一种基于免标记荧光增强的适配体DNA银纳米簇测定铅离子的方法

摘要

本发明属分析化学技术领域，为解决荧光猝灭型检测铅离子的方法对错误信号敏感、背景变化较大、信号变化有限等缺点，提供一种基于免标记荧光增强的适配体DNA银纳米簇测定铅离子的方法。将DNA‑Ag NCs模板与标准浓度铅离子溶液混合于缓冲液中加热，加AgNO

说明书

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种基于免标记荧光增强的适配体DNA银纳米簇测定铅离子的方法。

背景技术

铅离子是有剧毒的重金属离子，对人体危害非常严重，其主要毒性效应是导致贫血、神经机能失调、肾、肝、生殖系统损伤等，使婴幼儿生长发育迟缓。传统的铅离子检测技术，包括原子吸收/发射光谱、电感耦合等离子体质谱、原子荧光光谱、电化学方法和气相色谱法等，虽准确可靠但需要昂贵复杂的仪器设备以及专业技术人员，费时费力，不利于现场快速分析检测。因此构建一种简便、快速、低成本、高灵敏度、高选择性、实时原位检测的铅离子检测方法对人类健康和环境监测具有重要的现实意义。当今，利用有机荧光染料、寡核苷酸或核酸酶的比色、荧光和电化学方法来检测铅离子得到人们的重视，其中利用功能核酸检测铅离子的方法由于灵敏度高、选择性好倍受青睐。用于检测铅离子的适配体是富含鸟嘌呤(G)的单链寡核苷酸，铅离子可以促进寡核苷酸形成G-四链体结构，根据G-四链体的相关特征选择合适的信号输出来检测铅离子。

贵金属纳米簇含有几个到约一百个原子，由于其独特的物理、光学和电学性质,被广泛地用于催化、生物医学、成像、传感以及光电设备等领域。其中DNA模板稳定的银纳米簇（简称DNA-Ag NCs）具有可优化的链长和序列、强的荧光发射、较低的毒性、较好的生物相容性，受到广泛的关注。因此可以利用功能核酸形成G-四链体结构与DNA-Ag NCs相结合实现铅离子的检测。

文献《DNA/银纳米簇荧光探针在检测Pb²⁺>2+>2+>诱导下形成G-四链体结构，破坏了发夹型DNA的构型，极大地影响了合成银纳米簇的模板结构，导致银纳米簇的荧光强度降低，根据此原理可实现的Pb^{2+>检测。但这种检测方法属于荧光猝灭型，荧光猝灭型探针有对错误信号比较敏感、背景变化较大、信号变化有限等缺点，从分析检测的角度考虑，这种方法是不受欢迎的。}

发明内容

本发明为了解决目前利用荧光银纳米簇检测铅离子的荧光猝灭型方法对错误信号比较敏感、背景变化较大、信号变化有限等缺点，提供了一种基于免标记荧光增强的适配体DNA银纳米簇测定铅离子的方法。旨在利用铅离子特异性识别的适配体为识别元件，DNA-Ag NCs为信号报告分子，建立一种免标记荧光增强型的铅离子检测方法。

本发明所采取的技术方案是：一种基于免标记荧光增强的适配体DNA银纳米簇测定铅离子的方法，以铅离子适配体的DNA-Ag NCs模板为识别原件，将铅离子适配体的DNA-Ag NCs模板与标准浓度的铅离子溶液混合于Tris-acetate缓冲液中加热反应，随后加入AgNO₃溶液混匀避光反应，再加入NaBH_{4>溶液避光反应，室温下测定反应所获得的溶液中标准浓度的铅离子溶液的荧光值获得标准曲线；将标准浓度的铅离子溶液用待测样品替换进行反应，并测定荧光值，结合标准曲线获得待测样品铅离子浓度。}

所述DNA-Ag NCs 模板的序列为5´-ctcctcctaccctttgtgggtagggcgggttggaaactcctcctaccc-3´，由48个碱基组成，其中两端为银纳米簇成核富C序列，中间为铅离子适配体富G序列部分，即铅离子特异性识别的寡核苷酸，划线部分ttt和aaa为成核富C序列和适配体富G序列的连接部分。

具体步骤如下：

（1）标准浓度铅离子溶液与DNA-Ag NCs 模板混合：将DNA-Ag NCs 模板和标准浓度的Pb^{2+>溶液在5mM，pH为7.0的Tris-acetate 缓冲液中混合，85℃加热15min，自然冷却到4℃，其中DNA-Ag NCs 模板和Pb2+>溶液的浓度分别为0.3μM和0-500nM；}

（2）加入AgNO₃进行反应：在步骤（1）所获得的溶液中加入AgNO₃溶液混匀，在4℃下避光反应20min，然后加入新制的NaBH₄溶液充分搅拌1min，在4℃下避光反应1h获得DNA-AgNCs；其中DNA-Ag>3、NaBH₄的最终浓度比为1:6:6；

（3）绘制标准曲线：室温下测定步骤（2）所制备的加入相应标准浓度铅离子溶液的荧光值，根据荧光值与浓度的对应关系绘制标准曲线；

（4）待测样品的检测：将标准浓度的铅离子溶液用待测样品替换，按照步骤（1）和（2）进行反应，制备含待测铅离子的DNA-Ag NCs并测定其荧光值，结合标准曲线计算得到待测样品铅离子浓度。

步骤（2）所制备的DNA-Ag NCs的平均粒径约为1nm。

本发明通过设计DNA-Ag NCs模板，以DNA-Ag NCs为信号报告分子，可实现铅离子免标记检测，属于荧光增强型探针。

DNA-Ag NCs模板，也称DNA寡核苷酸，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列为：5´-ctcctcctaccctttgtgggtagggcgggttggaaactcctcctaccc-3´，由48个碱基组成，其中两端为银纳米簇成核富C序列（粗体字部分），中间为铅离子适配体富G序列部分（斜体字部分），即铅离子（Pb²⁺）特异性识别的寡核苷酸，划线部分TTT和AAA为成核富C序列和适配体富G序列的连接部分。AgNO₃溶液中的Ag⁺和富C序列中的C碱基结合。NaBH₄将和C碱基结合的Ag⁺还原为Ag。

本发明的检测原理如图1所示：DNA-Ag NCs模板包括位于两端的银纳米簇成核富C序列和中间的铅离子富G适配体两部分，当加入Pb^{2+>时，由于Pb2+>对富G适配体具有很高的选择性和结合力，促使其形成G-四链体结构，并使两端暗的DNA-Ag NCs 相互靠近，导致DNA-Ag NCs 的荧光显著增强，这样实现对Pb2+>的高灵敏和选择性检测。图2和图3为DNA-AgNCs的荧光强度与铅离子浓度的关系图。由图2可知，本发明方法对于铅离子有很好的荧光响应。由图3中的插图可见，DNA-Ag NCs的荧光强度在铅离子的浓度为5-50 nM有很好的线性关系。由图4可知，DNA-Ag NCs 的平均粒径约为1 nm。}

本发明以铅离子特异性识别的适配体为识别元件，通过设计DNA-Ag NCs 模板，以DNA-Ag NCs为信号报告分子，可实现铅离子免标记检测，属于荧光增强型探针。在线性范围为5-50 nM，铅离子的最低检测限为3.0 nM，低于美国环境保护署规定饮用水中铅离子的最大允许量不得超过70nM。另外本发明还具有成本低廉、操作简单、灵敏度高、选择性强、毒性小、生物相容性好、免标记等特征，本发明所述的检测方法对环境或食品中铅离子的快速检测具有重要意义。

附图说明

图1为本发明所述的Pb^{2+>检测方法原理图。图2为加入不同浓度的Pb2+，DNA-Ag>2+>浓度的变化关系图，插图为DNA-Ag>2+>浓度为5-50>2+>DNA-Ag>2+}和1.0μM其他金属离子DNA-Ag>F₀和F分别为未加和加入金属离子的DNA-Ag>

具体实施方式

实施例1：一种基于免标记荧光增强的适配体DNA银纳米簇测定铅离子的方法，以铅离子适配体的DNA-Ag NCs模板为识别原件，将铅离子适配体的DNA-Ag NCs模板与标准浓度的铅离子溶液混合于Tris-acetate缓冲液中加热反应，随后加入AgNO₃溶液混匀避光反应，再加入NaBH_{4>溶液避光反应，室温下测定反应所获得的溶液中标准浓度的铅离子溶液的荧光值获得标准曲线；将标准浓度的铅离子溶液用待测样品替换进行反应，并测定荧光值，结合标准曲线获得待测样品铅离子浓度。}

所述DNA-Ag NCs 模板的序列为5´-ctcctcctaccctttgtgggtagggcgggttggaaactcctcctaccc-3´，由48个碱基组成，其中两端为银纳米簇成核富C序列，中间为铅离子适配体富G序列部分，即铅离子特异性识别的寡核苷酸，划线部分ttt和aaa为成核富C序列和适配体富G序列的连接部分。

具体步骤如下：

（1）标准浓度铅离子溶液与DNA-Ag NCs 模板混合：将DNA-Ag NCs 模板和标准浓度的Pb^{2+>溶液在5mM，pH为7.0的Tris-acetate 缓冲液中混合，85℃加热15min，自然冷却到4℃，其中DNA-Ag NCs 模板和Pb2+>溶液的浓度分别为0.3μM和0-500nM；}

（2）加入AgNO₃进行反应：在步骤（1）所获得的溶液中加入AgNO₃溶液混匀，在4℃下避光反应20min，然后加入新制的NaBH₄溶液充分搅拌1min，在4℃下避光反应1h获得DNA-AgNCs；其中DNA-Ag>3、NaBH₄的最终浓度比为1:6:6；

（3）绘制标准曲线：室温下测定步骤（2）所制备的加入相应标准浓度铅离子溶液的荧光值，根据荧光值与浓度的对应关系绘制标准曲线；

（4）待测样品的检测：将标准浓度的铅离子溶液用待测样品替换，按照步骤（1）和（2）进行反应，制备含待测铅离子的DNA-Ag NCs并测定其荧光值，结合标准曲线计算得到待测样品铅离子浓度。

步骤（2）所制备的DNA-Ag NCs的平均粒径约为1nm。

实施例2：利用免标记荧光增强的适配体DNA银纳米簇测定蒸馏水中铅离子的步骤如下：

将待测样品液蒸馏水中加入不同浓度的标准Pb^{2+>的溶液，标准曲线的绘制方法同实施例1所述方法，待测样品所制备的溶液按照步骤（1）和（2）进行反应，制备含待测铅离子的DNA-Ag NCs并测定其荧光值，结合标准曲线计算得到待测样品铅离子浓度。}

实施例2：利用免标记荧光增强的适配体DNA银纳米簇测定自来水中铅离子的步骤如下：

待测自来水样品液取样于山西大学，将待测样品液中加入不同浓度的标准Pb^{2+>的溶液，标准曲线的绘制方法同实施例1所述方法，待测样品所制备的溶液按照步骤（1）和（2）进行反应，制备含待测铅离子的DNA-Ag NCs并测定其荧光值，结合标准曲线计算得到待测样品铅离子浓度。}

实施例3：利用免标记荧光增强的适配体DNA银纳米簇测定湖水中铅离子的步骤如下：

待测湖水样品液取样于山西大学，将待测样品液中加入不同浓度的标准Pb^{2+>的溶液，标准曲线的绘制方法同实施例1所述方法，待测样品所制备的溶液按照步骤（1）和（2）进行反应，制备含待测铅离子的DNA-Ag NCs并测定其荧光值，结合标准曲线计算得到待测样品铅离子浓度。}

表1为利用本发明方法和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)检测加入自来水和湖水中不同浓度的标准Pb^{2+>溶液的测定值以及回收率。表1中的数据表明，用本发明方法测得的实际水样中铅离子的浓度和用ICP-MS方法测得的相差不大。}

表1利用本发明方法和电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)检测加入自来水和湖水中不同浓度的标准Pb^{2+>溶液 (N>}

表中：a为三次测量的平均值；b为标准偏差。

实验例1：选择性的检测：为考察基于免标记荧光增强的适配体DNA银纳米簇测定铅离子方法的选择性，按如下步骤进行了对比实验：

（1）将DNA寡核苷酸(0.3 μM)和含有Na⁺,>+,>2+,>3+,>2+,>2+,>2+,>2+,>2⁺,>2+,>3+,>3+,>2+>2+>(0.1>tttgtgggtagggcgggttggaaactcctcctaccc-3´；

（2）在步骤（1）所获得的溶液中加入AgNO₃溶液混匀，在4℃下避光反应20分钟，然后加入新制的NaBH₄溶液充分搅拌1分钟，在4℃下避光反应1小时；DNA、AgNO_3、NaBH_{4>的最终浓度比为1:6:6；}

（3）在室温下测定（2）所制备的加入不同离子的各种样品溶液的荧光值。

图5为铅离子选择性检测的关系图。由图5可知，加入Na⁺,>+,>2+,>3+,>2+,Cu²⁺,>2+,>2+,>2+,>2+,>3+,>3+,>2+>