水稻抗褐飞虱基因Bph30及其紧密连锁的分子标记

摘要

本发明提供了水稻抗褐飞虱基因Bph30及其紧密连锁的分子标记。所述水稻抗褐飞虱基因Bph30的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其cDNA序列如SEQ ID No.2，所示抗褐飞虱基因Bph30与分子标记S7紧密连锁，可以利用S7筛选含有Bph30基因的抗褐飞虱水稻品种。通过遗传转化和杂交，将Bph30基因转入普通水稻品种，能够提高水稻对褐飞虱的抗性，从而减轻褐飞虱产生的危害，达到增产和稳产的目的。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种水稻抗褐飞虱基因Bph30及其紧密连锁的分子标记。

背景技术

水稻是一种重要的粮食作物，世界上有超过一半的人以其为主食。同时，由于水稻基因组精细遗传图和物理图谱已完成，其转基因技术相对容易，并且与其它禾本科作物基因组具有共线性，因而被视做模式植物。随着包括水稻在内的多种生物基因组测序的完成，人类开始进入后基因组时代。全面开展功能基因组研究已成为生命科学的前沿领域。因此水稻功能基因的研究对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。

粮食安全问题，是全世界人民面临的挑战。50、60年代的矮化育种和70年代的杂交水稻培育两次科技革命使水稻产量大幅度提高。但近几十年来水稻受到大面积的病虫为害，使水稻生产受到威胁。褐飞虱是我国水稻生产中的主要害虫，其成虫和若虫以口针刺吸水稻汁液，引起黄叶或枯死，导致减产或绝收。据中国农业年鉴记载，1966、1969、1973、1977、1983和2003年全国性大发生，1987、1991、2005、2006和2007年全国性特大发生，褐飞虱危害面积达到水稻总面积的50％以上，给我国水稻生产造成了严重的损失。目前我国每年水稻褐飞虱发生面积为2000万公顷以上，每年因褐飞虱危害造成的直接产量损失达280万吨以上。褐飞虱已对我国水稻生产安全形成严重威胁。

目前，褐飞虱已经成为我国水稻生产中的第一大虫害，对我国当前粮食安全已形成严重威胁。长期以来，褐飞虱的防治主要是依靠施用化学杀虫剂。由于褐飞虱爆发多发生在水稻成熟灌浆期，此时稻株长势旺盛，将杀虫剂施到稻株基部的操作非常困难。事实上由于化学杀虫剂的连年大量施用，褐飞虱抗药性成倍增加，使药剂防治的效果有限。同时使用化学杀虫剂防治褐飞虱，一方面增加了农民的生产成本，另一方面化学杀虫剂还造成对非目标生物的毒杀、对环境和粮食污染等环境和生态问题。

利用抗褐飞虱基因培育抗虫水稻品种是褐飞虱综合防治中最为经济有效的方法。国际水稻研究所(IRRI)的研究结果和东南亚的水稻生产实践证明，即使是只有中等抗性水平的水稻品种，也足以将褐飞虱的群体控制在造成危害的水平以下，不至于对水稻造成实际的危害和产量损失。因此，挖掘水稻抗褐飞虱基因并在水稻育种项目中应用是防治水稻褐飞虱的根本措施。

水稻抗褐飞虱基因的研究始于上世纪70年代初。至今已经在普通栽培稻和野生稻资源中鉴定和定位了二十多个水稻抗褐飞虱的主效抗虫基因(具体综述见Jena等，2010.Current status of Brown Planthopper(BPH)resistance and genetics.Rice2010(3),161-171)。其中，Bph14基因已经成功克隆，这是国际上首次利用图位克隆法分离得到的第一例水稻抗虫基因(Du et al 2009)。

图位克隆(map-based cloning)又称为定位克隆(positional cloning)，是随着分子标记遗传连锁图谱的发展而发展起来的一种基因克隆技术。图位克隆法步骤包括对目标基因进行遗传定位、物理定位、序列分析及遗传转化验证功能。从理论上讲，任何一个能定位的基因都可用图位克隆法分离。图位克隆法一般适合于基因组比较小的物种，如单子叶模式植物水稻，具有基因组小、基因组物理距离与遗传距离之比小而且标记丰富的特点，是最适合应用图位克隆法分离目的基因的作物之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水稻抗褐飞虱的基因Bph30及其应用。

本发明采用遗传学的方法，构建水稻抗褐飞虱的分离群体，利用图位克隆的方法，分离到水稻抗褐飞虱基因Bph30。通过共分离标记检测表明该基因与抗褐飞虱性能是共分离的，通过遗传转化Bph30基因，使感性水稻出现抗褐飞虱的表型，证实了该基因的功能。

本发明提供水稻抗褐飞虱基因Bph30，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因全长9477bp，具有3个内含子和4个外显子，第一个外显子区段为2603-2774，第二个外显子区段为3344-3616第三个外显子区段为4427-7651第四个外显子区段为7853-8586，cDNA全长4404bp。

进一步地，所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示，编码1082个氨基酸。

本发明还提供了所述基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

应当理解，在不影响BPH30蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。

此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的多核苷酸序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的多核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码具有相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明包括基于所述多核苷酸的正义序列或反义序列，包括含有所述多核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。

本发明还提供了所述基因在水稻选育中的应用，所述水稻选育为提高水稻对褐飞虱的抗性。

本发明还提供了与水稻抗褐飞虱基因Bph30紧密连锁的分子标记，所述分子标记为S7；

用于扩增分子标记S7的引物对如下：

正向引物：S7-F:GCTCTTGTGTTTCGCTAGTTATG

反向引物：S7-R:TGTGGACTGACCGAGTTTGT

本发明还提供了所述分子标记在选育抗褐飞虱水稻中的应用。

本发明还提供了水稻抗褐飞虱基因Bph30的分子检测方法，通过所述引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物：若利用引物S7-F和S7-R扩增出279bp的扩增片段，则标志着水稻抗褐飞虱基因Bph30的存在。

本发明还提供了一种筛选抗褐飞虱水稻的方法，通过所述引物对扩增待检水稻基因组DNA，并检测扩增产物：若利用引物S7-F和S7-R扩增出279bp的扩增片段,则标志着水稻品种褐飞虱抗性的存在。

本发明提供一种培育具有褐飞虱抗性的植物的方法，包括：

1)用多核苷酸转化植物细胞；所述多核苷酸含有水稻抗褐飞虱Bph30基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示；

2)将被转化的植物细胞再生为植物；

3)培养再生的植物并使上述多核苷酸得到表达。

本发明还提供一种产生具有褐飞虱抗性的植物的方法，所述方法包括将具有褐飞虱抗性基因Bph30的植物与其他植物杂交产生具有褐飞虱抗性的子代植物。

其中所述植物是单子叶植物。

优选地，所述植物是水稻。

本领域技术人员应能理解，根据本发明公开的序列来设计或产生分子标记可用于抗褐飞虱水稻的选育工作。

本发明通过如下步骤克隆得到Bph30基因：

1.Bph30基因精细定位。根据国际水稻基因组计划公布的水稻基因组序列，设计第4染色体Bph30所在目标区段的SSR标记和InDel标记的引物，用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法检测标记在BC₂F₂大群体中的分离，通过筛选得到的重组单株的表型与基因型的关系，将抗褐飞虱基因Bph30定位在分子标记SSR-28和SSR-69之间，与分子标记S7紧密连锁。

2.候选基因确定。通过PCR方法分段扩增含抗褐飞虱基因Bph30的抗性亲本水稻材料(AC1613)的基因组DNA并拼接得到Bph30所在区段的基因组序列，应用FGENESH在线预测基因，并通过与日本晴序列作对比分析，确定Bph30的候选基因。

3.全长cDNA克隆。根据预测的cDNA序列设计引物，从抗褐飞虱水稻的cDNA中扩得500bp片段，以该段序列设计引物，通过RACE(cDNA末端快速扩增技术)得到了cDNA的3’端和5’端序列，最终获得Bph30的全长cDNA。

然而，本领域技术人员应当理解，根据本发明公开的Bph30的核苷酸序列，通过设计恰当的PCR引物，即可从抗褐飞虱水稻基因组中扩增得到Bph30基因。

4.遗传转化Bph30基因验证其功能。根据Bph30基因的ORF序列，用PCR的方法扩增出Bph30基因的ORF，全长为3249bp，加A后连入经XcmI酶切的PCXUN载体内。测序验证无误后，所得载体即为Bph30基因过表达遗传转化载体。

将过表达载体导入正常粳稻品种Nipponbare中，最后获得Bph30过表达转基因阳性植株18株。用T1代的植株进行了抗性鉴定。采用苗期集团法鉴定，对照水稻Nipponbare(N)全部死亡，转基因阳性植株正常存活。

根据Bph30基因的基因组序列，用PCR的方法从抗性亲本AC1613中扩增出含有Bph30基因的核苷酸片段，全长为9477bp，在前端和后端分别加上EcoR1和Apa1酶切位点，将Bph30基因的基因组序列分段连入到PCAMBIA1300载体中，测序验证无误后，所得到的载体即为Bph30基因本底表达遗传转化载体。

将本底表达遗传转化载体导入正常粳稻品种Nipponbare中，最后获得Bph30本底表达转基因阳性植株19株。用T1代的植株进行了抗性鉴定。采用苗期集团法鉴定，对照水稻Nipponbare(N)全部死亡，转基因阳性植株正常存活。

证实Bph30基因具有抗褐飞虱的功能。因此，抗褐飞虱基因Bph30可以在水稻中应用也可以在水稻种子中应用，培育具有抗褐飞虱性能的水稻品种。

本发明的优点和效果：

1.本基因的成功克隆进一步证实了图位克隆法克隆水稻重要基因的可靠性，该方法克隆的基因其功能明确、效果好。

2.本发明克隆的Bph30基因是一个完全显性的抗褐飞虱基因，纯合基因型和杂合基因型的褐飞虱抗性无差异，可以更好的用于杂交水稻育种。

3.Bph30基因使水稻抗褐飞虱性能大大提高，并且在籼稻和粳稻品种的背景下都具有极强的褐飞虱抗性，这对于水稻品种改良具有重要的意义。

4.通过遗传转化或杂交将Bph30应用于水稻育种中，可以改善水稻品种的抗褐飞虱性，从而减轻褐飞虱的为害，达到增产和稳产的目的。

5.刺吸式昆虫是农业生产中的一大类虫害，Bph30基因克隆和抗褐飞虱功能证实，对于其他植物的抗刺吸式昆虫研究具有重要参考作用。

附图说明

图1为Bph30基因精细定位结果。

A：白色方框表示感性亲本9311的染色体片段，黑色方框表示抗性亲本AC1613的染色体片段；左侧的数字表示对应基因型的重组单株数，右侧的字母表示对应基因型的重组单株的表型；Bph30基因最终定位于分子标记SSR-28和SSR-69之间的20kb区域；经过预测有两个基因，G2和G4；

B：候选基因G4，白色方框方框表示UTR区，黑色方框表示外显子区，直线表示内含子区。

图2为候选基因G4过表达转基因T1代阳性株系抗褐飞虱鉴定结果。

转基因植株放虫后7天的结果；N表示感性对照日本晴Nipponbare，G4OE-2、G4OE-12表示两个转基因T1代阳性株系，当感性对照全部死亡时转基因阳性株系生长健康，说明G4过表达转基因株系对褐飞虱有较强的抗性。

图3为候选基因G4本底表达转基因T1代阳性株系抗褐飞虱鉴定结果。

转基因植株放虫后7天的结果；N表示感性对照日本晴Nipponbare，G4-11、G4-15表示两个转基因T1代阳性株系，当感性对照全部死亡时转基因阳性株系生长健康，说明G4本底表达转基因株系对褐飞虱有较强的抗性。

图4为分子标记辅助选择培育带有Bph30基因的抗褐飞虱籼型水稻品种。

苗期抗褐飞虱鉴定，感性对照籼稻9311，NIL-9311表示9311遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph30的水稻材料，当感性对照9311全部死亡时NIL-9311生长健康。表明NIL-9311对褐飞虱具有较强的抗性。

图5为分子标记辅助选择图培育带有Bph30基因的抗褐飞虱粳型水稻品种。

苗期抗褐飞虱鉴定，感性对照粳稻日本晴Nipponbare(N)，NIL-N表示日本晴遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph30的水稻材料，当感性对照N全部死亡时NIL-N生长健康。表明NIL-N对褐飞虱具有较强的抗性。

图6为根据抗褐飞虱基因Bph30基因组序列开发的共显性分子标记S7示意图。

AC1613是携带有Bph30基因的抗性亲本，TN1、N、9311为感性材料，Bph30基因内部分子标记S7可以准确的从AC1613与以上三种材料的杂交后代中鉴定出纯合抗性、纯合感性以及杂合基因型的材料，携带Bph30基因的材料高抗褐飞虱。

图7为分子标记S7基因型以及抗褐飞虱表型频率分布图。

A：为抗性材料AC1613和日本晴Nipponbare(N)构建的BC₂F₂分离群体中各单株的表型和分子标记S7基因型频率分布图；

B：为抗性材料AC1613和台中1号构建的BC₂F₂分离群体中各单株的表型和分子标记S7基因型频率分布图；

C：为抗性材料AC1613和9311构建的BC₂F₂分离群体中各单株的表型和分子标记S7基因型频率分布图；

其中a纯合抗性品种的基因型，用黑色柱子表示；b是纯合感性品种的基因型，用白色柱子表示，h为杂合基因型用填充斜线的柱子表示。横轴数值表示褐飞虱在水稻植株上取食48h后的增重变化(单位：mg/48h)，纵轴表示单株数量。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1Bph30基因的精细定位与克隆以及紧密连锁分子标记开发

1.Bph30精细定位结果及分子标记的开发

抗褐飞虱亲本AC1613(来自国际水稻研究所，含抗褐飞虱基因Bph30)与褐飞虱感性水稻品种9311杂交再多次回交构建了含Bph30基因的回交群体，用于筛选重组单株。用定位区间两段的标记RM16290和RM16303筛选回交群体BC₂F₂，共得到54株重组单株，并根据Gramene网站(http://www.gramene.org/)公布的标记，以及利用SSRHunter1.3根据日本晴中对应定位区间的序列搜索寻找SSR基序，并根据其侧翼序列设计引物，在重组单株中加密分子标记。采用分蘖期褐飞虱增重法进行抗虫性鉴定，褐飞虱于2006年在武汉田间采集，在TN1稻株上饲养繁殖。分蘖期时按每棵固定三个蜡袋，每个蜡袋中放入一头新近羽化的已知质量的短翅雌虫，48h后称量虫的质量，蜡袋大小为30mm×30mm由Para>

根据重组单株的基因型和表型最终将Bph30基因定位在SSR标记SSR-28和SRR-69之间(如图1)。在参考基因组日本晴的基因组中，两个标记之间的物理距离37.5kb。

2.SSR-28至SSR-69区段候选基因的分析

根据定位区间在日本晴和9311之间进行比对分析，选择保守序列每隔1-2kb进行引物设计，将Bph30基因的抗性亲本AC1613的DNA作为模板进行扩增、测序和拼接。发现在抗性亲本AC1613中，这两个SSR标记之间的物理距离为20kb，说明抗性亲本在该区间存在较大的结构变异，无法用日本晴的基因组序列直接进行基因预测。用FGENESH对抗性亲本AC1613定位区间基因组序列进行基因预测和注解，结果显示该区段含有两个基因，分别命名为G2和G4。候选基因G2的基因组序列和参考基因组日本晴的序列差异较小。G4的基因组序列和日本晴序列比对后发现差异较大，在日本晴中G4的第三个外显子对应的基因组序列中存在一个18kb左右的插入片段。因此，将该基因确定为Bph30。

3.RACE获得全长cDNA

以抗褐飞虱亲本AC1613叶鞘总RNA反转录产物为模板，根据基因预测结果设计引物，扩增出候选基因的一段cDNA序列。通过该序列设计引物，使用TaKaRa公司5’与3’FullRACE试剂盒，获得了候选基因G4的5’末端及3’末端序列，确定了候选基因G4的转录起始位点及终止位点，并拼接出该基因的全长cDNA序列。根据全长cDNA序列重新合成引物，扩增获得G4的全长cDNA，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2。

4.Bph30基因紧密连锁分子标记开发

根据抗褐飞虱基因Bph30的基因组序列，与粳稻品种日本晴和籼稻品种9311的基因组相应位置的序列比对，本发明开发出能够特异的在籼稻和粳稻中鉴定Bph30基因存在的共显性标记S7，引物序列如下：

正向引物：S7-F:GCTCTTGTGTTTCGCTAGTTATG

反向引物：S7-R:TGTGGACTGACCGAGTTTGT。

实施例2Bph30基因的功能验证和应用

1.遗传转化载体的构建

(1)候选基因过表达载体的构建。所用载体为pCXUN(由美国Ohio StateUniversity的王国梁教授提供)，采用XcmI酶切pCXUN载体，将外源片段加A后可以直接连入。

根据RACE的结果，采用PCR的方法直接扩增候选基因G4的ORF，经加A后连入载体。测序验证无误后，所得载体即为候选基因G4的过表达载体。

(2)候选基因本底表达载体构建。根据候选基因G4的CDNA全长信息找到G4在抗性亲本基因组中的全长序列，通过PCR的方法将G4的基因组扩增下来并分段连入PCAMBIA1300载体中，测序验证无误后，所得载体即为候选基因G4的本底表达载体。

2.遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法，将上述G4的过表达载体和本底表达载体导入褐飞虱感性的普通水稻品种Nipponbare。

3.Bph30基因转基因功能验证

候选基因G4过表达转化载体和G4本底表达转化载体分别获得阳性转基因T₀代植株18株和19株。收获种子后，得到T₁代转基因植株，采用苗期集团法对阳性转基因株系进行了抗褐飞虱鉴定。接入褐飞虱7天后，感虫对照品种Nipponbare整株死亡,G4的过表达载体转基因阳性株系(如图2)以及本底表达载体转基因阳性株系(如图3)生长健康，无叶片受害。证实候选基因G4就是Bph30基因，并且具有抗褐飞虱的功能。因此，抗褐飞虱基因Bph30可以在水稻中应用也可以在水稻种子中应用，培育具有抗褐飞虱性能的水稻品种。

实施例3分子标记辅助选择带有Bph30基因的抗褐飞虱水稻

本例中利用分子标记进行分子标记辅助选择选育出携带Bph30基因的抗褐飞虱籼稻品种NIL-9311(9311遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph30)，具体实施如下：抗褐飞虱亲本AC1613(含抗褐飞虱基因Bph30)与褐飞虱感性水稻品种9311杂交获得F₁代，用9311进行回交，利用与Bph30连锁的分子标记(SSR-28、SSR-69)对BC₁F₁进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph30的BC₁F₁用9311进行回交，得到BC₂F₁；利用与Bph30连锁的分子标记(SSR-28、SSR-69)对BC₂F₁进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph30的BC₂F₁用9311进行回交，得到BC₃F₁；利用与Bph30连锁的分子标记(SSR-28、SSR-69)对BC₃F₁进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph30的BC₃F₁用9311进行回交，得到BC₄F₁；利用与Bph30连锁的分子标记(SSR-28、SSR-69)对BC₄F₁进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph30的BC₄F₁用9311进行回交，得到BC₅F₁；利用与Bph30连锁的分子标记(SSR-28、SSR-69)对BC₅F₁进行筛选，筛选出含抗褐飞虱基因Bph30的BC₅F₁用9311进行回交，得到BC₆F₁；选择在农艺性状上与9311无差异的材料进行加代繁殖，获得BC₆F₂；并利用与Bph30连锁的分子标记(SSR-28、SSR-69)筛选出抗褐飞虱基因Bph30位点纯合的BC₆F₂，进行加代繁殖，该材料在农艺性状表型上与9311无区别，但其含有抗褐飞虱基因Bph30。利用武汉田间褐飞虱群体进行苗期集团法鉴定，结果显示放虫后7天，对照感性9311明显死亡，而NIL-9311(9311遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph30)仍然存活，植株生长健康(图4)。

同时利用分子标记进行分子标记辅助选择选育出携带Bph30基因的抗褐飞虱粳稻品种NIL-N(日本晴遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph30)，具体实施过程同上。利用武汉田间褐飞虱群体进行苗期集团法鉴定，结果显示放虫后7天，对照感性日本晴明显死亡，而NIL-N(日本晴遗传背景携带抗褐飞虱基因Bph30)仍然存活，植株生长健康(图5)。

由此可以证实抗褐飞虱基因Bph30不受水稻品种遗传背景的限制在籼稻和粳稻遗传背景下都具有极强的抗性。

实施例4分子标记的验证

1.材料：抗性材料AC1613和粳稻日本晴Nipponbare(N)构建的BC₂F₂回交群体包含50个单株，抗性材料AC1613和籼稻台中1号(TN1)构建的BC₂F₂回交群体包含50个单株；抗性材料AC1613和籼稻9311构建的BC₂F₂回交群体包含50个单株；各单株的种子经过浸种、催芽后播种在塑料桶中，生长至分蘖期。

分子标记引物S7，序列如下：

正向引物：S7-F:GCTCTTGTGTTTCGCTAGTTATG

反向引物：S7-R:TGTGGACTGACCGAGTTTGT。

2.方法：CTAB抽提法提取水稻样品基因组DNA。共显性标记S7扩增样品DNA。10μl体系。10μl反应体系包括：10×PCR缓冲液，1.0μl；10mM dNTPs，0.1μl；10μM引物，0.4μl；5U/μlTaq DNA聚合酶，0.2μl和50ng DNA模板。扩增反应在Bioer PCR仪上进行：98℃2min；98℃10s，55℃20s，72℃20s，35个循环；72℃5min。扩增产物用1％的琼脂糖胶分离，电泳后记录分析。

分离群体中各单株的表型用褐飞虱取食48h后增重法来鉴定。收集新近羽化的褐飞虱短翅雌虫，制作30mm×30mm蜡袋并放入雌虫1头，然后将蜡袋绑定至水稻茎秆上，48h后，终止取食。在褐飞虱取食前和取食后，在十万分之一精度天平上虫体重量。取食前后虫体重量之差即为虫体增重量，每个单株上的放虫实验重复3次以上，确保取得精确、可重复的结果。褐飞虱增重0.55mg/48h为界限，增重小于0.55mg/48h的为抗性单株，增重大于0.55mg/48h的为感性单株。

3.结果：用分子标记S7扩增上述两个群体中的单株，由图6的结果表明，在以上三个离群体中能扩增出279bp片段的单株都表现出抗褐飞虱的表型，不能扩增出279bp片段的单株都表现出对褐飞虱的感性表型。图7中可见，褐飞虱取食含有Bph30基因的单株(a和h)时，增重很少，表明含Bph30的水稻单株对褐飞虱有很好的抗性。

由此说明，本发明提供的分子标记方法能够准确筛选出含有抗褐飞虱基因Bph30，从而大大提高育种效率。

序列表

<110>武汉大学

<120>水稻抗褐飞虱基因Bph30 及其紧密连锁的分子标记

<160>5

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>9477

<212>DNA

<213>水稻(rice)

<400>1

gaattcacct tccgcgcacg caaaatggag tgatgtattt tcttacgatt aattaggtat60

ttactatttt tttgaaaaat agattaatat gattctttaa agcaactttc gtatagaaac 120

tttttgcaaa atacatattg tttagcggtt tgaaaagcgt acacgcggaa cacgacggag 180

gtgagttggg aaaaatgggg gaagaacaca acctaagtct taaactctcc tccacggctc 240

ctctatcgag aaccactcat tctctccctc tcctatcttc tctctctcac tagatccaca 300

cacgagctct ccttatcctt cacttgccac cgtttctcct cgtgtagaag caaccacacg 360

gcttgccttg gcttggcgac ggcgacttcg aacacatggc attggatgag cagtgaaggg 420

gaaggggtgg gtcggcatta tcgaacgagg gccagagctt gggactagcg acaacaatag 480

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tggtgaacga acatctatgt gggttgttta caacaatgtt gtggccctag atctgttgga 600

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ggtagatcgg ggtactggga tggtggttca ctactagaga aatgcacttc ggtgcctgtt 780

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ccgcacacca ccgatctcgc cgccgagggg catgcaagac gacggtgaga aggctagatc1380

caggtgctgg gaccccgtga actccggtgg tggtggaacc tccctagctt cttagggaca1440

gcgacaacaa cttcaacgtc gaccacatga tcttcgcatg ccttataatt gtaagcgggg1500

cggctgggcg cccatgaaaa atcatttttt tctatctgcg aatacccatc ttgtagtggt1560

gctagattag caaacctgtt ttttccttct ttttttttgg gggggggggg gtttgaacta1620

tggtggctta ggtagcctac atgccaatca aagtttcaaa tttagtttaa ctccaaggga1680

gaatgtattc tatcgaattt agaaaaaaat gtcaaaattc atgatttatt taattgtttg1740

tggaattatg tttgaaattt tgtaatttat gttaccccga aatgtttatg cattatgaga1800

tagttaaccc tatactccct ccggttctat attaattgac gttttgaata aggttgaggc1860

taaactttta taactttgac catcaataac tttaaaaata tttaatttaa agaaaataga1920

ataacatata taagtttttc tttcaaagca ctataataaa agtaaacatg catttattta1980

ttgtatatat tataatagaa aaataagatc aaagatatat cttgttgacc gtgtcattgt2040

ccaaaacgtc aattaaaatg aaactggagg gagtataggg tatcatattc taaccttgga2100

gttaacaaga cacagttgct tttgtatcct ggattgacga cgtacatccc ttttgcttta2160

tcttttgctt tttgcacttt aatcaaggag gcgaagcaaa gaatacgacg attagccaac2220

tactaactcc aaattatcta tagccaattt aatagtcgat ttatacaaca attacttaca2280

atactattaa tatgtgatcc cacctgtcat agaagcatat attatgtctt gaagtccgtg2340

ctacagctgt ctacagatct gtagcccact gtttttctct ctactttttt atctctttaa2400

aatatatatg tttatagctg gcttacagtc tgctattgta cctcctctca gatgatgcat2460

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gctctagccc agaacatcga tctatcgatc atattgcatc cagtttgatc gtttcaattt2700

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aaacatcgtg attaaggtaa actagctaca tcatatcgtg cagtttaatt gcgctctctc2820

tctctctctc cccctatgtg tgtgtgttga tgcatcaaca tgcatatata tatatatatg2880

tatgtacaaa atcatctcag ttttataagc tttaatttta gttagatctc tagctatgtg2940

gtatattatt taatttggtt ttctacggga tgttcacaca tatataaata tatgaaatgc3000

ttgcatgctg ttgtaattct ggcttaattt gtacgtttcg tttatatgaa aagatgattt3060

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acgaattaaa gatatatatg catccgtgta gtatatcatc gtcgtcgttg attattaatc3180

aaattaaaat acacttggat tatactgcat tcacttgtgt ccatttgaaa cccaggcgca3240

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taaataatca ggagtgggct ggagaaatcg atccatcagg catctatata tcatgggtta3420

attaattaca gggcttgctt caacatatat atgtattctc tgtcgtcgat ccatttctaa3480

ttaaggatcg attaatctat tgaaagaaga tcgattgaga ttatatgatc gatgaagctg3540

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ccatatttta tactataaat tttggcacat caagtattat gtatctcaat gtataaaaga3960

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atacatagag ccctacgact gccttctgat tttgtggacg agtcgtcctt cttcgggaca5460

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aactggatgt ggccatgtaa atcggaggac agcacctctc actacattag cttacaagat6840

gataagagga tgcagacgaa accattgtcg tcgccatctt tgccaggttt catctgtgaa6900

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gataaggcac ggagatggaa taacctagag tggtgcagag tggagagatg ccctaacatt7020

gaaggtgttg ttttcactcc acctagtcct ggcggtgctg aaattttctt gtacctgaag7080

acattctggg catcccaact agcaagggcg cgccacatct gggactgggg cataaggggc7140

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tgccccaggt tgatatatgt gcttccctta tattacaaca gtccttccta tgcataccgt7260

tggttggaaa cccttgagat cgtgtgttgt ggtgacctca aggatgtctt ccgagtggat7320

gataataatc aagagcttct ggtggcaact atagaattcg aagagctgaa gcacatccac7380

ctgcacgagc tgccctctct gcaacgcatc tgcgggcata ggattgtggc gcccaagctc7440

gagaccatca aaatccgagg atgctggagc ctcacccgcc taccggctgt tggtcttgac7500

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tgggatgggt tggagaacgg acaccatcct tccctctatg tgcccaccca ctcatgctac7620

aacaagaaga aactgcccag aggttccatg ctcaggtatg tacatatgtc tgtgtgcata7680

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atagctcagt actttagtta ctccatcata tatacatata tatatatgat caagcttttc7800

cctttttttt ttaattttgt ctgacttggc gtgctttctt ttcttcttaa attcaggtga7860

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ttggggctgg tgttcaatgt gctcgctcat ttcatcatat catttgcaac ggcagcaata8040

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gatgctcagc tgccagctgg tgtgtgagct ctgcatctat ctgctaagtt attttctcca8220

tacatgcttg ctttccgttt ggccggttag tcgatctgct tgttcgaccg atccatccat8280

cggattacta cgtatgcttc atctttctgg atagatgatc atacatgtat atgtgaaaac8340

tttgatctct agcaccgttc tggtgtggtg tgcttcctag aggtcgacga ataaatcatc8400

agcttcagcg gcatgagaag atccattggg tgatcctcat gcagtcgagt tgctgttgtg8460

cacttgtttg tgggtgcgtg tgtgttcgtg tgatttgtca gcatatgtgg actgaccgag8520

tttgtactcc taattacttc acttgtatga acagaaacaa tgatgatgat tgtgagtgtg8580

acatatattt tctatgctgc aaatgtatgt attagttgct ctgtcatttt actctgtgta8640

tgcagtaaga tttggggtat attactctgt gtatcctagg tgttagtgtt atgctgggcc8700

tgtatgaata cacacattag gcccattttg gcagacagct gcacctatta aaaatacaat8760

ccataactag cgaaacacaa gagcaaaaat acagtccttt ttccaattca gtgcttactc8820

aagaaaacct caaactagat ttccagtctt catttttccc tgtttatcct aattttgtag8880

ctacaattaa ttcaagatac aggagattaa agaacttgga cttaaaaaat aatggtgaca8940

cagtagcacc ttaatttcct tctagtttca gaagggacaa tttcctttga ttcaactata9000

tccaaaacag gcttcaaatt acatccagtt ctacatcctt gctttgcagg aagcattgga9060

tcttgctaga gaagccatta gttatacgag tagaagcagc aggtcgagaa gcttggcaac9120

atgtaggctg caccctgcat tttctttcat aagtgatggt tgatgcaatg caaatcctag9180

tcttgctagg agattacagg aaagctaggt gatctgattt gagcaaattc gcacagtttt9240

gccagccatt tgttgcatta gttagagatc catctgatcc atatacgcat tacgattaat9300

tgtgttacag aacgtattta aaaatactga tcgatgcatg tgtcctacta gtatatatgt9360

acggcaagac aaaagcatgc aggatcatga gttggacaag gagcaggtga accgacatta9420

tttacctttt tctttgcggg tgagccccac gcagcagcct atgttgctcg ctgagct 9477

<210>2

<211>4404

<212>DNA

<213>水稻(rice)

<400>2

attctagacg acagtacgtt tttacaaggc ttctgctagc tctagcccag aacatcgatc60

tatcgatcat attgcatcca gtttgatcgt ttcaatttat gctcgccctc gcaccaacaa 120

tggcttagct aatccccatg tactcgatct ctgtcggcaa acatcgtgat taaggctgga 180

gcgagtaatt aaataatcag gagtgggctg gagaaatcga tccatcaggc atctatatat 240

catgggttaa ttaattacag ggcttgcttc aacatatata tgtattctct gtcgtcgatc 300

catttctaat taaggatcga ttaatctatt gaaagaagat cgattgagat tatatgatcg 360

atgaagctgc ccgcttaact gtaattcaac attaattgaa gagagccagg ctacacagat 420

caactcaaca tgccaccagc ggaggagtgg accatgatca tagcaggcag catcgatgaa 480

gcagcaggca tggtaattga attgctggag gatacaagca aggggaatgt gatgtatttc 540

catggctggt ggggactggg ggcttcagcc gtcctcagag cagtcgccaa aagactgacg 600

atgaggccat cgccatcgcc aggaagaaga aggtgggaga agatgatcca cgttgattgc 660

tcggtgtggc agagcaagag ggccctgcag aaggccatcg cccaggagct gcagcttcct 720

tggtcgctga tggccttgtt cgaccagcac gacgaggagg atgatttcag tggggtggag 780

cagagtgcta gaggggtaat acaagacgtc agccaggcta tattgaacat tcttgccagc 840

cgcacattcc tggtgatctt ccacaatggg agcaatggct acattgatct gctagagtgt 900

ggtgtccctg taataacagg aatcttgaac aaaacggtgt tgtggacctc ccgaagcagc 960

tttcggatta cctacttgga cattgataac gtaagcaagg aggataagga taaacttgct1020

gggctgagtg atgccgctat atatgctgat tcagccgcag acggtgaaga tagttttcta1080

gacttatttg gaatgctttt gcatcaagag gcagaggagg ttgccaggta caccggtgtc1140

cctcaatctg ctggcatgag caccgagctt gtcaagaagt gcatcatgta tcagttgatg1200

ctaagacaac aacatgtgga ctacacccaa cactgggata cccacgcagg taactattgg1260

gtatgtagtg gaatcataca aacctcttca gacaccacta gtagtacaag ttgtcatagc1320

tcatcgccat gggagatagc ccaagctctt cataataact tgatcttgaa gtttttgacc1380

atggacgatt acaacagcga cccaacttat gcggaaacaa tacatagagc cctacgactg1440

ccttctgatt ttgtggacga gtcgtccttc ttcgggacat gtgatgctgc tggcaataac1500

aatgtcgacg caactacagc ttgttgtaga cagaaatcac tggaggccaa aatgttccaa1560

catccatctg caagctggct acgtgtgata catctctttg aatgtacctt cagttttgca1620

tctccaccct tcctctcttg cagcagccta agattcctcc tacttgacca ttgcaaagac1680

caaaacagca gcaggacgga ctcaacgctg acgatgacaa cggataccgg agatactaga1740

gcttgttttc ggaagctgtg ggtgctggac ttgagtttca cagactggta ttggctctta1800

tcggttgagg ccctagattt aatggttgag ctcagggagt tgaatgtgaa gggaatcaag1860

cattggagca taagccatct actccatcgc cttgatgatg atgacgctag taatagtacc1920

cgaagcagca gccgcaagcc ttggctgctc agccttgtca agctccaagt cacaaccgaa1980

ccaataactg aagatcaaca tcagtcacaa gtatggaagg aagatcaggt agcagcaaca2040

ttattcccaa acctatctag ctgcaaaatc gtaaagacga tcattcttga tggttgtttt2100

gagttgaagc gaattgaccc tcacgtcctg ccaccatcac tcgagtcatt tagcttctcc2160

agcagcagca atgacaatga tgttcatgtc tcggccaaga tagagagcat ctccttccgg2220

ggatgcaccc agttgaagag tgtgttattg agaggactat ttcaaaggct caagcagcta2280

gacgtgtcag aaacttgtat taaaaccctc gacctacgtg caatgcgagg caacgggtct2340

ctcaaggagc tatttctgct tgaatgcaag gagcttcgtg caatactatg gccaaaacaa2400

gatgtatcat tggaggttct gcacatcgac actagtagca cagaacttga tcatgctaca2460

ggtgtagaag aatcatcatc attctcacct gttgaattta aatggtatat ttcagtgagg2520

gacagaaggc tccttcgctc gctaaatgat acagaatatc ccttggatgc accatgcatc2580

gagatctcat cccttcctgc tagtgttgct actgctacta ctgatggttc tgaattaggc2640

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tgctggagcc tcacccgcct accggctgtt ggtcttgaca gtacccgcaa gcccaagccc3540

aaggtggatt gtgagaagga atggtgggat ggcctgcagt gggatgggtt ggagaacgga3600

caccatcctt ccctctatgt gcccacccac tcatgctaca acaagaagaa actgcccaga3660

ggttccatgc tcaggtgatc gatatatacg tccatacact acatatttga tactgtaatc3720

atctacgtat cattcccttt ccctcatcca gtggctcatc aagttcttca gctctatctc3780

tattatatat gtccttattt ggggctggtg ttcaatgtgc tcgctcattt catcatatca3840

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tgtgaaaatt aataaatgga tgctcagctg ccagctggtg tgtgagctct gcatctatct4020

gctaagttat tttctccata catgcttgct ttccgtttgg ccggttagtc gatctgcttg4080

ttcgaccgat ccatccatcg gattactacg tatgcttcat ctttctggat agatgatcat4140

acatgtatat gtgaaaactt tgatctctag caccgttctg gtgtggtgtg cttcctagag4200

gtcgacgaat aaatcatcag cttcagcggc atgagaagat ccattgggtg atcctcatgc4260

agtcgagttg ctgttgtgca cttgtttgtg ggtgcgtgtg tgttcgtgtg atttgtcagc4320

atatgtggac tgaccgagtt tgtactccta attacttcac ttgtatgaac agaaacaatg4380

atgatgattg tgagtgtgac atat 4404

<210>3

<211>1082

<212>PRT

<213>水稻(rice)

<400>3

Met Pro Pro Ala Glu Glu Trp Thr Met Ile Ile Ala Gly Ser Ile Asp

1 5 1015

Glu Ala Ala Gly Met Val Ile Glu Leu Leu Glu Asp Thr Ser Lys Gly

202530

Asn Val Met Tyr Phe His Gly Trp Trp Gly Leu Gly Ala Ser Ala Val

354045

Leu Arg Ala Val Ala Lys Arg Leu Thr Met Arg Pro Ser Pro Ser Pro

505560

Gly Arg Arg Arg Trp Glu Lys Met Ile His Val Asp Cys Ser Val Trp

65707580

Gln Ser Lys Arg Ala Leu Gln Lys Ala Ile Ala Gln Glu Leu Gln Leu

859095

Pro Trp Ser Leu Met Ala Leu Phe Asp Gln His Asp Glu Glu Asp Asp

100 105 110

Phe Ser Gly Val Glu Gln Ser Ala Arg Gly Val Ile Gln Asp Val Ser

115 120 125

Gln Ala Ile Leu Asn Ile Leu Ala Ser Arg Thr Phe Leu Val Ile Phe

130 135 140

His Asn Gly Ser Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Cys Gly Val Pro

145 150 155 160

Val Ile Thr Gly Ile Leu Asn Lys Thr Val Leu Trp Thr Ser Arg Ser

165 170 175

Ser Phe Arg Ile Thr Tyr Leu Asp Ile Asp Asn Val Ser Lys Glu Asp

180 185 190

Lys Asp Lys Leu Ala Gly Leu Ser Asp Ala Ala Ile Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Ala Ala Asp Gly Glu Asp Ser Phe Leu Asp Leu Phe Gly Met Leu Leu

210 215 220

His Gln Glu Ala Glu Glu Val Ala Arg Tyr Thr Gly Val Pro Gln Ser

225 230 235 240

Ala Gly Met Ser Thr Glu Leu Val Lys Lys Cys Ile Met Tyr Gln Leu

245 250 255

Met Leu Arg Gln Gln His Val Asp Tyr Thr Gln His Trp Asp Thr His

260 265 270

Ala Gly Asn Tyr Trp Val Cys Ser Gly Ile Ile Gln Thr Ser Ser Asp

275 280 285

Thr Thr Ser Ser Thr Ser Cys His Ser Ser Ser Pro Trp Glu Ile Ala

290 295 300

Gln Ala Leu His Asn Asn Leu Ile Leu Lys Phe Leu Thr Met Asp Asp

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Asp Pro Thr Tyr Ala Glu Thr Ile His Arg Ala Leu Arg

325 330 335

Leu Pro Ser Asp Phe Val Asp Glu Ser Ser Phe Phe Gly Thr Cys Asp

340 345 350

Ala Ala Gly Asn Asn Asn Val Asp Ala Thr Thr Ala Cys Cys Arg Gln

355 360 365

Lys Ser Leu Glu Ala Lys Met Phe Gln His Pro Ser Ala Ser Trp Leu

370 375 380

Arg Val Ile His Leu Phe Glu Cys Thr Phe Ser Phe Ala Ser Pro Pro

385 390 395 400

Phe Leu Ser Cys Ser Ser Leu Arg Phe Leu Leu Leu Asp His Cys Lys

405 410 415

Asp Gln Asn Ser Ser Arg Thr Asp Ser Thr Leu Thr Met Thr Thr Asp

420 425 430

Thr Gly Asp Thr Arg Ala Cys Phe Arg Lys Leu Trp Val Leu Asp Leu

435 440 445

Ser Phe Thr Asp Trp Tyr Trp Leu Leu Ser Val Glu Ala Leu Asp Leu

450 455 460

Met Val Glu Leu Arg Glu Leu Asn Val Lys Gly Ile Lys His Trp Ser

465 470 475 480

Ile Ser His Leu Leu His Arg Leu Asp Asp Asp Asp Ala Ser Asn Ser

485 490 495

Thr Arg Ser Ser Ser Arg Lys Pro Trp Leu Leu Ser Leu Val Lys Leu

500 505 510

Gln Val Thr Thr Glu Pro Ile Thr Glu Asp Gln His Gln Ser Gln Val

515 520 525

Trp Lys Glu Asp Gln Val Ala Ala Thr Leu Phe Pro Asn Leu Ser Ser

530 535 540

Cys Lys Ile Val Lys Thr Ile Ile Leu Asp Gly Cys Phe Glu Leu Lys

545 550 555 560

Arg Ile Asp Pro His Val Leu Pro Pro Ser Leu Glu Ser Phe Ser Phe

565 570 575

Ser Ser Ser Ser Asn Asp Asn Asp Val His Val Ser Ala Lys Ile Glu

580 585 590

Ser Ile Ser Phe Arg Gly Cys Thr Gln Leu Lys Ser Val Leu Leu Arg

595 600 605

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Leu Asp His Ala Thr Gly Val Glu Glu Ser Ser Ser Phe Ser Pro Val

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