、赖氨酸(尸胺)、鸟氨酸(腐胺)、精氨酸(精胺)、亚精胺(轻色氨酸)。生物胺的产生有三个条件：一、有可利用的自由氨基酸，但不一定总是导致生物胺的产生；二、氨基酸脱梭酶阳性微生物的存在；三、有适宜的环境条件，利于细菌的生长，脱梭酶的合成和提高脱梭酶活性。

生物胺的来源很多，各种动植物的组织中都含有少量的生物胺，它是生物有机体内的正常活性成分，在机体内起着重要的生理作用。此外，也普遍存在于多种食品和含酒精的发酵饮料中，如：干酪、肉制品、水产品、啤酒、葡萄酒等。生物胺存在于多种食品尤其是发酵食品(如奶酪、葡萄酒、啤酒、米酒、发酵香肠、调味品)水产品及肉类产品等中。有人认为葡萄酒中的组胺及其它生物胺可以作为衡量葡萄酒生产过程中卫生条件好坏的一个主要指标。水产品、肉类制品等蛋白含量丰富的食品中生物胺含量与其质量密切相关，有望成为评价此类食品鲜度的一个重要指标。

各种动植物的组织中都含有少量的生物胺，也普遍存在于多种食品和酒、饮料中。生物胺不仅是生成荷尔蒙、核酸、蛋白质的前体，也是生成致癌物质的前体。少量的生物胺对人体有益，如儿茶胺、和组胺等能调节神经活动，控制血压；苯乙胺和酪胺有升压作用。过量摄入则会引起中毒。

生物胺引起的食品安全和水产品出口问题，生物胺中组胺对人类的健康的影响最大，其次是酪胺。摄入8～40mg组胺会产生轻微中毒症状，超过40mg会产生中等中毒症状，超过100mg会产生严重中毒症状。酪胺超过100mg会引起偏头痛。当食品中生物胺含量达到1000mg·kg^-1时会对人体健康造成极大的危害。除了组胺、酪胺本身的作用外，其他生物胺的存在会增强组胺和酪胺的不良作用。因此，很难确定一个标准来衡量生物胺的毒性。美国FDA通过对爆发组胺中毒的大量数据的研究，确定食品中组胺的危害作用水平为：500mg·kg^-1；欧盟规定鲭科鱼类中组胺含量不得超过100mg·kg^-1，其他食品中组胺不得超过100mg·kg^-1，酪胺不得超过100～800mg·kg^-1；我国规定鲐鱼中组胺不得超过1000mg·kg^-1，其他海水鱼不得超过300mg·kg^-1。我国水产品出口企业如没有重视生物胺的检测，出口产品易遭罚没，而造成严重的经济损失。

发明内容

本发明旨在提供一种白酒中八种生物胺的UPLC-MS/MS检测方法，利用UPLC-MS/MS定量分析腐胺、尸胺、组胺、酪胺、苯乙胺、亚精胺、色胺及精胺八种生物胺，前处理方法简单，无需衍生。本发明方法能快速高效对白酒中八种生物胺进行检测，线性相关系数大于0.99，回收率80～120％之间，相对标准偏差在10％以内，说明此方法能运用于白酒中的8种生物胺的定量分析，为白酒中八种生物胺的检测提供了新的检测手段。

本发明白酒中八种生物胺的UPLC-MS/MS检测方法，待测酒样首先利用旋转蒸发仪旋蒸除醇后，经BEH Amide柱进行梯度洗脱分离，利用UPLC-MS/MS的SIR模式采集数据，ESI正离子模式下监测，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程对各生物胺进行定量。

本发明白酒中八种生物胺的UPLC-MS/MS检测方法，包括如下步骤：

步骤1：前处理

利用旋转蒸发仪蒸发除去待测酒样中的乙醇，白酒中含有的乙醇较多，如果在前处理中不去除乙醇，将产生基质效应，影响白酒中生物胺的定量分析；将旋蒸除醇后的残液转移至容量瓶中，用超纯水定容至20mL，过0.22μm水相滤膜，备用；

步骤2：色谱条件

色谱柱：BEH Amide柱，1.7μm，2.1×100mm，

柱温：30℃

进样量：2ul

流动相：流动相A—乙腈，流动相B—pH＝3的甲酸铵溶液(100mmol)；梯度洗脱；流速0.45ml/min，流动相比例见表1。

表1：流动相比例

时间(min)流速(mL/min)A(％)B(％)00.45752550.45752560.45505080.456535130.457525

步骤3：质谱检测条件

SIR模式；

ESI正离子检测模式；

离子源温度：120℃；

脱溶剂气温度：600℃；

脱溶剂气流量：1000L/h；

锥孔气流量：50L/h；

表2：8种生物胺质谱参数

序号物质名称母离子(m/z)滞留时间(s)锥孔电压(v)1腐胺89.20.04162尸胺103.20.04103组胺112.20.04254苯乙胺122.20.04205酪胺138.10.04166亚精胺146.20.04207色胺161.20.04168精胺203.30.0418

步骤4：标准品的配制

分别配制1g/L的腐胺、尸胺、组胺、酪胺、苯乙胺、色胺、亚精胺及精胺的标准溶液，溶剂为乙腈-水溶液(50:50，v/v)，将八种生物胺的标准溶液混合并逐级稀释，获得不同浓度的混合标准品溶液；

步骤4中，混合标准品溶液中各生物胺的浓度≥50μg/L，逐级稀释获得至少五个不同浓度的混合标准品溶液。

步骤5：标准谱图与标准曲线的绘制

将步骤4配制的不同浓度的混合标准品溶液进行色谱洗脱分离，利用SIR模式进行采集，获得八种生物胺标准品的标准谱图，以每种生物胺的峰面积为纵坐标，该标准品的浓度为横坐标，获得相应生物胺的标准曲线；线性回归方程及检出限见表3：

表3：生物胺线性回归方程及检出限

待测组分线性范围线性回归方程线性相关系数检出限(μg/L)腐胺50-500927.499*X+40611.10.99110尸胺50-500289.281*X+1074.680.99610组胺50-5002415.31*X+12167.10.99110苯乙胺50-5001309.12*X+26296.40.9925酪胺50-500568.433*X+9801.510.99510亚精胺50-5002639.07*X+2611010.99410色胺50-500251.345*X+5284.960.99610精胺50-5001250.95*X+33316.70.99510

步骤6：待测样品的检测

将经步骤1前处理后的待测酒样按照步骤2和步骤3的检测条件进行UPLC-MS/MS分析测定，将获得的待测样品谱图与标准谱图对比，保留时间相同的即为对应物质，通过标准曲线线性回归方程对各生物胺进行定量。

为了确保样品的准确性，对比样品中与标准品中监测离子，如果相同可进一步确定样品中与标准品中为同一物质。腐胺定性定量离子m/z为89.2，尸胺m/z为103.2，组胺m/z为112.2，酪胺m/z为138.1，苯乙胺m/z为122.2，色胺m/z为161.2，亚精胺m/z为146.2，精胺m/z为203.3。

本发明方法的前处理方法为旋蒸仪上旋蒸除醇。超高效液相系统可在13min之内对八种生物胺进行快速分离，并利用UPLC-MS/MS的SIR采集模式对八种生物胺进行定性定量。本发明方法前处理简便，省去了常规生物胺检测中衍生的步骤，能快速高效对白酒中八种生物胺进行检测，线性相关系数大于0.99，回收率80～120％之间，相对标准偏差在10％以内，说明此方法能运用于白酒中的8种生物胺的定量分析，为白酒中八种生物胺的检测提供了新的检测手段。

附图说明

图1是八种生物胺总离子流图。

图2是腐胺离子流图。

图3是尸胺离子流图。

图4是组胺离子流图。

图5是苯乙胺离子流图。

图6是酪胺离子流图。

图7是亚精胺离子流图。

图8是色胺离子流图。

图9是精胺离子流图。

图10是腐胺标准曲线。

图11是尸胺标准曲线。

图12是组胺标准曲线。

图13是苯乙胺标准曲线。

图14是酪胺标准曲线。

图15是亚精胺标准曲线。

图16是色胺标准曲线。

图17是精胺标准曲线。

图18是检测酒样图谱。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明技术方案做进一步分析说明。

1仪器与样品

1.1仪器：

超高效液相色谱系统(ACQUITY Ultra Performance LC Waters公司)配以质谱(MS/MS Waters公司)、旋转蒸发仪(瑞士步琪R-210)、BEH Amide(1.7μm，2.1×100mm)色谱柱。

1.2样品：市售白酒

2方法与结果

2.1.1标准品的准备：分别配制1g/L的腐胺、尸胺、组胺、酪胺、苯乙胺、亚精胺、色胺及精胺的标准溶液，将八种生物胺的标准溶液混合并逐级稀释，最终获得浓度为：50μg/L、150μg/L、250μg/L、350μg/L、500μg/L的8种生物胺混合标准溶液。

2.1.2样品前处理：取样品20mL于旋转蒸发仪上浓缩至10mL左右，再用超纯水冲洗定容至20mL，过0.22μm滤膜后待测；

2.1.3色谱条件：

色谱柱：BEH Amide柱，1.7μm，2.1×100mm色谱柱；

流动相：流动相A：乙腈，流动相B：pH＝3的甲酸铵溶液，100mmol；流动梯度洗脱程序见上表1。

柱温：30℃；

进样量2μL；

2.1.4质谱条件：质谱仪UPLC-MS/MS，电喷雾离子源，正离子扫描模式，离子源温度120℃，脱溶剂温度600℃，脱溶剂气流量1000L/h，锥孔气流量50L/h。具体质谱参数见上表2。

2.2标准曲线的绘制

采用外标法定量，将步骤4配制的8种生物胺的混合标准储备液，用乙腈-水溶液(50:50，v/v)逐级稀释获得浓度分别为50μg/L、150μg/L、250μg/L、350μg/L、500μg/L的混合标准品溶液。以每个浓度下标准品对应的母离子提取离子色谱图中的积分峰面积为纵坐标，该标准品的浓度为横坐标，建立标准曲线，分别获得8种生物胺的标准曲线，线性回归方程见下表：

待测组分线性范围线性回归方程线性相关系数腐胺50-500927.499*X+40611.10.991尸胺50-500289.281*X+1074.680.996组胺50-5002415.31*X+12167.10.991苯乙胺50-5001309.12*X+26296.40.992酪胺50-500568.433*X+9801.510.995亚精胺50-5002639.07*X+2611010.994色胺50-500251.345*X+5284.960.996精胺50-5001250.95*X+33316.70.995

八种生物胺的检测离子分别为：腐胺选择m/z 89.2、尸胺选择m/z 103.2、组胺选择m/z112.2、苯乙胺选择m/z 122.2、酪胺选择m/z138.1、亚精胺选择m/z146.2、色胺选择m/z161.2、精胺选择m/z203.3。

2.3市售白酒中8种生物胺的测定

将前处理后的待测酒样送样检测，按照步骤2和步骤3的检测条件进行UPLC-MS/MS分析测定，结果见图18。提取8种生物胺的检测离子，只有m/z为138.1能够提出，保留时间为0.66min，说明市售白酒中有酪胺检出，根据酪胺标准曲线方程得出该酒样含有酪胺55.1μg/L，其余7种生物胺无检出。