一种太湖白鱼宿主防御肽及其应用

摘要

本发明公开了一种太湖白鱼宿主防御肽及其应用，属于生物医学技术领域。本发明的太湖白鱼宿主防御肽易获得，且成本低；分子量小，可通过化学合成获得，同时也克隆到了其编码基因，也可以通过构建原核或真核表达载体，通过大规模发酵获得。此外，太湖白鱼宿主防御肽对水产养殖病原菌，特别是耐药性水产养殖病原菌具有杀灭作用，且为太湖白鱼自身免疫系统的组成部分，可制备新型免疫制剂，应用到太湖白鱼的水产养殖中。

说明书

技术领域

本发明涉及一种太湖白鱼宿主防御肽及其应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

太湖白鱼学名翘嘴红鲌(topmouth culter：Erythroculter ilishaeformis)，有多种俗名：大白鱼、翘嘴巴、翘壳、白丝、兴凯大白鱼、翘鲌子、鲌刺鱼、翘白、白鱼、噘嘴子浮鲢等，广东地区俗称长江和顺，长江中游俗称翘白、白鱼，长江下游俗称太湖白鱼。隶属鲤科、鲌亚科、鲌属，是鲌属鱼类中个体最大、生长速度最快的种类。太湖白鱼肉质洁白细嫩，味道鲜美，为江河优质重要经济鱼类之一，亦是太湖名贵鱼类，其与银鱼、白虾并称“太湖三白”而名闻天下。

但由于其肌肉营养价值高、肉美味鲜，备受人们的青睐，市场需求却越来越大，导致过度捕捞，天然资源日趋减少，因此，养殖太湖白鱼有着良好前景。自2000年起，我国才开始对太湖白鱼的育苗和养殖。作为太湖流域重要的特种水产品种，太湖白鱼的养殖发展前景十分广阔。

太湖白鱼养殖业的高速发展的同时，养殖环境也在不断的恶化，高密度的养殖模式导致太湖白鱼养殖中的病害频繁爆发，目前主要采用“药物防治”为主，辅以“生物防治”。“药物治疗”虽然见效快，但药物残留现象严重，影响太湖白鱼食用的安全性，还会造成环境污染，限制了养殖业的发展。同时，反复的使用“药物治疗”，特别是抗生素，会加剧细菌耐药性的发生，存在巨大的潜在危害。“生物防治”虽有一定效果，但目前还不能做到集约化养殖所要求的水准。因此，“免疫治疗”，特别是基于太湖白鱼自身免疫分子开发的“免疫治疗”必将成为新兴鱼药产业。鱼类的固有免疫在抵抗病原体感染的免疫应答中作用更为重要。

然而，针对太湖白鱼的免疫系统研究是个空白。太湖白鱼属于硬骨鱼，属于已知的最低等的兼具固有与适应性免疫系统的脊椎动物。硬骨鱼类也具有完全的体液和细胞免疫应答，但与哺乳类不同，鱼类的固有免疫系统在抵抗病原体感染的免疫应答中作用更为重要，主要是因为鱼类属于变温动物，淋巴细胞的增殖较为缓慢，获得性免疫应答的发生相对滞后(可长达12周)，其次，在进化上鱼类的免疫系统也不如高等动物完善，抗体的亲和力、抗体库的大小均明显低于哺乳类。鱼类的固有免疫系统也具有天然的物理、化学屏障，如鱼鳞、皮肤、鳃粘膜(含凝集素、正五聚蛋白、溶菌酶、补体蛋白、抗菌肽、天然抗体IgM)、上皮组织等。体液中存在的诸多化学因子也有重要的抗感染作用，如转铁蛋白(也可在诱导后发挥急性期蛋白作用并活化巨噬细胞)、溶菌酶(也具有调理作用，可活化补体系统和吞噬细胞)、抗菌肽等，无须诱导即产生抗感染作用。与哺乳类相同，鱼类诱导产生的固有免疫应答主要也依赖于细胞因子和趋化因子。现在已经分离出具有生物学活性的鱼类细胞因子和趋化因子包括TNF-α、IL-6、I型和II型干扰素及其诱导表达的的基因(ISG)Mx、OAS、ISG15、IL-8、CXC以及I、II类细胞因子受体等。在功能上，这些细胞与趋化因子的作用机理也类似于高等动物，将吞噬细胞招募至感染部位，引发炎症反应、活化补体系统，进而吞噬或裂解侵入的病原体。因此，亟待深入研究太湖白鱼的固有免疫系统组成，为日趋严重的养殖病害防治提供必要的免疫理论与应用基础。

发明内容

为解决上述问题，本发明从太湖白鱼中识别固有免疫分子(宿主防御肽)，推进对太湖白鱼的免疫系统组成与特点的认识，拟进一步为基于太湖白鱼自身免疫系统开发的“免疫治疗”在其养殖业病害防治中的应用提供理论与应用基础。

本发明的第一个目的是提供一种来源于太湖白鱼(Erythroculterilishaeformis)的宿主防御肽，所述宿主防御肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码上述宿主防御肽的基因。

在本发明的一种实施方式中，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种表达质粒，包含编码上述宿主防御肽的基因。

本发明的第四个目的是提供一种宿主细胞，包含上述表达质粒。

本发明的第五个目的是提供上述宿主防御肽在制备水产养殖动物的水产养殖病原菌防治药物中的应用。

在本发明的一种实施方式中，水产养殖动物为太湖白鱼。

在本发明的一种实施方式中，水产养殖病原菌为温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌中的一种或几种。

在本发明的实施例中，药物中宿主防御肽对以上病原菌的最小抑菌浓度为4.69-37.5μg/mL。

本发明的第六个目的是提供一种所述的宿主防御肽在制备水产养殖病原菌的药物中的应用。

在本发明的一种实施方式中，水产养殖病原菌为温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌中的一种或几种。

本发明的第七个目的是提供一种水产养殖动物饲料，包含所述的宿主防御肽。

在本发明的一种实施方式中，水产养殖动物为太湖白鱼。

本发明的有益效果在于：本发明中的太湖白鱼宿主防御肽易获得，且成本低：分子量小，可通过化学合成获得，同时也克隆到了其编码基因，也可以通过构建原核或真核表达载体，通过大规模发酵获得。此外，太湖白鱼宿主防御肽对水产养殖病原菌，特别是耐药性水产养殖病原菌具有杀灭作用，且为太湖白鱼自身免疫系统的组成部分，可制备新型免疫制剂，应用到太湖白鱼的水产养殖中。

附图说明

图1为太湖白鱼头肾匀浆上清Sephadex G-50葡聚糖凝胶过滤层析；

图2为滤纸片法检测抗菌活性：1.氨苄青霉素(阳性对照)，2～6：分别为葡聚糖凝胶过滤层析的洗脱峰峰Ⅰ～Ⅴ，CK：生理盐水(阴性对照)，bacteria 1：哈维氏弧菌，bacteria 2：副溶血弧菌；

图3为葡聚糖凝胶过滤层析后的第三洗脱峰经反相高效液相色谱层析；

图4为太湖白鱼hepcidin的编码基因和氨基酸序列；

图5为hepcidin-EI在副溶血弧菌感染后的太湖白鱼头肾中的诱导表达分析。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：太湖白鱼头肾中宿主防御肽的葡聚糖凝胶层析

太湖白鱼购自太湖水产养殖中心，体长15～20cm，解剖太湖白鱼，采集免疫器官头肾，加入含有1％(v/v)蛋白酶抑制剂的20mM的PBS(1mL/100mg组织)，并冰上匀浆，加入液氮，反复研磨三次，5000g离心30min，收集上清，冷冻浓缩备用。用Sephadex G-50葡聚糖凝胶进行过滤层析。将约1g冻干粉溶解于10mL的0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄pH6.0的磷酸盐缓冲液中，上样于已平衡好的Sephadex>

结果如图1所示，头肾匀浆液上清经过葡聚糖凝胶过滤层析，共分为5个洗脱峰，收集各洗脱峰真空冷冻干燥后，进行下一步的抗水产养殖病原菌活性的检测。

实施例2：抑菌圈法检测Sephadex G-50葡聚糖凝胶过滤层析各洗脱峰的抗水产活性

首先采用了抑菌圈法，检测了太湖白鱼免疫器官头肾经过Sephadex G-50葡聚糖凝胶过滤层析的5个洗脱峰对副溶血弧菌和哈维氏弧菌的抑菌活性。将这两株水产养殖病原菌接种于营养肉汤固体培养基上，37℃培养箱中倒置培养。待菌落长出后，用接种环挑取单菌落均匀涂布于营养肉汤固体培养基表面，将经过灭菌的直径为0.5cm的圆形滤纸片粘贴于培养基表面，取待测样品溶液(10μL，约2mg/mL)滴加于滤纸片上。37℃培养箱中倒置培养18-20h，观察抑菌圈形成与否，有抑菌圈形成则表示样品有抗菌活性。阳性对照用氨苄青霉素。

结果如图2所示，阴性对照(CK，生理盐水)对受测的这两株菌都没有抗菌活性，氨苄青霉素(1，阳性对照)对哈维氏弧菌和副溶血弧菌都有抗菌活性，经过葡聚糖凝胶过滤层析的洗脱峰Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ对哈维氏弧菌和副溶血弧菌都具有一定的抗菌活性。

实施例3：反相高效液相色谱层析

首先对葡聚糖凝胶层析中的第III洗脱峰，采用反相高效液相色谱层析(reversephase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC，C18，25×0.46cm)进一步进行分离纯化。以水(含0.1％三氟乙酸)：乙腈(含0.1％三氟乙酸)组成的洗脱系统，0.7mL/min进行梯度洗脱，用紫外监测220nm处的光吸收，收集各峰，真空冷冻浓缩，抑菌圈法跟踪检测抗菌活性。

结果如图3所示，葡聚糖凝胶过滤层析后的第III洗脱峰经过反相高效液相色谱层析后，又被分为约13个洗脱峰，收集各洗脱峰，真空冷冻干燥后，按照上一步中的滤纸片法跟踪检测抗水产养殖病原菌的活性，其中一个的洗脱峰，具有抗菌活性(图3，箭头标记)。

实施例4：初级结构特征分析

用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)UltraFlex I质谱仪(Bruker Daltonics)对纯化到的抗菌多肽的纯度和分子量进行分析。并用Edman降解法对纯化得到的抗菌肽进行N端测序(model 491，ABI，USA)。

经过反相高效液相色谱层析获得的抗菌活性洗脱峰，真空冷冻干燥后，送到公司用基质辅助激光解吸电离-飞行时间-质谱法(MALDI-TOF-MS)，获得单一分子量，为5023.76道尔顿，表明已经纯化成功。

紧接着再将纯化得到的活性样品送公司用Edman降解法进行N端测序(model 491，ABI，USA)。测序获得了N端的17个氨基酸序列为MTPNWRGLDLKTYGALF。

实施例5：太湖白鱼头肾cDNA文库的构建

将所用器具均0.1％(v/v)DEPC水浸泡过夜，121℃高温灭菌30min，进行RNase灭活处理。采集活体太湖白鱼的头肾，投入液氮中备用。按照RNeasy Protect Mini Kit(QIAGEN)使用说明书提取总RNA，并进行mRNA的纯化。

用Clontech公司SMARTTM cDNA Library Construction Kit进行cDNA第一链(mRNA反转录)和第二链的合成。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。第一链合成利用试剂盒提供的CDSIII/3’Primer：5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCC GACATG(30)N-1N-3’(N＝A,C,Gor T；N-1＝A,G or C)和SMART IV oligonucleotide：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3’。第二链合成利用CDSⅢ/3’Primer和5’-primer：5’-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGT-3’。第一链合成所用逆转录酶和第二链合成所用高保真聚合酶均为试剂盒提供。

通过cDNA文库构建，本发明获得了约2.8×10⁶个独立克隆的太湖白鱼头肾cDNA文库。

实施例6：全长cDNA克隆

根据Edman降解法测得的N端氨基酸序列，设计简并引物R1(反向引物)，与建库引物5’-PCR primer(S1，正向引物)进行扩增并测序。根据测序结果设计克隆全长cDNA的引物R2(正向引物)，与建库引物3’PCR primer(S2，反向引物)进行扩增得到。PCR程序为95℃、4min，接着95℃、30s，56℃、30s，72℃、40s，进行28个循环，最后72℃延伸10分钟。PCR产物用Applied Biosystems DNA测序仪测序(model ABI PRISM 377)。

结果如图4表示，测序后，获得了编码基因，编码区域由132个碱基组成，编码的多肽序列由43个氨基酸组成。经BLAST比对分析发现，纯化得到的该分子为抗菌肽hepcidin家族的成员，具有四个高度保守的半胱氨酸(粗体，方框，图4)，这四个半胱氨酸分别形成Cys1-Cys3、Cys2-Cys4两对二硫键。本发明中，将其命名为hepcidin-EI。

实施例7：最小抑菌浓度确定

采用二倍稀释法，检测了hepcidin-EI对温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌的最小抑菌浓度。首先将这四株水产养殖病原菌接种于营养肉汤固体培养基上，37℃培养箱中倒置培养。待菌落长出后，用接种环挑取单菌落转接到营养肉汤液体培养基中，37℃培养箱震荡培养至对数生长期。在紫外分光光度计上检测菌液OD600，根据1OD600＝1×10⁹CFU/mL将菌液用营养肉汤液体培养基稀释至2×10⁵CFU/mL。然后在无菌96孔板各孔中预先加入100μl营养肉汤液体培养基，然后在第一孔中加入100μl稀释到一定浓度的经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的抗菌肽样品，混匀后取100μl加入第2孔，依次倍比稀释，从第12孔吸出100μl弃去，至此二倍浓度梯度样品即制备好。向各孔中加入已稀释好的菌液100μl，混匀后于37℃缓慢震荡培养16h，测定600nm处的光吸收值。结果计算：取检测不到细菌生长的孔和与之相邻的有细菌生长的孔样品浓度之和的平均值作为样品最小抑菌浓度。实验中用氨苄青霉素作为阳性对照。

结果如表1所示，hepcidin-E1对受测的四株菌株的最小抑菌浓度为4.69-37.5μg/mL。其中，温和气单胞菌和嗜水气单胞菌对氨苄青霉素在高达200μg/mL仍然没有检测到抗菌活性，而hepcidin-EI对这两株菌的最小抑菌浓度分别为37.5μg/mL和4.69μg/mL。表明hepcidin-EI不仅对抗生素敏感的水产养殖病原菌具有抑制作用，同时对抗生素耐药的水产养殖病原菌也具有抑制作用。

表1太湖白鱼hepcidin-EI对不同水产菌株的最小抑菌浓度

^a最小抑菌浓度为三次独立实验结果，重复性一致

实施例8：hepcidin-EI的诱导表达分析

为了进一步探索hepcidin-EI在太湖白鱼体内是否具有抗感染的功能，采用副溶血弧菌去感染太湖白鱼，然后分析hepcidin-EI在太湖白鱼头肾中的诱导表达情况。将副溶血弧菌用营养肉汤液体培养基稀释后，经腹腔注射200μL，对照组腹腔注射200μL的营养肉汤培养基。分别在感染3、6、12、24、48小时后，取出太湖白鱼的头肾，加液氮将心肌组织研磨成粉末，按氯仿法抽提总RNA，以PrimeScript逆转录酶合成cDNA。用SYBR Green做实时荧光定量PCR，检测免疫分子在头肾中的表达情况。正向引物为5’-ATGACACCAAATTGGAGGGGAT-3’，反向引物为5’-ACCTGTATAGAGGTCCGATTCGC-3’。

结果如图5所示，与对照组相比，在检测的几个时间点中，hepcidin-EI在感染后的太湖白鱼头肾中均显著上调表达，其中在感染后第12小时，hepcidin-EI的上调表达达到高峰，约为对照组的55倍。结果表明，hepcidin-EI在水水产养殖病原菌感染后的太湖白鱼头肾中显著上调表达，提示上调表达的hepcidin-EI在体内可能起到了抵抗水产养殖病原菌感染的功能。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 一种太湖白鱼宿主防御肽及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 43

<212> PRT

<213> （人工序列）

<400> 1

Met Thr Pro Asn Trp Arg Gly Leu Asp Leu Lys Thr Tyr Gly Ala Leu

1 5 1015

Phe Cys Trp Thr Val Tyr Glu Cys Ser Ala Ile Val Cys Ser Thr Arg

202530

Leu Cys Arg Leu Arg Ile Gly Pro Leu Tyr Arg

3540

<210> 2

<211> 132

<212> DNA

<213> （人工序列）

<400> 2

atgacaccaa attggagggg attggacctc aagacttacg gagctctgtt ctgctggacc 60

gtgtacgagt gtagcgctat cgtgtgctcc acaaggctgt gcaggctgcg aatcggacct 120

ctatacaggt ga 132