活性促进肽以及间充质干细胞在治疗类风湿性关节炎中的应用

摘要

本发明通过提供脐带间充质干细胞和细胞活性促进肽，可以用于治疗类风湿关节炎，并且制备方法简单，组分也少，在治疗上比较方便，成本低廉，可以大规模的推广应用，具有极好的市场前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域。具体地，本发明涉及活性促进肽以及间充质干细胞在治疗类风湿性关节炎中的应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞，可从血液、肝脏、骨髓、脂肪、皮肤等多种组织获得，是一群多潜能细胞，可以向多种组织细胞如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪等分化。目前，MSCs主要来源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能替代骨髓MSCs，并可弥补其缺陷的MSCs来源，已越来越受到各国学者的关注。其他方法如从脐带血和外周血中培养MSCs具有一定难度，且MSCs在足月分娩的脐带血或动员的外周血中数量尚存在争议。因此，从分娩后的废弃材料脐带中分离培养UCMSCs，为MSCs的应用提供了新的材料来源和基础资料。然而，现有的UCMSCs大多采用蛋白酶消化的传统方法，该方法操作时间长，分离的细胞状态差，且容易增加污染的机会，因此，寻求简化的UCMSCs分离培养方法是目前解决MSCs临床及实验室需求的瓶颈。基于以上要求，发明人经过多年探索发明了一种简化的的UCMSCs分离培养方法，将原有的5-6小时的操作时间缩短至30分钟。且研究证实，该方法分离的UCMSCs具有与常规方法分离的MSCs相同的表型及免疫调节功能。

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫病。未经正确治疗的RA可迁延不愈，甚至导致关节畸形。而且，现有RA的治疗方法包括传统的免疫抑制剂及生物制剂，存在副作用大、价钱高等弊端，为此需要不断寻求更经济有效且无明显副作用的治疗方法。已有的研究证实，MSCs具有免疫调节功能，体外研究表明骨髓及脂肪来源的MSCs可抑制RA患者T细胞的增殖及炎性细胞因子的分泌。为此，发明人利用上述方法分离培养得到的UCMSCs在体外与RA患者T细胞及成纤维样滑膜细胞(FLSs)共培养，观察其在RA治疗中的作用。发现UCMSCs可抑制T细胞的免疫功能及FLSs的炎症反应及侵袭能力。为UCMSCs治疗RA的临床应用提供依据。

目前，类风湿关节炎的治疗包括药物治疗、外科治疗和心理康复治疗等，治疗应个体化。结合病人自身情况，如年龄、性别、体重、自身危险因素、病变部位及程度等选择合适的治疗方案。

当前治疗类风湿关节炎的常用药物分为四大类：非甾类抗炎药(NSAIDs)、改善病情的抗风湿药(DMARDs)、糖皮质激素、和植物药。但是上述药物均不能完全控制关节破坏，而只能缓解疼痛、减轻或延缓炎症的发展。经过积极正规的内科治疗，仍不能控制病情者，为纠正畸形，改善生活质量可考虑手术治疗。常用的手术主要有滑膜切除术、关节形成术、软组织松解或修复手术、关节融合术等。但手术并不能根治类风湿关节炎，故术后仍需内科药物治疗。

因此，传统的治疗方案尚远不能控制疾病的进展或彻底治愈类风湿关节炎，迫使人们寻求新的治疗方法。

cn2015104069072中提供了一种异体间质血管层细胞(SVF)和异体间充质祖细胞(haMPCs)的用途，它们被用于制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物组合物。但是该方法治疗效果还有待进一步提高，并且细胞提取复杂，不利于大规模推广使用。

CN105833277A中公开了一种治疗类风湿性关节炎的干细胞制剂，包括间充质干细胞、人血白蛋白和NSADs。该发明通过采用间充质干细胞结合人血白蛋白和NSADs，能够在减轻患者疼痛的同时提高类风湿性关节炎的治疗效果，同样的，该方法在治疗效果上也需要大规模改进，并且其中还使用呢人血白蛋白，成本较高，三种组分一起其作用，工艺复杂。

申请人在研究中发现一种细胞活性促进肽，能够协同促进肝细胞在治疗中的作用，因而开发了自体来源的干细胞在促进肽的作用下，能够大幅度提高干细胞在预防或治疗类风湿性关节炎的治疗效果，因而开发并获得了本发明。

发明内容

本发明的目的就是提供脐带间充质干细胞和细胞活性促进肽在治疗类风湿性关节炎中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种脐带间充质干细胞和细胞活性促进肽的用途，它们被用于制备治疗类风湿性关节炎的药物组合物。

在另一优选例中，所述的细胞活性促进肽为SEQ ID NO：1所示的序列。

在另一优选例中，所述的脐带间充质干细胞为来自自体或者异体的。

在另一优选例中，体外分离、扩增脐带间充质干细胞的方法为:a.取正常阴道分娩或剖腹产脐带，无菌生理盐水冲洗去除肉眼可见污物及血液；b.无菌手工剪脐带至3-5mm大小；c.室温离心250g 5分钟，弃上清；d.组织块用10％a MEM培养，每3天换液；e.至7-10天细胞达80％融合时传代；f.以后每隔3-5天传代一次；g.至第三代鉴定。

在本发明的第二方面，提供了一种用于预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物组合物，所述的药物组合物包括：有效量的脐带间充质干细胞和细胞活性促进肽，以及药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为静脉注射试剂，和/或关节腔内注射试剂。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。

在另一优选例中，所述干细胞的浓度为1-10×10⁶个/kg。

在另一优选例中，所述细胞活性促进肽浓度为1-10μg/kg。

在本发明的第三方面，提供了一种预防和/或治疗类风湿性关节炎的方法，包括步骤：给需要的对象施用脐带间充质干细胞和细胞活性促进肽的药物组合物。

在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物，优选人。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(1)给需要的对象施用脐带间充质干细胞和细胞活性促进肽。

在另一优选例中，施用部位为所述对象的静脉内，和/或关节腔内。

在另一优选例中，步骤(1)与步骤(2)之间间隔时间为1个月以上，和/或3个月以上。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

有益效果

本发明通过提供脐带间充质干细胞和细胞活性促进肽，可以用于治疗类风湿关节炎，并且制备方法简单，组分也少，在治疗上比较方便，成本低廉，可以大规模的推广应用，具有极好的市场前景。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，脐带间充质干细胞和细胞活性促进肽在治疗类风湿性关节炎中具有极为优异的效果。在此基础上，发明人完成了本发明。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1脐带间充质干细胞的制备

a.取正常阴道分娩或剖腹产脐带，经过严格检测程序(ABO/Rh血型检测，HLA分型检测，梅毒抗体检测，HIV免疫检测，CMV抗体检测，乙型肝炎抗原抗体检测)确定安全后,无菌生理盐水冲洗去除肉眼可见污物及血液。

b.无菌手工剪脐带至3-5mm大小。

c.将步骤b中获得的组织块，转移入50ml离心管中，加入含1％青链霉素的PBS40ml，室温离心250g 5分钟，弃上清。

d.步骤c所获组织块用10％a MEM培养，每3天换液。

e.至7天左右组织块周围有梭形及多角形细胞爬出，且逐渐增多。

f.至10-14天左右细胞达80％左右融合时，用0.25％胰酶消化传代。

g.以后每隔3-5天传代一次。

h.至第三代鉴定。通过流式细胞术细胞表型分析，结果显示，其中CD14为2.15％，CD45为0.06％，CD34为0.06％，CD29为98.01％，CD44为98.52％，CD73为98.48％，CD9098.91％，说明分离得到的即为脐带间充质干细胞。

实施例2治疗试验

患者男，56岁，双手指间关节及掌指关节反复肿痛7年，晨僵持续2小时,化验RF430RU/ml、抗CCP623RU/ml，诊断为类风湿关节炎。经患者同意后行干细胞加多肽治疗。

将剂量为1*10⁷个细胞/100ml的干细胞和1μg/kg体重的多肽静脉输注，持续时间约为30分钟，待首次注射后的第1、3个月再同上方法静脉输注，剂量同上。结果：疗程结束6周后患者自觉症状明显改善，10周后复查各项指标。血清抗体非常低，RF为23RU/ml，抗CCP为26.9RU/ml。

实施例3脐带间充质干细胞成骨分化试验

采用GIBCO STEMPRO成骨分化试剂盒制备成骨分化培养基，将脐带间充质干细胞消化离心获取P3代细胞，使用适量的生长培养基制备细胞悬液待用。按照1*10³个细胞/cm²的密度将脐带间充质干细胞接种于多孔培养板，置于CO₂培养箱中预培养2小时。

预培养结束后，在实验孔中添加1mL 37℃水浴锅预热的成骨分化完全培养基(其中添加0.01μg/孔的SEQ ID NO：1多肽)，在对照孔中添加1mL 37℃水浴锅预热标准培养基，对照2为添加分化完全培养基，但是没有添加活性肽，并将多孔培养板置于37℃，5％CO₂浓度的CO₂培养箱中进行培养。在培养过程中，每隔3-4天对相应板孔进行换液。经过足够培养时间后(<＝15天)，在当天配置4％福尔马林溶液和2％Alizarin>

实施例4活性肽动物安全性试验

对SD大鼠采用尾静脉注射不同剂量的活性肽(0μg/kg、5μg/kg，100μg/kg)48小时后，未见皮疹、皮毛竖起、呼吸急促、震颤等异常过敏反应，无大鼠死亡发生；观察10周，大鼠生活状态良好，体温、食欲和体重变化正常，其中平均体重变化适量组、高剂量组与对照组从原来120g分别增长至580g、592g及581g，比较均无显著性差异。多肽注射结束后2周SD大鼠血清白蛋白、球蛋白及白蛋白/球蛋白水平在正常范围(表1)，ALT、尿素氮、肌酐、葡萄糖等指标也在正常范围(表2)，实验组和对照组比较无明显差异。本研究结果表明静脉注射多肽对大鼠安全。

表1

组别白蛋白(g/L)球蛋白(g/L)A/G对照组037.2±1.0335.1±1.020.99±0.06适量组537.2±0.8935.0±1.231.02±0.03高剂量组10036.8±0.7334.4±1.291.03±0.05

表2

实施例5活性肽安全性试验

活性肽裸鼠体内注射，注射后连续观察14天，实验动物生活状态良好，未见异常反应，体温、食欲和体重变化正常，其中体重增长适量组、高剂量组与对照组组间比较无显著性差异。多肽体内注射未对肝、脾、肾、肺、脑、心、胸腺、甲状腺及睾丸/卵巢等主要脏器产生明显影响，脏器指数无显著改变。光镜下观察肝、肾、脾及睾丸/卵巢结构正常，未见间质增生、脂肪浸润及炎性细胞浸润等病理改变。本研究结果表明静脉注射多肽对小鼠是安全的。

实施例6脐带间充质干细胞和细胞活性促进肽对RA-FLSs增殖能力的影响

留取RA患者膝关节置换术后滑膜组织，分离培养FLSs，使用3代后的细胞进行试验。分成三组，一组为脐带间充质干细胞与RA-FLSs共培养组，二组为脐带间充质干细胞+细胞活性促进肽用量同前与RA-FLSs共培养组，三组为单纯RA-FLSs对照组，三组均加TNF-α(10ng/ml)刺激。120小时，3H掺入法检测FLSs增殖情况。结果发现对照组的CPM为16500，而脐带间充质干细胞(1:1)与RA-FLSs共培养组的CPM为5300，而脐带间充质干细胞+细胞活性促进肽与RA-FLSs共培养组CPM为1200，中充分说明活性肽能够大幅增加FLSs增殖抑制活性。

实施例7脐带间充质干细胞和细胞活性促进肽可显著上调Treg的表达

分离RA患者外周血PBMC，磁珠分选3⁺Τ细胞。2X>6/孔接种于24孔板，单独培养，或与脐带间充质干细胞(2X>4/孔)，以及分别添加和不添加活性肽共培养，直接接触共培养或Transwell体系共培养。72小时后流式细胞术检CD4⁺F0XP₃+Treg细胞的表达，发现无论有无PHA刺激，脐带间充质干细胞均可上调Treg的表达，添加了多肽的脐带间充质干细胞比不添加多肽的干细胞在上调Treg的表达量上具有增多52％的益处。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 洛阳轩智生物科技有限公司

<120> 活性促进肽以及间充质干细胞在治疗类风湿性关节炎中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Trp His Asp Thr Ala Arg Trp Cys Ser Phe Ala Ser Cys Gly Pro His

1 5 1015

Cys Trp Glu Gln His Pro Tyr Ser Ser Trp

2025