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无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa及其制备方法

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本发明公开了无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa，它是生物安全外源蛋白表达系统，以

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公开/公告号CN108410900A

专利类型发明专利
公开/公告日2018-08-17

原文格式PDF
申请/专利权人吉林农业大学;
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申请/专利号CN201810148983.1
发明设计人王春凤;刘琼;姜延龙;刘永仕;杨桂连;刘晶;
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申请日2018-02-13
分类号
代理机构长春市东师专利事务所;
代理人张铁生
地址 130118 吉林省长春市净月开发区新城大街2888号
入库时间 2023-06-19 06:13:14

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2020-07-14

授权

授权
2018-09-11

实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/74 申请日:20180213

实质审查的生效
2018-08-17

公开

公开

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa及其制备方法。

背景技术

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，L. plantarum）作为一种肠道宿主菌株可耐受胃内低pH值、高盐的环境，最适生长温度为30-37℃，能耐受10℃左右的低温，但在45℃以上的环境中出现生长抑制，常见于奶油、肉类、蔬菜等制成的发酵食品并可从多数植物中分离得到，故因此得名。研究表明，植物乳杆菌符合美国食品与药品管理局（FDA）的GRAS（Generally Recognized as Safe）规定以及欧洲食品安全局（EFSA）的安全资格认证（Qualified Presumption of Safety）标准，通常定殖于人和动物的消化道中并发挥益生作用，利用该菌株制成的微生态制剂能够增强机体免疫力，可有效防止一些胃肠道疾病的发生。同时，该菌株也是良好的外源蛋白表达系统，以其作为口服药用蛋白载体很大程度上解决了蛋白易在消化道中发生水解的问题，从而使多种口服药用蛋白都能有效地发挥防治疾病的作用。

pSIP409系列质粒是植物乳杆菌特有的穿梭质粒载体，由于它具备pUC来源于大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）和256rep来源于植物乳杆菌两个复制子，因此它可以在大肠杆菌中复制并在植物乳杆菌中进行外源蛋白的表达。但该系列质粒载体使用了红霉素抗性基因(erythromycin，EM)作为筛选标记，一旦抗性基因转移到宿主染色体内，很可能产生严重的生物安全隐患，因此该系统潜在的应用价值受到了限制。另外，Nguyen等认为红霉素在酸性条件下会发生降解，这对外源基因的诱导表达造成了不利的影响。红霉素也会使菌体产生“生理应激”，从而影响目的基因表达。所以我们要用非抗生素筛选标记代替该载体的抗生素抗性基因并使改建后载体能在受体菌植物乳杆菌NC8/Δalr（L. plantarumNC8/Δalr）中稳定复制表达外源蛋白，从而使我们的乳酸菌制品达到对机体无害要求。

丙氨酸消旋酶（Alanine Racemase，alr）基因广泛存在于原核生物基因组中，该基因可将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸，D-丙氨酸是细胞壁中重要的交联成分，是菌株生长的必需物质，因此该酶对原核细胞的生长至关重要。虽然绝大多数微生物都含有两种丙氨酸消旋酶基因：生物合成型（Biosynthetic Alanine Racemase，alr)和代谢型（CatabolicAlanine Racemase，dadx/B），但对于乳酸乳球菌和乳酸杆菌来说，丙氨酸消旋酶由单一alr基因所编码，alr基因缺失株在普通MRS培养基中不生长，只有在额外添加D-丙氨酸的培养基中生长。在选择压力下，带有alr标记的质粒具有较高的稳定性，并且在绝大多数发酵培养基中不会出现D-丙氨酸。

大肠杆菌asd基因编码天冬氨酸β-半醛脱氢酶，是二氨基庚二酸(DAP)合成途径中的关键酶，DAP是革兰氏阴性菌细胞壁上肽聚糖的基本成分，asd基因发生缺失突变后，由于不能合成细胞壁而导致溶菌死亡。表层(Surface layers)或S-层蛋白(S-layerprotein)，由单一蛋白质或糖蛋白亚单位组成并有规则的排列在细胞膜或细胞壁外，是生物进化过程中最简单的一种生物膜。目前发现乳酸菌的许多种属都含有S-层蛋白，在43-46kDa之间，S-层蛋白表达量高，其启动子的转录效率高，信号肽引导的分泌效率高，被广泛应用于构建高效锚定达载体或分泌表达载。因此利用乳杆菌的S-层蛋白作为携带外源抗原的运载工具，构建出一个良好的乳酸菌锚定表达系统，将抗原定位表达于细胞表面，不仅可以使抗原直接暴露于黏膜，便于免疫辅助成分的参与，也能够减弱抗原的蛋白酶或胃酸降解，加之S-层蛋白的黏附特性及免疫佐剂功能，在利用乳酸菌表达载体构建口服疫苗时无需外加免疫佐剂就可诱发宿主产生免疫保护。

发明内容

本发明的目的是为解决植物乳杆菌细胞壁厚，外源质粒电转化素宿主菌及植物乳杆菌连接产物筛选阳性重组子困难的问题，而提供一种既能在E.coli 6212/Δalr中复制又能在L. plantarum NC8/Δalr中锚定表达的无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa。

无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa，它是用NdeI和HindⅢ双酶切pLP-1261Inv和SEQ ID NO.1所示的基因，将SEQ ID NO.1所示的基因插入pLP-1261 Inv，得载体pLPS，再用P23-alr-asd基因替换载体pLPS上红霉素（EM）基因；所述的P23-alr-asd基因，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa的制备方法，它包括：

1）含有sig_peptide信号肽、S-层蛋白C-末端锚定序列S_achoring基因S制备

参照NCBI发布的嗜酸乳杆菌SlpA基因序列，将sig_peptide信号肽序列、S-层蛋白C-末端锚定序列保留，将中间部分基因序列用Linker和多克隆酶切位点SalI、XbaI、XhoI、EcoRI、KpnI替换，Linker和多克隆酶切位点序列为GGCACGATTGCGGCG GTCGAC TCTAGA CTCGAGGAATTC GGTACC，人工合成SEQ ID NO.1所示的基因S；用NdeI和HindⅢ双酶切将SEQ IDNO.1所示的基因插入pLP-1261 Inv，载体命名为pLPS；

2）P23-alr-asd基因制备

参照PYA4545载体asd基因序列，NCBI公布的P23启动子和植物乳杆菌alr基因序列将asd基因，P23启动子和alr基因串联，获得P23-alr-asd基因并人工合成（大小3027bp），其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

3）用P23-alr-asd基因替换载体pLPS上红霉素（EM）基因获得无抗性筛选标记锚定表达载体pLPSa

用P23-alr-asd基因替换载体pLPS上红霉素基因，由于载体上没有合适的酶切位点线性化载体，所以采用PCR方法线性化载体和P23-alr-asd基因，参照pLPS基因序列设计引物，扩增去除红霉素基因的5050bp片段LPS，引物如下：

LPS F：TTCTATGAGTCGCTTTTTTAAATTTG

LPS R：GGATCCCGCACGCATAGCGGTGC

扩增P23-alr-asd基因的引物序列如下：

asd F：CGCTATGCGTGCGGGATCCTCTTCCCTAAATTTAAATATAAAC（下划线标注的是与pLPS载体上的同源手臂）

alr R：CAAATTTAAAAAAGCGACTCATAGAATTAATCTATATAAACTCTCG（与pLPS载体上的同源手臂）；

以合成的P23-alr-asd基因为模板扩增含有同源手臂的P23-alr-asd基因，将LPS与P23-alr-asd无缝克隆连接，电转化E.coli 6212/Δasd感受态细胞，铺普通LB固体培养基，利用asd基因与宿主菌实现营养互补筛选阳性克隆，测序鉴定正确的质粒命名为pLPSa，并将pLPSa其电转化至得L. plantarum NC8/Δalr，利用alr基因与L. plantarum NC8/Δalr营养互补筛选阳性克隆，构建出无抗性筛选标记锚定表达载体pLPSa。

发明详述：由于植物乳杆菌属于革兰氏阳性菌，细胞壁厚，外源质粒电转化素宿主菌有一定的难度，如果将连接产物直接电转化效率更低，很难筛选到阳性重组子，甚至筛选不出来重组子，笔者在利用植物乳杆菌作为宿主菌构建无抗性筛选表达载体遇到了同样问题，所以选用比较容易筛选阳性重组子的革兰氏阴性菌大肠杆菌asd 基因缺失株E.coli6212/Δasd作为中间宿主菌，将asd-alr基因串联替换植物乳杆菌诱导表达载体上红霉素标记基因，连接产物先电转化入asd 基因缺失株E.coli 6212/Δasd，利用质粒上的asd基因与宿主菌E.coli 6212/Δasd营养互补筛选阳性重组质粒，之后将阳性质粒再电转化至alr缺失L. plantarum NC8/Δalr，利用质粒上的alr基因与L. plantarum NC8/Δalr营养互补筛选阳性重组质粒，构建无抗性筛选锚定表达载体pLPSa实现了即能在E.coli 6212/Δalr中复制又能在L. plantarum NC8/Δalr中锚定表达，解决了植物乳杆菌连接产物筛选阳性重组子困难的问题，同时实现了无抗性筛选目的。

本发明提供了无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa，它是生物安全外源蛋白表达系统，以asd缺失株E.coli 6212/Δasd和alr缺失L. plantarum NC8/Δalr为宿主菌，将来源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp. cremoris strain JM4）基因组上P23启动子作为alr基因表达的启动子，以pYA4545，pLP-1261 Inv，pSIP409PgsA’-IL-10，pSIP409PgsA’-EGFP为基础载体，构建以表面蛋白（S_achoring）为锚定模型的营养互补筛选标记大肠杆菌-乳酸菌无抗锚定表达载体pLPSa，并以EGFP作为报告基因进行筛选及锚定表达验证。

附图说明

图1 质粒409eat和409eatf用PstI和SalI双酶切电泳图，M：DL5000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1-2：409eatf质粒酶切，载体片段长度4436bp和P23Alr tf长度1336bp；3-4：409eat质粒酶切，载体片段4436bp和P23Alr t长度1312bp；

图2 409eatf 电转 Lb.plantarumNC8/Δalr 1号和3号菌的Western blotting 结果,M:蛋白质分子量标准，从上到下分子量依次为：70kDa、50kDa、40kDa、20kDa；1：阴性对照Lb.plantarumNC8/Δalr ；2：Lb.plantarumNC8/Δalr 409eatf1；3：Lb.plantarumNC8/Δalr 409eatf3；4：阴性对照Lb.plantarumNC8/Δalr 上清；5：Lb.plantarumNC8/Δalr409eatf1上清；6：Lb.plantarumNC8/Δalr 409eatf3上清）；

图3 E.coli 6212/Δasd- 409ata菌落PCR鉴定结果，M：DL5000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1-8：E.coli 6212/Δasd- 409ata单菌落；9阴性对照；

图4 409ata质粒HindⅢ单酶切电泳图，M：DL5000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1：409ata质粒酶切，大片段长度4305bp和小片段长度2035bp；

图5 409ata电转Lb.plantarumNC8/Δalr 质粒小量制备结果，M：DL5000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1-4：Lb.plantarumNC8/Δalr-409ata 单菌1-4号；

图6 融合PCR产物EGFPS琼脂糖凝胶回收纯化及pLP-1261 Inv用NdeI和HindⅢ双酶切纯化电泳结果；M：DL5000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1：融合PCR产物EGFPS1298bp；2： pLP-1261 Inv用NdeI和HindⅢ双酶载体片段5577bp；

图7 红霉素筛选菌株L. plantarum NC8-pLPS-EGFP荧光显微镜观察；

图8 pLPSaT突变后载体用Sal I和HindⅢ双酶切鉴定结果，M：DL5000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp，其中750bp加亮；1：1122bp的EGFPS片段；2：pLPSaT用Sal I和HindⅢ双酶切出含有信号肽的载体片段7672bp；

图9 基因工程L. plantarum NC8/Δalr-pLPSaT锚定表达EGFP的Western Blot分析，M:蛋白质分子量标准，从上到下分子量依次为：70kDa、55kDa、40kDa；阴：阴性对照Lb.plantarumNC8/Δalr ；1： L. plantarum NC8/Δalr-pLPSaT表面蛋白提取EGFP加上S-achor分子量约46kDa；

图10 L. plantarum NC8/Δalr-pLPSaT锚定表达EGFP菌体自发荧光观察（100X10）；

图11 质粒pLPSa图谱；

图12 质粒pLPSa酶切验证电泳图 M：D10000DNA分子量标准，从上到下分子量依次为：10000bp、7000bp、4000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp，其中2000bp加亮；1：质粒pLPSa；2-6依次为载体pLPSa分别用SalI、XbalI、XhoI、EcoR I、KpnI单酶切。

具体实施方式

实施例1

alr-EM双标记载体409eatf内alr基因与宿主菌L. plantarumNC8/Δalr营养互补筛选验证

1、pSIP409PgsA’-IL-10双酶切

用SalI和PstI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收载体上含有红霉素和复制子的4436bp基因片段。

2、Alr t与alr tf基因扩增

提取L. plantarum NC8株基因组，以其为模板，设计引物，引物alr基因（碱基序列如SEQ ID NO.3所示）内含有SalI酶切位点，不便于载体构建，所以设计时将引物延长，这样即能将alr扩增出来，又能将其突变，将酶切位点中第一个C突变为G，扩增的基因命名alr t（1149bp）。为了检测alr 基因回归植物乳杆菌后表达情况，另外设计在alr 基因序列3’端添加了Flag标签引物，便于alr基因表达检测，扩增的基因命名为alr tf（1176bp）。

引物如下：

Alr t F：ATGGTTGTAATTGGGGAGCACCGCCACACACAAGTCACAGTGGACT（alr基因内含有SalI酶切位点，将C突变为G）

Alr t R：GATCATTTGGCGTGCCTGCAGTTAATCTATATAAACTCTCG（下划线标注为载体上的同源序列，斜体标注为PstI酶切位点）

Alr tf R：GATCATTTGGCGTGCCTGCAGTTATTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCATCTAT

ATAAACTCTCG（下划线标注为载体上的同源臂，斜体标注为PstI酶切位点，灰色标记为Flag标签）

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

3、乳酸乳球菌启动子P23与alr基因融合

1）启动子P23扩增

以合成的含P23启动子基因序列的pUC57-Pori23 FnBPA 为模板，扩增含有同源臂的启动子序列；P23启动子碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

P23F：GAATGGAGACCGGGGTCGACgaaaagccctgacaaccctc（下划线为与载体上SalI酶切位点上游同源序列，斜体标注为SalI酶切位点）

P23R：GTGGCGGTGCTCCCCAATTACAACCATAACATCATTGTCATTCAT（下划线部分为与alr t（alr tf）基因同源序列）

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

启动子P23分别与alr t、alr tf基因做SOE-PCR

使用引物P23F和Alr t R、Alr t f R分别融合出两段基因P23Alr t（1355bp）、P23Alrtf（1382）琼脂糖凝胶回收融合片段。

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

4、P23Alr t、P23Alr tf基因与pSIP409PgsA’-IL-10（PstI和SalI双酶切）片段载体连接

P23Alr t、P23Alr tf与pSIP409PgsA’-IL-10载体（用PstI和SalI双酶切）使用无缝克隆试剂盒（Seamless Assembly Cloning Kit 购自中美泰和生物技术北京有限公司）连接，CaCl2法转化入大肠杆菌TOPO10感受态细胞，涂布红霉素LB固体培养基，质粒小量制备后酶切鉴定，切出载体片段4436bp和1312bp的P23Alr t（P23Alr tf 大小1336bp）电泳见图1，将酶切阳性质粒测序鉴定，结果比对后测序同源性100%，分别命名为409eat和409eatf。将测序正确质粒409eat和409eatf分别电转化入alr基因缺陷L. plantarum NC8/Δalr感受态细胞，利用红霉素抗性基因和营养互补基因筛选阳性重组子命名为L. plantarum NC8/Δalr-409eat和L. plantarum NC8/Δalr-409eatf。

连接体系如下：

5、Western Blotting检测alr基因回归宿主菌表达丙氨酸消旋酶

采用Flag标签抗体检测alr基因回归宿主菌表达丙氨酸消旋酶情况。挑取表达Flag标签的L. plantarum NC8/Δalr-409eatf单克隆种于含有5µg/mL 红霉素的液体MRS培养基中过夜培养，转接液体MRS培养基（以菌液：培养基=1:50）待菌液生长至对数生长期后，离心收集菌体，超声破碎处理样品，Western Blotting一抗使用兔抗Flag标签单克隆抗体室温孵育2h，二抗使用HRP标记羊抗兔IgG室温孵育1h，TBST洗膜三次后显色，蛋白大小约42.4kD，表明alr基因成功表达，L. plantarum NC8/Δalr转入质粒409eatf能完成营养互补，在不添加D-丙氨酸的MRS培养基中能够生长，达到筛选阳性重组子的目的，结果见图2。

实施例2 营养互补型asd-alr双标记质粒载体409ata构建及在E.coli 6212/Δasd和L. plantarum NC8/Δalr无抗性筛选验证

1、质粒409eat用BamHI和SalI双酶切，回收含有复制子和alr基因片段4625bp。

2、扩增asd基因，以PYA4545质粒为模板，引物如下，扩含有同源弊端的片段1758bp；asd基因碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

Pasd 正F: CGCTATGCGTGCGGGATCCTCTTCCCTAAATTTAAATATAAAC（下划线为与载体同源序列，斜体标记BamHI）

Pasd R: GGGTTGTCAGGGCTTTTCGTCGACAACATCAGGTAGTGACA（下划线为与载体同源序列，斜体标记Sal I）

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

3、asd基因与409eat（BamHI和SalI双酶切）连接，连接产物电转化E.coli 6212/Δasd感受态细胞，无抗性筛选阳性重组子，长出单菌落，菌落PCR鉴定结果电泳如图3，阳性菌小量制备质粒，重组质粒命名为409ata，质粒上有两个HindⅢ酶切位点，酶切鉴定结果如图4，吉林省库美生物科技有限公司测序鉴定，测序正确质粒电转化L. plantarum NC8/Δalr，挑取单克隆质粒小量制备电泳结果如图5。

连接体系如下：

实施例3 红霉素筛选锚定表达载体pLPS-EGFP构建及在L. plantarum NC8锚定表达验证

1、pLP-1261 Inv双酶切获得载体片段

用NdeI和HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收载体5577bp基因片段，碱基序列如SEQID NO.6所示。

2、表达S-层蛋白的slpA基因上分泌信号肽序列、锚定序列及EGFP的扩增

提取嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus ATCC 4356)株基因组为模板，参照发布的基因序列设计引物，上下游引物上分别添加了同源序列，便于做融合PCR及与载体的无缝克隆连接，分别扩增sig_peptide信号肽、S-层蛋白C-末端锚定序列S_achoring及EGFP的引物序列及反应体系如下：

扩增信号肽sig_peptide序列

sig_peptide F

TATATAGGAGTATGATTCATATGAAGAAAAATTTAAG

sig_peptide R

CTCCTCGCCCTTGCTCACCATGTCGACCGCCGCAATCGTG

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

扩增EGFP序列

EGFPS F

GGCACGATTGCGGCGGTCGAC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG

EGFPS R

GGTACCGAATTCCTCGAGTCTAGACTTGTACAGCTCGTCC

PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

S-层蛋白C-末端锚定序列S_achoring

PS F

CAAG TCTAGA CTCGAGGAATTCGGTACCATGCACAACGCATACTAC

PS R

CAAAGCAACACGTGCTGTAATTTGAAGCTTTTATTATCTAAAGTTTG

a.PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

4）sig_peptide信号肽、S-层蛋白C-末端锚定序列S_achoring及EGFP做融合PCR片段长1298bp,产物名称为EGFPS基因

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

c. 融合PCR产物EGFPS琼脂糖凝胶回收纯化及pLP-1261 Inv用NdeI和HindⅢ双酶切纯化电泳结果如图6。

融合PCR产物EGFPS与载体pLP-1261 Inv（NdeI和HindⅢ双酶切）无缝克隆连接

EGFPS与载体pLP-1261 Inv（NdeI和HindⅢ双酶切）无缝克隆连接，连接产物转化E.coli TOPO感受态细胞，铺红霉素平板，筛选阳性重组子，阳性克隆小量制备质粒，重组质粒命名为pLPS-EGFP，吉林省库美生物科技有限公司测序鉴定。测序正确后电转化L.plantarum NC8，获得红霉素筛选标记阳性菌株L. plantarum NC8-pLPS-EGFP，荧光显微镜观察结见图7。

连接体系如下：

实施例4 无抗筛选构建锚定表达载体pLPSaT及在L. plantarum NC8/Δalr锚定表达EGFP验证

1、asd-alr基因的扩增

参照409ata基因序列设计无缝克隆含有同源序列引物，扩增含有asd-alr基因的3765bp片段，将pLPS-EGFP上EM基因用asd-alr替换，扩增含有asd-alr基因片段引物如下：

409ataF:GCAGCGAGTCAGTGAGCGAGAAGGATTATTCGGCTGGTTG（下划线为同源序列）

409ata R:CAAATTTAAAAAAGCGACTCATAGAATTAATCTATATAAACTCTCG（下划线为同源序列）

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

2、pLPS-EGFP基因扩增

参照pLPS-EGFP基因序列设计引物，扩增片段5073bp的LPS-EGFP片段

LPS-EGFP测F：5' TTCTATGAGTCGCTTTTTT 3'

LPS-EGFP测R：5' CTCGCTCACTGACTCGCTG 3'

a. PCR反应体系如下：

b. PCR反应条件如下：

3、asd-alr基因与LPS-EGFP连接

asd-alr基因与LPS-EGFP无缝克隆连接，电转化E.coli 6212/Δasd感受态细胞，涂布LB固体培养基，37℃过夜培养，挑取单克隆，质粒小量制备后，将阳性质粒命名为pLPS-EGFPa采用测序引物测序，引物序列如下：

P’ata alr测F：CGAGAGTTTATATAGATTAA

P’ata PUC 测F：GCAGCGAGTCAGTGAGCGAG

4、pLPS-EGFPa载体HindⅢ酶切位点突变

载体上含有两个HindⅢ酶切位点，影响载体使用，将alr基因内的HindⅢ酶切位点AAGCTT突变为AAACTT，点突变引物如下：

Hind F:CCAGTCTCTGGCATCAAACTTGCAATGGCAAC;

Hind R:TTTGATGCCAGAGACTGGTGGCCGAATTGGAC

同时载体上还含有两处Sal I酶切位点，将asd基因下游的Sal I酶切位点GTCGAC突变GTAGAC，引物如下：

1261ATT F: cactacctgatgtt GTAGACgaaaagccctgac

1261ATT R:TACAACATCAGGTAGTGACACTTCTTTGACCTG

以质粒pLPS-EGFPa为模板PCR扩增产物纯化后，用Dpn I限制性内切酶处理后，电转化E.coli 6212/Δasd感受态细胞，经过两次突变后的筛选阳性载体命名为pLPSaT，突变后载体用Sal I和HindⅢ双酶切鉴定结果如图8，酶切出含有信号肽的载体片段7672bp和1122bp的EGFPS片段。

5、基因工程L. plantarum NC8/Δalr-pLPSaT锚定表达EGFPWestern Blot分析及菌体自发荧光检测

测序正确后的质粒pLPSaT电转化L. plantarum NC8/Δalr，获得L. plantarum NC8/Δalr-pLPSaT，挑取L. plantarum NC8/Δalr-pLPSaT单克隆接种于液体 MRS 培养基中过夜培养，转接液体MRS培养基（以菌液：培养基=1:50，37℃厌氧培养1h后加pSSIP诱导肽，继续培养4h待菌液生长至对数生长期后，离心收集菌体，PBS洗三次后，制备玻片，使用倒置荧光显微镜观察荧光，结果如图9。采用反复冻融方法提取菌体表面蛋白，Western Blot分析，一抗用鼠抗EGFP单抗孵育，二抗使用HRP标记羊抗鼠 IgG室温孵育1h，TBST洗膜三次后显色，锚定序列S层蛋白加上EGFP蛋白大小约46kD如图10。

实施例5 无抗筛选锚定表达载体pLPSa的构建

1、含有sig_peptide信号肽、S-层蛋白C-末端锚定序列S_achoring基因S制备

参照NCBI发布的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus ATCC 4356)SlpA基因序列，将sig_peptide信号肽序列、S-层蛋白C-末端锚定序列保留，将中间部分基因序列用Linker和多克隆酶切位点MCS（SalI、XbaI、XhoI、EcoR I、KpnI）替换序列如下GGCACGATTGCGGCG GTCGAC TCTAGA CTCGAG GAATTC GGTACC，将设计好的序列上下游分别添加NdeI和HindⅢ酶切位点，序列长540bp，送苏州金唯智生物科技有限公司合成，合成后含有目的基因的的克隆载体命名为pUC57-Kan-S。

2、将S基因插入到pLP-1261 Inv（NdeI和HindⅢ双酶切）载体上构建C-末端锚定表达载体pLPS

分别用NdeI和HindⅢ双酶切pLP-1261 Inv和pUC57-Kan-S，分别回收5578bp载体和533bp（酶切之后合成的基因碱基数量会有变化）目的片段S，之后用T4DNA连接酶连接，化学法转化只E.coliTOP10感受态细胞，铺红霉素固体培养基，利用红霉素抗性基因筛选阳性克隆，载体命名为pLPS。

3、P23-alr-asd基因制备

参照PYA4545载体asd基因序列，NCBI公布的P23启动子和植物乳杆菌alr基因序列，将asd基因，P23启动子和alr基因串联，获得P23-alr-asd基因，人工合基因，基因大小3027bp。

4、用P23-alr-asd基因替换载体pLPS上红霉素（EM）基因获得无抗性筛选标记锚定表达载体pLPSa

LPS F：TTCTATGAGTCGCTTTTTTAAATTTG

LPS R：GGATCCCGCACGCATAGCGGTGC

扩增P23-alr-asd基因的引物序列如下：

asd F：CGCTATGCGTGCGGGATCCTCTTCCCTAAATTTAAATATAAAC（下划线标注的是与pLPS载体上的同源手臂）

alr R：CAAATTTAAAAAAGCGACTCATAGAATTAATCTATATAAACTCTCG（与pLPS载体上的同源手臂）；

无抗性筛选标记锚定表达载体pLPSa酶切验证

在sig-peptide信号肽和S-层蛋白C-末端锚定序列之间添加了多克隆酶切位点MCS（SalI、XbaI、XhoI、EcoR I、KpnI），便于目的基因的插入，将此载体分别用SalI、XbaI、XhoI、EcoR I、KpnI单酶切证结果见图12，可见能酶切出8077bp的载体片段。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 无抗性植物乳杆菌锚定表达载体pLPSa及其制备方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

catatgaaga aaaatttaag aatcgttagc gctgctgctg ctgctttact tgctgttgct 60

ccagttgctg cttctgctgt atctactgtt agcgctgcta ctactattaa cgcaggcacg 120

attgcggcgg tcgactctag actcgaggaa ttcggtacca tgcacaacgc atactactac 180

gacaaggacg ctaagcgtgt tggtactgac agcgttaagc gttacaactc agtaagcgta 240

ttgccaaaca ctactactat caacggtaag acttactacc aagtagttga aaacggtaag 300

gctgttgaca agtacatcaa cgctgcaaac atcgatggta ctaagcgtac tttgaagcac 360

aacgcttacg tttacgcatc atcaaagaag cgtgctaaca aggttgtatt gaagaagggt 420

gaagttgtaa ctacttacgg tgcttcatac acattcaaga acggccaaaa gtactacaag 480

atcggtgaca acactgacaa gacttacgtt aaggttgcaa actttagata ataaaagctt 540

<210> 2

<211> 3027

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

tcttccctaa atttaaatat aaacaacgaa ttatctcctt aacgtacgtt ttcgttccat 60

tggccctcaa acccctaatt aggatcaata aaacagcgac ggaaatgatt cccttcctaa 120

cgcaaattcc ctgataatcg ccactggact ttctgcttgc gcggtaaggc aggataagtc 180

gcattactga tggcttcgct atcattgatt aatttcactt gcgactttgg ctgctttttg 240

tatggtgaag gatgcgccac aggatactgg cgcgcataca cagcacatct ctttgcagga 300

aaaaaacgct atgaaaaatg ttggttttat cggctggcgc ggaatggtcg gctctgttct 360

catgcaacgc atggtagagg agcgcgattt cgacgctatt cgccctgttt tcttttctac 420

ctcccagttt ggacaggcgg cgcccacctt cggcgacacc tccggcacgc tacaggacgc 480

ttttgacctg gatgcgctaa aagcgctcga tatcatcgtg acctgccagg gcggcgatta 540

taccaacgaa atttatccaa agctgcgcga aagcggatgg cagggttact ggattgatgc 600

ggcttctacg ctgcgcatga aagatgatgc cattattatt ctcgacccgg tcaaccagga 660

cgtgattacc gacggcctga acaatggcgt gaagaccttt gtgggcggta actgtaccgt 720

tagcctgatg ttgatgtcgc tgggcggtct ctttgcccat aatctcgttg actgggtatc 780

cgtcgcgacc tatcaggccg cctccggcgg cggcgcgcgc catatgcgcg agctgttaac 840

ccagatgggt cagttgtatg gccatgtcgc cgatgaactg gcgacgccgt cttccgcaat 900

tcttgatatt gaacgcaaag ttacggcatt gacccgcagc ggcgagctgc cggttgataa 960

ctttggcgta ccgctggcgg gaagcctgat cccctggatc gacaaacagc tcgataacgg 1020

ccagagccgc gaagagtgga aaggccaggc ggaaaccaac aagattctca atactgcctc 1080

tgtgattccg gttgatggtt tgtgtgtgcg cgtcggcgcg ctgcgctgtc acagccaggc 1140

gttcaccatc aagctgaaaa aagaggtatc cattccgacg gtggaagaac tgctggcggc 1200

acataatccg tgggcgaaag tggtgccgaa cgatcgtgat atcactatgc gcgaattaac 1260

cccggcggcg gtgaccggca cgttgactac gccggttggt cgtctgcgta agctgaacat 1320

ggggccagag ttcttgtcgg cgtttaccgt aggcgaccag ttgttatggg gcgccgccga 1380

gccgctgcgt cgaatgctgc gccagttggc gtagtggcta ttgcagcgct tatcgggcct 1440

gcgtgtggtt ctgtaggccg gataaggcgc gtcagcgccg ccatccggcg gggaaatttg 1500

tgttaaacca ggggtgcatc gtcacccttt ttttgcgtaa tacaggagta aacgcagatg 1560

tttcattttt atcaggagtt aagcagagca ttggctattc tttaagggta gcttaatccc 1620

acgggtatta agcctaacct gaaggtagga cgacgcagat aggatgcaca gtgtgctgcg 1680

ccgttcaggt caaagaagtg tcactacctg atgttgtaga cgaaaagccc tgacaaccct 1740

cgttcctaaa aaggaataag cgtttggtca gtaaataata gaaataaaaa atcagaccta 1800

agactgatga caaaaagagc aaattttgat aaaatagtat tagaattaaa ttaaaaaggg 1860

aggccaaata taatgaaaaa tatgaatgac aatgatgtta tggttgtaat tggggagcac 1920

cgccacacac aagtcacagt ggacttgcag gcaattaaga caaatattag taatgaaatg 1980

gcgcaaaagg atgagttgac cgagttatgg gcagtcgtta aagcgaatgg ttatggacat 2040

ggaattatcc aagttgctca ggccgccaaa gaagccgggg cgaccggctt ttgtgttgca 2100

atcctggatg aggccttagc gttgcgggcc gctggctttg cggaacccat cctagtactt 2160

ggaattacgg aaccggaata cgccccactg gtagctgaaa aggatatttc actagctgtt 2220

ggaacgcaag attggctgac tacggccgca gcaattttag cggctaatca agtgacgaca 2280

ccacttcacg ttcatcttgc attagatacg ggtatgggac gaatcgggtt tcagacgccc 2340

gaagaattgg caacggcggt tacgactttg cgtcaaccgc agtcaccatt tgactttgaa 2400

gggattttta cgcattttgc aacggctgac caggcagatg atacgtattt tactcatcaa 2460

ttaaataatt ggaaacactt gattgcagtg gtggatgagc taccacgcta tgtccacgtg 2520

tccaattcgg ccaccagtct ctggcatcaa acttgcaatg gcaacatggt gcgctttggg 2580

gttgcactct atggtctaaa tccttctggt cgcgaactca gcgcaccata ccccttgcaa 2640

cccgcgttgt cgctaacggc acgcttgacg tttgttaaac gcttggctcg gggcaaatcg 2700

gtcagctatg gtgccacgta tacggccgca caggatgaat ggattggcac ggtgccgatt 2760

gggtatgcgg acggctatga acgccgatta caaggcttcc atgtacttgt tgatggtgag 2820

ttttgcgaaa tcgtcggacg ggtctgcatg gaccagctga tggttcgtct gccacatgaa 2880

gtaccggttg gagctaaggt aactttggtt ggcacggacg gtgctcgtac catttcgttg 2940

caagatattg ctgactattg tgggacaatt cattatgaga ttgcttgtgg gttagcacca 3000

cgagtgccga gagtttatat agattaa 3027

<210> 3

<211> 1128

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

atggttgtaa ttggggagca ccgccacaca caagtcacag tggacttgca ggcaattaag 60

acaaatatta gtaatgaaat ggcgcaaaag gatgagttga ccgagttatg ggcagtcgtt 120

aaagcgaatg gttatggaca tggaattatc caagttgctc aggccgccaa agaagccggg 180

gcgaccggct tttgtgttgc aatcctggat gaggccttag cgttgcgggc cgctggcttt 240

gcggaaccca tcctagtact tggaattacg gaaccggaat acgccccact ggtagctgaa 300

aaggatattt cactagctgt tggaacgcaa gattggctga ctacggccgc agcaatttta 360

gcggctaatc aagtgacgac accacttcac gttcatcttg cattagatac gggtatggga 420

cgaatcgggt ttcagacgcc cgaagaattg gcaacggcgg ttacgacttt gcgtcaaccg 480

cagtcaccat ttgactttga agggattttt acgcattttg caacggctga ccaggcagat 540

gatacgtatt ttactcatca attaaataat tggaaacact tgattgcagt ggtggatgag 600

ctaccacgct atgtccacgt gtccaattcg gccaccagtc tctggcatca aacttgcaat 660

ggcaacatgg tgcgctttgg ggttgcactc tatggtctaa atccttctgg tcgcgaactc 720

agcgcaccat accccttgca acccgcgttg tcgctaacgg cacgcttgac gtttgttaaa 780

cgcttggctc ggggcaaatc ggtcagctat ggtgccacgt atacggccgc acaggatgaa 840

tggattggca cggtgccgat tgggtatgcg gacggctatg aacgccgatt acaaggcttc 900

catgtacttg ttgatggtga gttttgcgaa atcgtcggac gggtctgcat ggaccagctg 960

atggttcgtc tgccacatga agtaccggtt ggagctaagg taactttggt tggcacggac 1020

ggtgctcgta ccatttcgtt gcaagatatt gctgactatt gtgggacaat tcattatgag 1080

attgcttgtg ggttagcacc acgagtgccg agagtttata tagattaa 1128

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<213> 人工合成()

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gtcgacgaaa agccctgaca accctcgttc ctaaaaagga ataagcgttt ggtcagtaaa 60

taatagaaat aaaaaatcag acctaagact gatgacaaaa agagcaaatt ttgataaaat 120

agtattagaa ttaaattaaa aagggaggcc aaatataatg aaaaatatga atgacaatga 180

tgtt 184

<210> 5

<211> 1715

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5