克拉霉素在制备抗类过敏反应药物中的应用

摘要

克拉霉素在制备抗类过敏反应药物中的应用，药物为片剂、缓释剂、注射剂或喷雾剂型。克拉霉素具有拮抗由substance P引起的人源肥大细胞释放β‑氨基己糖苷酶的作用。同时，克拉霉素具有降低substance P引起的小鼠血清组胺的升高的作用。克拉霉素具有副作用少、吸收好、稳定性强等特点，并且能够有效抑制substance P激活MRGPRX2受体引起的肥大细胞脱颗粒反应，在细胞水平和动物水平上减少肥大细胞释放组织胺，适用于治疗疗程较长的疾病。此外，在理论和临床治疗中均为发现其具有拮抗类过敏反应的活性，其具有潜在治疗免疫性疾病的开发价值。

说明书

技术领域

本发明属于抗生素类药物领域，涉及克拉霉素在制备抗类过敏反应药物中的应用

背景技术

克拉霉素(Clarithromycin)是第二代大环内酯类抗生素中最受青睐和最有前途的一个品种，其化学名为6-O-甲基红霉素A，是由日本的大正公司开发研制的14元环红霉素衍生物，结构如下所示。克拉霉素结构与红霉素相似，但由于其6-位羟基被甲基取代，阻断了内酯环6-9和9-12的重排，使克拉霉素克服了红霉素在酸性环境下大环分子发生螺环缩酮改变而失去抗菌活性的缺点，降低胃肠道的不良反应。克拉霉素还具有组织穿透力强，抗菌谱广和半衰期长的优点，结构是如下式：

克拉霉素作用于细菌50S核糖体亚基,通过阻断转肽作用和mRNA位移而抑制细菌蛋白质合成。具有高效、口服易于吸收，对酸稳定性好的特点，该药对革兰阳性菌的活性强，对酶稳定，在血清和肺组织中浓度高。其抗菌活性与红霉素相似，对化脓性链球菌、肺炎双球菌、金葡菌、军团菌、衣原体、梅毒螺旋体、脑炎弓形体、表皮葡萄球菌、阴道厌氧菌及肺炎支原体等有作用。由于其具有广谱高效抗菌活性，并具有半衰期长、吸收效果好、血药浓度高及维持时间长、对胃肠刺激性小等优点，而被广泛应用于敏感菌引起的支气管炎、肺炎、扁桃体炎、五官科感染、泌尿系统感染、皮肤和软组织感染。该药也是治疗艾滋病患者感染的首选药物。

克拉霉素口服吸收较红霉素好，生物利用度为55％。单次口服250和500mg后,2-3h达血药峰浓度,分别为0.78和2.12mg/L。口服500mg克拉霉素，其活性代谢产物14-羟基克拉霉素的峰浓度为0.65mg/L。克拉霉素和14-羟基克拉霉素的t1/2分别为2.7和4.9h。口服5剂克拉霉素后,血药达稳态浓度。口服克拉霉素250mg,每日2次,连续10d,体内无明显药物蓄积,此时血药峰浓度维持在最初水平(1mg/L)。给健康受试者口服克拉霉素250和500mg，测定服药第1天和第5天的药物动力学参数显示,克拉霉素血药峰浓度与剂量的变化非线性相关。通常认为进食对克拉霉素的生物利用度无明显影响，但也有报道在胃内存在食物时生物利用度升高。与利福布汀同时服用,克拉霉素水平略有降低，这是由于肝酶的诱导作用所致。此种效应在克拉霉素与利福平同时服用时更为明显。

克拉霉素在组织和体液中分布良好。口服250mg，每天2次，4h在组织中达峰浓度,鼻粘膜和扁桃体组织中的药物浓度分别为8.32和6.47mg/kg。患者口服500mg,连用5剂后，在切除肺组织中克拉霉素和14-羟基克拉霉素的含量分别为54.3和5.12mg/kg。在唾液、痰、中耳分泌物和前列腺组织等中的克拉霉素浓度超过其血药浓度。

健康成年受试者口服克拉霉素250和500mg，表观分布容积(Vd)分别为226和256L。这一指标显示克拉霉素可在含病原体的感染病灶、巨噬细胞和多形核白细胞内达到高浓度,在多形核白细胞和巨噬细胞内的药浓度与血药峰浓度的比值为别为20-38和>100。42％-70％克拉霉素与血清蛋白结合。克拉霉素几乎不能通过血脑屏障,脑脊液中的药物峰浓度不超过血药峰浓度的1％。

小儿口服克拉霉素混悬剂吸收良好，3h达血药峰浓度(4mg/L)。与成人一样，小儿多次用药，体内无药物蓄积，进食不影响其吸收。小儿口服克拉霉素混悬剂7.5mg/kg，每天2次(共5次)，中耳分泌物中克拉霉素和14-羟基克拉霉素的浓度分别为2.5和1.3mg/L，显著超过其血药浓度(分别为1.7和0.8mg/L)。

42％-70％克拉霉素与血清蛋白结合。克拉霉素几乎不能通过血脑屏障,脑脊液中的药物峰浓度不超过血药峰浓度的1％。

部分克拉霉素在肝脏通过微粒体酶的氧化和水解作用而代谢。其主要代谢产物14-羟基克拉霉素约占全部代谢产物的20％,其它5种代谢产物占60％。原型克拉霉素自尿和粪排泄，分别为15％-18％和2％-4％。

只有在肾排泄功能严重障碍(肌酸酐清除率小于30ml/min)时,克拉霉素的排泄才发生障碍,伴随t1/2延长、AUC和Cmax值升高,对此种患者可通过延长给药间隔时间的方式调整克拉霉素的用法。

克拉霉素在临床的适应症主要包括：咽炎和扁桃体炎、上颌窦炎、下呼吸道感染、分枝杆菌病、弓形体病、螺杆菌病、其它感染性疾病。

克拉霉素的毒性低，机体对其耐受性良好。食欲减退、恶心、呕吐和腹泻等胃肠道反应的发生率为10.6％，主要发生于长期大剂量(2g/d)时，较用红霉素和罗红霉素等的发生率低。将治疗剂量降至250-500m，每天2次，上述症状即可消失,勿需补充治疗。个别患者可出现头痛、耳鸣等神经系统症状以及皮疹、皮肤瘙痒等过敏反应。长期应用克拉霉素可能发生血清转氨酶一过性升高和肠菌群失调(革兰氏阳性球菌和肠杆菌属细菌的菌株数降低)。伪膜性肠炎、胆汁淤积性肝炎、血小板减少性紫癜等极其少见。

发明内容

本发明的目的在于提供一种克拉霉素在制备抗类过敏反应药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

克拉霉素在制备抗类过敏反应药物中的应用。

本发明进一步的改进在于，药物为片剂、缓释剂、注射剂或喷雾剂型。

本发明进一步的改进在于，克拉霉素具有拮抗由substance P引起的人源肥大细胞释放β-氨基己糖苷酶的作用。

本发明进一步的改进在于，克拉霉素具有降低substance P引起的小鼠血清组胺的升高的作用。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果：克拉霉素具有副作用少、吸收好、稳定性强等特点，并且能够有效抑制substanceP激活MRGPRX2受体引起的肥大细胞脱颗粒反应，在细胞水平和动物水平上减少肥大细胞释放组织胺，适用于治疗疗程较长的疾病。此外，在理论和临床治疗中均为发现其具有拮抗类过敏反应的活性，其具有潜在治疗免疫性疾病的开发价值。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

克拉霉素对substance P引起的人源肥大细胞β-氨基己糖苷酶释放和小鼠血清组胺升高具有明显的拮抗作用。

实施例1

(1)拮抗substance P引起的人源肥大细胞β-氨基己糖苷酶释放

1)试剂

0.1％Triton X-100裂解液：将10μL Triton X-100溶解于10mL PBS中，得到0.1％Triton X-100裂解液。

0.1mol/L柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液(pH4.5)：称取2.101g一水合柠檬酸，溶解于100mL三蒸水内，得到0.1mol/L的柠檬酸溶液，4℃下避光保存。称取2.941g柠檬酸钠，溶解于100mL三蒸水内，得到0.1mol/L的柠檬酸钠溶液，4℃下避光保存。临用前，按0.1mol/L柠檬酸：0.1mol/L柠檬酸钠＝10.4：9.6(v/v)的比例混合，得到0.1mol/L柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液。

1mmol/Lβ-氨基己糖溶液：称取0.034g的β-氨基己糖溶解于100mL 0.1mol/L柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液中，得到1mmol/Lβ-氨基己糖溶液。

0.1mol/L>2CO₃/NaHCO₃终止液(pH>2CO₃，溶解于100mL三蒸水内，得到0.1mol/L的Na₂CO₃溶液，4℃下避光保存。称取0.84g>3，溶解于40mL三蒸水内，得到0.1mol/L的NaHCO₃溶液。临用前，按0.1mol/L>2CO₃：0.1mol/L>3＝9：1(v/v)的比例混合，得到0.1mol/L>2CO₃/NaHCO₃终止液。

TM缓冲盐溶液(TM-buffer)：称取6.954g NaCl、0.353g KCl、0.282g CaCl₂、0.143g>4、0.162g>2PO₄、2.383g>

2)实验步骤

将细胞悬液稀释为终浓度为1×10⁶个细胞/mL，每孔100μL接种于96孔板(使每孔最终的细胞量为1×10⁵个细胞)。将96孔板置于CO₂培养箱中，培养过夜。

次日，离心后，每孔吸弃原培养基，细胞根据不同的分组，分别加入不同的试剂：

阴性对照组(control)：加入50μL TM缓冲溶液；

实验细胞组：加入含有克拉霉素的50μL TM缓冲溶液，克拉霉素的终浓度设置不同的梯度；

空白细胞组(Blank)：加入50μL TM缓冲溶液；

培养箱中孵育30min。

30分钟后，对于阴性组和给药组细胞，加入含有终浓度为8μg/mL阳性药物substance P的50μL TM缓冲溶液，对于空白组，加入50μL TM缓冲溶液。37℃下培养30min后，4℃下1500rpm离心10min，得到相应细胞培养基上清；吸净空白细胞组未给药空白细胞的培养基上清，再用0.1％Triton X-100裂解空白细胞组空白组细胞5min，冰上终止10min，将裂解液吹打均匀，在4℃下1000rpm离心10min，得到空白细胞组空白组细胞裂解液。

将阴性对照组给药组细胞培养基上清、实验细胞组细胞培养基上清、空白细胞组空白组细胞培养基上清及空白细胞组空白组细胞裂解液各50μL分别加入空白96孔板，每孔加入底物1mmol/L的β-氨基己糖50μL，置于37℃培养箱内孵育90min，孵育完成后，每孔加入150μL 0.1mol/L>2CO₃/NaHCO₃终止液终止反应。将96孔板置于室温摇床上摇晃混匀2min，在酶标仪上405nm下检测各待测量样品的吸光度值(OD)。

β-氨基己糖苷酶释放率(％)＝待测量样品的吸光度(OD)/(空白细胞组细胞培养基上清吸光度(OD空白胞外)+空白细胞组细胞裂解液吸光度(OD空白胞内))×100％；其中，所述待测量样品为阳性对照组细胞培养基上清、实验细胞组细胞培养基上清、空白细胞组细胞培养基上清和空白细胞组细胞裂解液。

实验结果展示在表1中，其中，control为阴性对照组，为致敏组分引起的β-氨基己糖苷酶释放率；不同的浓度表示不同的实验细胞组，其中浓度为克拉霉素浓度，为在致敏组分存在下，β-氨基己糖苷酶释放率；Blank为空白细胞组，为不受致敏组分刺激时的β-氨基己糖苷酶释放率。

表1克拉霉素拮抗substance P引起的人源肥大细胞β-氨基己糖苷酶的释放

从表1可以看出，实验结果表明，克拉霉素能够显著拮抗由substance P引起的人源肥大细胞释放β-氨基己糖苷酶，在较低剂量就具有拮抗效果，并且这种拮抗作用与用药剂量呈正相关。

实施例2

1)试剂

0.5％CMC-Na溶液的配制，0.5g CMC-Na加入100mL生理盐水中，超声溶解，配制得到0.5％CMC-Na溶液。60μg/mL substance P溶液的配制，称取6mg substance P粉末，加入0.1mL生理盐水，超声溶解后利用生理盐水稀释100倍，得到60μg/mL substance P溶液。

2)实验步骤

利用0.5％CMC-Na溶液配制相应浓度的克拉霉素混悬液。

7-8周C57BL/6小鼠50只被随机分为5组，分别为3种不同浓度给药组、阴性对照组和空白对照组，每组10只。

灌胃给药，3种不同浓度给药组分别给予8.125、16.25和32.5mg/kg的克拉霉素混悬液；阴性对照组和空白对照组灌胃0.5％CMC-Na溶液0.2mL。

一小时后，通过尾静脉注射的方式，分别对3种不同浓度给药组、阴性对照组小鼠注射0.2mL 60μg/mL substance P溶液，空白对照组注射0.2mL生理盐水后放回鼠笼中。

一小时后通过眼球取血的方式将小鼠全血取至EDTA抗凝的一次性采血管中，后转移至1.5mL EP管。4℃条件下5000rmp离心10min。得到小鼠血清。

分别取50μL小鼠血清至1.5mL EP管中，每管加入5ng/ml氘代组胺(乙腈配制)100μL作为内标。混合溶液涡旋振荡后，4℃下12000g离心20min，取上清，UHPLC‐ESI‐MS/MS测定。基本色谱条件为：色谱柱为HILIC柱(Venusil HILIC，2.1×150mm，3μm)，流动相为含有0.1％甲酸和20mM甲酸铵的水溶液和乙腈(V/V＝20:80)，流速为0.3mL/min。

结果如表2所示，克拉霉素能够显著降低substance P引起的小鼠血清组胺的升高，并且这种作用与剂量呈正相关。对小鼠类过敏反应有一定的拮抗作用。

表2克拉霉素拮抗substance P引起的小鼠血清组胺的升高

本发明涉及克拉霉素具有拮抗和治疗过敏反应的药物化合物的新应用。本发明同时公开了克拉霉素作为类过敏反应拮抗剂和治疗药物的相关活性。以及其在药学上可接受的片剂、缓释剂、注射剂等剂型。