一种基因载体及其用于治疗视网膜神经节细胞变性的基因治疗药物

摘要

本发明涉及一种基因载体及其用于治疗视网膜神经节细胞变性的基因治疗药物，所述基因载体包含显性抑制型(dominant negative)人类Fas‑associatedprotein with death domain(FADD‑DN)、增强子/启动子、增加基因表达的β‑globin内含子、human growth hormone poly(A)tail序列等。本发明还涉及上述基因载体或包含上述基因载体的组合物在制备治疗视网膜神经节细胞变性的药物中的应用。其优点表现在：本发明的基因治疗载体可用于治疗或预防由青光眼等引起的视网膜神经节细胞病变。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，是一种基因载体及其用于治疗视网膜神经节细胞变性的基因治疗药物。

背景技术

视网膜神经节细胞变性是青光眼(glaucoma)等疾病导致视力损伤甚至失明的主要原因，病理性眼压增高是其主要危险因素。青光眼病理机制复杂，有遗传和环境等因素参与，但其确切分子机制尚不明确。部分青光眼患者表现为高眼压，在临床可采取降眼压等对症治疗手段，但在长期无法逆转或延缓青光眼的发展。目前已经认识到，青光眼属于一种神经变性性疾病，其病理特征是视网膜神经节细胞的凋亡及其轴突的变性，以及伴随而来的视功能进行性丧失。RGC负责向大脑输出由视网膜捕捉到的视觉信号，由于高眼压、多种遗传因素或神经退行性病变等引起的RGC持续变性或凋亡，可导致视神经乳头病变、视野缺失，进而发展为青光眼。

内质网应激在神经细胞死亡中的作用正引起越来越多的关注。细胞对内质网功能障碍的应答称为“内质网应激(endoplasmicreticulum stress,ERstress)”，表现为内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡紊乱，可激活未折叠蛋白反应(unfoldedprotein response,UPR)。内质网应激对细胞存活至关重要，但持续不缓解的内质网应激导致细胞死亡。在哺乳动物体内，UPR主要由三种内质网应激敏感蛋白激活：蛋白激酶RNA样ER激酶(proteinkinase RNA-like ERkinase,PERK)，肌醇依赖蛋白-1(inositol-requirinprotein-1,IRE1)和活化转录因子(activatingtranscriptionfactor-6,ATF6)。其中IRE1介导了内质网应激的促凋亡效应。TRADD(tumornecrosis factorreceptortype 1R-associateddeath domain)和FADD(Fas-associatedproteinwithdeathdomain)是调节UPR的重要物质。FADD是一种接头蛋白，本身无信号作用，通过其死亡结构域(deathdomain)与Fas或TNF受体结合，进而与TRADD相互作用，激活caspase8和caspase3从而启动细胞凋亡。有研究证实，缺乏死亡结构域的FADD变异体(dominantnegative FADD,FADD-DN)可通过下调PERK，CHOP，Bip等相关信号分子下调内质网应激水平。此外，FADD-DN的过表达可有效阻断IRE1α的形成，进而显著减少caspase8依赖的神经上皮细胞死亡。

近来有研究发现，在青光眼动物模型病理早期阶段，视网膜神经节细胞层出现FADD及CHOP，IRE1α，XBP-1等内质网应激相关分子水平的升高，证实内质网应激是引起视网膜神经节细胞死亡的触发因素之一。而通过过表达FADD-DN能有效保持视网膜神经节细胞水平和延缓神经元变性。结合生物技术的发展，基于腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)载体的针对眼部疾病的基因治疗方法受到广泛关注，其安全性和有效性得到初步验证和认可。因此，本发明结合AAV技术，开发一种特异靶向视网膜神经节细胞并表达FADD-DN的基因治疗载体。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种基因载体。

本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供一种药物组合物。

本发明的第三个目的是针对现有技术中的不足，提供如上所述基因载体或药物组合物的制药用途

本发明的第四个目的是针对现有技术中的不足，提供一种治疗视网膜神经节细胞变性的方法。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种腺相关病毒载体所述的腺相关病毒载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、表达FADD-DN蛋白的基因序列，FADD-DN蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。

优选地，表达FADD-DN蛋白的基因序列选自与SEQ ID NO:1有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。

更优选地，所述的FADD-DN的基因序列含有SEQ ID NO:1。

最优选地，所述的FADD-DN蛋白的核苷酸序列选自SEQ ID NO:1。

在上述任一优选例中，增强子/启动子为CMV，选自与SEQ ID NO:4有至少95％同源性的核苷酸序列。更优选地，所述的CMV选自与SEQ ID NO:4有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。最优选地，所述的CMV增强子/启动子的核苷酸序列选自SEQ IDNO:4。

在上述任一优选例中，腺相关病毒可以选自AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAVHSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV6(Y445F/Y731F)，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAV clone 32/83，AAVShH10，AAV2(Y->F)，AAV8(Y733F)，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，AAVr3.45AAV2或AAV5。最优选地，腺相关病毒选自AAV2。

在上述任一优选例中，腺相关病毒为单链AAV。

在上述任一优选例中，所述的腺相关病毒载体还含有一段缩短的嵌合内含子，所述的嵌合内含子序列选自与SEQ ID NO:5有至少90％同源性的核苷酸序列。

在上述任一优选例中，所述的腺相关病毒载体含有CMV增强子/启动子、FADD-DN的基因序列、β-globin内含子、hGHpA、L-ITR、R-ITR、Ampicillin、f1ori。

在上述任一优选例中，表达FADD-DN蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1所示，L-ITR序列如SEQ ID NO:3所示，CMV增强子/启动子序列SEQ ID NO:4所示，β-globin内含子序列如SEQ ID NO:5所示，hGHpA序列如SEQ ID NO:7所示，R-ITR序列如SEQ ID NO:8所示，Ampicillin序列如SEQ ID NO:9所示，f1ori序列如SEQ ID NO:11所示。

在上述任一优选例中，所述的腺相关病毒载体序列含有SEQ ID NO:10。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种治疗视网膜神经节细胞变性的药物组合物，含有上述腺相关病毒载体和药学上可接受的载体，所述的药物组合物表达FADD-DN蛋白。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述腺相关病毒载体或药物组合物在制备治疗视网膜神经节细胞变性的药物中的应用。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：

一种基因治疗视网膜神经节细胞变性的方法，将腺相关病毒载体眼内注射，抑制FADD活性。优选地，所述的眼内注射是指视网膜下腔注射或玻璃体腔注射。

本发明优点在于：

本发明的基因治疗载体用于治疗或预防由青光眼引起的视网膜神经节细胞病变。

附图说明

附图1为AAV_FADD-DN载体的质粒模式图。

附图2为AAV_FADD-DN的质粒特征图。

附图3为C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射AAV_FADD-DN两周后视网膜铺片，免疫荧光染色图。

附图4为C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射AAV_FADD-DN或AAV-GFP，并同时在注射眼前方注射磁珠微粒造成青光眼，分别于2周、4周、8周后视网膜铺片，图示为其免疫荧光染色图。

附图5为C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射AAV_FADD-DN或AAV-GFP并同时在注射眼前方注射磁珠微粒造成青光眼，分别于2周、4周、8周后视网膜铺片，图示为其免疫荧光染色后进行RGC计数和存活率分析结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明经过研究，提供一种腺相关病毒载体及其用于治疗视网膜神经节细胞变性的相关药物、药物组合物等。

药物组合物及药盒

为了便于临床应用，本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中，所述的注射用给药器中，可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中，以方便储存、使用。运输时需要将装有药物悬浊液的微小容器放置于干冰中。平时应保存于-80℃冰箱中。

本发明所述的药盒或试剂盒中，还可包括使用说明书，以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该属于指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。

合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、BBS(BalancedSaltSolution)磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂等。

基因治疗载体

本发明中的基因治疗载体是病毒表达载体，根据本发明，病毒表达载体是腺相关病毒(AAV)载体，诸如选自由血清型AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，或其衍生的嵌合AAV组成的组中的AAV载体如AAV2-AAV3，AAVrh.10，AAVhu.14，AAV3a/3b，AAVrh32.33，AAVHSC15，AAV-HSC17，AAVhu.37，AAVrh.8，CHt-P6，AAV2.5，AAV6.2，AAV2i8，AAV-HSC15/17，AAVM41，AAV9.45，AAV6(Y445F/Y731F)，AAV2.5T，AAV-HAE1/2，AAV clone 32/83，AAVShH10，AAV2(Y->F)，AAV8(Y733F)，AAV2.15，AAV2.4，AAVM41，AAVr3.45AAV2或AAV5，这能更好地适于在感兴趣的组织中进行高效率的转导。在转染时，AAV只在宿主中引起轻微的免疫反应(如果有的话)。在本发明的优选实施方式中，基因治疗载体是AAV血清型2或5载体。在进一步优选的实施方式中，基因治疗载体是AAV2载体。

本发明的AAV载体为单链AAV，可根据标准技术生产重组病毒载体。例如，重组腺相关病毒载体能在人293细胞(其提供反式E1A和E1B特性)中传播，以达到在10^7～10^13个病毒颗粒/mL范围内的滴度。在体内应用之前，病毒载体可通过凝胶过滤方法(诸如琼脂糖柱)进行脱盐，并通过随后的过滤进行纯化。纯化降低给药载体的主体中潜在的有害作用。所给药的病毒基本上不含野生型病毒和可复制型病毒。能通过合适的方法，诸如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，随后进行银染，来证明病毒的纯度。

用于人的AAV的合适剂量在约1×10^10～1×10^14个病毒颗粒的范围内。

基因序列

SEQ ID NO:1所示的是优化后的FADD-DN序列。

SEQ ID NO:2所示的是原始的人FADD-DN氨基酸序列。

SEQ ID NO:3所示的是Left ITR序列。

SEQ ID NO:4所示的是CMV序列。

SEQ ID NO:5所示的是humanβ-globin intron序列。

SEQ ID NO:6所示的是MCS序列。

SEQ ID NO:7所示的是hGHpA序列。

SEQ ID NO:8所示的是Right ITR序列。

SEQ ID NO:9所示的是Ampicillin Resistance序列。

SEQ ID NO:10所示的是全核苷酸序列。

SEQ ID NO:11所示的是f1ori(2670-2976)序列。

SEQ ID NO:12所示的是重组序列。

基因治疗载体是眼内注射给药的，可以采用视网膜下腔或玻璃体腔注射给药。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验动物

正常C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。光照周期12h光照-12h黑暗，自由采食，自由饮水，所有的动物研究严格按照国家科学技术委员会颁发的《实验动物管理条例》进行。

主要试剂、耗材

生理盐水(浙江天瑞药业有限公司)，一次性注射针头(美国Becton Dickinsonand Company公司)，HA(Roche)，TUJ1(Abcam)，二抗山羊抗兔IgG(JacksonImmuno)，山羊血清(Sigma)，聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(Sigma)，多聚甲醛(Sigma)。

主要仪器

眼科实验手术显微镜(日本Nikon公司)；眼科显微器械(苏州明仁医疗器械有限公司)；微量进样器(美国Hamilton公司)；共聚焦显微镜(德国徕卡公司)。

小鼠青光眼模型的构建

预先准备好注射用毛细针管，针管顶端呈椭圆形，且存在20度的内向夹角，并准备好已除去表面环氧基团的磁珠微粒悬液(1.6*10^beads/ul)。选取6-8周雄性小鼠进行腹腔注射麻醉，侧放在操作台上，造模眼需水平朝上且需预先扩瞳。手术前将事先准备好的磁性微粒悬液再次吹打混匀，并迅速在毛细针管中吸取1.5ul磁性微粒悬液。毛细针管与角膜缘呈45度夹角，并在另一侧与之呈90度处用塑胶显微镊固定眼球。小心刺入毛细针管，需保证针管未进入前方深处，且过程中禁止触及虹膜和晶体。在注射点对侧角巩缘处放置一磁极，后缓慢注射1.5ul磁性微粒悬液，注射过程需保证在15至30秒内完成，注射过程中需保证磁极位置不变。注射完成后迅速移出毛细针管，后磁极位置保持不变，维持30至60秒以保证所有微粒未附着在角膜缘内测。之后眼角巩缘环绕眼球移动磁极，是磁性微粒均匀分散在角膜、虹膜夹角处并形成磁性微粒环。造模结束后小鼠需侧放在热毯上复苏，复苏过程需保持造模眼朝上。

磁性微珠悬浮溶液制备：因磁性微珠表面覆盖有环氧基，使用前应先除去，即将1ml磁性微珠迅速混入50ml新鲜配置的0.02M氢氧化钠(NaOH，MW 39.997g/mol)的10*Tris缓冲液的混合液中，室温振荡混匀24小时，利用磁力将磁珠微粒收集在试管底部。试管平放以确保所有微粒都被磁力所吸附。室温下混匀4小时。用移液器小心出去上层液体，小心地将磁珠团混入50ml 10X Tris溶液中，混匀并使所有微粒悬浮。磁珠微粒在无菌平衡液中的浓缩和悬浮：实验用超纯水振荡清洗微粒3次。在超净台中，加入500mlBBS吹打混匀3次。加入250mlBBS吹打混匀，使微粒重悬浮。确保溶液尽量均匀，并快速将25ul悬液移入0.5ml无菌管中。所得到的微粒溶液最终浓度为1.6*10^6个/ul。4℃保存。

玻璃体腔注射

使用玻璃制毛细针，于视网膜边缘、角膜巩膜交界靠后处进针，使用微量注射器注射，注射时需注意进针角度和深度，注意避免损伤晶体或其他眼内组织。

组织处理

动物先经由PBS进行全身灌注，后继续用4％多聚甲醛(PFA)灌注，灌注速度为5mL/分钟。眼球及视神经取出后在4％PFA溶液中浸泡约2小时。组织染色铺片前需在0.1M PBS中4℃储存；组织冰冻切片前需在30％蔗糖溶液中浸泡过夜。

实施例1：腺病毒载体的构建和分离纯化

质粒AAV_FADD-DN的构建如图1、图2所示，主要元件包括CMV增强子/启动子及FADD-DN序列。CMV增强子可以增强转入基因的表达。目的基因之后紧接着是hGHpA(SEQ IDNO:7)，表达盒两侧是反向末端重复序列(TR)，即病毒载体包括L-ITR(SEQ ID NO:3)，R-ITR(SEQ ID NO:8)，病毒载体还包括Ampicillin(SEQ ID NO:9)和f1ori(SEQ ID NO:11)。

病毒载体是通过质粒共转染方法获得的。将含有AAV2外壳蛋白基因和能帮助AAV复制的基因的辅助质粒和AAV_FADD-DN质粒与HEK 293T细胞共转染，初步形成重组腺相关病毒载体。经碘克丁醇初步纯化后，经过以5ml-Hitrp Q琼脂糖凝胶作为填料的快速蛋白液相色谱仪通过离子交换层析进一步纯化，使用仪器为Pharmacia AKTA FPLC system(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。之后用pH8.0，215mM的NaCl淋洗琼脂糖凝胶柱，对峰值的重组病毒载体进行收集。收集的液体通过浓缩器(100K concentrater,Millipore)后，用含0.014％的吐温20淋洗浓缩器对重组病毒载体进行浓缩。再用DNase I消化掉病毒颗粒以外DNA，并通过实时荧光定量PCR的方法确定病毒的滴度。最后用硝酸银染色-SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳法确保病毒载体颗粒没被污染且不含内毒素，并分装零下80度储存。

病毒载体AAV_FADD-DN的特征图谱如图1所示，各元件的起止位点如图2所示。

实施例2：腺病毒感染检测

组织处理：小鼠玻璃体腔注射HA标记的AAV_FADD-DN两周后，据前述组织处理方法进行眼球的前处理，后使用显微镊夹住眼球底部向上提起，用剪刀剪断眼球周围的结膜和肌肉组织，保持眼球组织完整，剪去角膜、虹膜和晶状体做成眼杯，并分离视网膜和脉络膜复合体。

免疫荧光染色：选取视网膜，在20％山羊血清溶液中封闭1h，后一抗孵育过夜，抗体分别为TUJ1、HA；PBS清洗三次、每次10min，后二抗孵育1h；PBS清洗三次、每次十分钟后封片。使用共聚焦显微镜观察视网膜结构变化并拍照。

结果：小鼠注射AAV_FADD-DN两周后，进行视网膜免疫荧光染色铺片，可见眼底存在大量HA标记的AAV_FADD-DN，且与RGC重合(TUJ1免疫荧光染色)，显示AAV_FADD-DN的感染效果优异(图3)。

实施例3：RGC存活率检测

实验方法：8周龄小鼠单侧眼玻璃体腔注射AAV_FADD-DN(实验组)、AAV-GFP(对照组)，同时在注射眼进行前房磁珠微粒注射，分别于2周、4周、8周据前述方法处理眼球及视网膜，进行免疫荧光染色。使用共聚焦显微镜观察视网膜结构变化并拍照。每个眼球随机选取5个视野计数RGC(比例尺：20um)，并计算RGC存活率。

结果：如图4-5所示，定量分析证明前房磁珠微粒注射后RGC在2W、4W、8W时逐渐凋亡，且数量减少显著(实验组)；与之相比，注射AAV_FADD-DN小鼠RGC凋亡不显著，显示AAV_FADD-DN对RGC具有保护作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市第一人民医院

<120> 一种基因载体及其用于治疗视网膜神经节细胞变性的基因治疗药物

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<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 424

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caccatgtac ccctacgacg tgcctgacta cgccgacgac ttcgaggccg gcgccgctgc 60

tggagctgca cctggagagg aggacctgtg cgccgccttc aacgtgatct gcgacaacgt 120

gggcaaggac tggaggaggc tggcccgcca gctgaaagtg agtgatacaa agattgatag 180

catcgaagac aggtacccta gaaacctgac cgagagggtg agggagagtc tgaggatctg 240

gaagaacacc gagaaggaaa acgcaaccgt ggcacatctg gtgggcgcac tgaggagctg 300

ccagatgaac ctggtggcag acctggtgca ggaggtgcag caggccaggg acctgcagaa 360

caggagcgga gcaatgagcc ctatgagttg gaacagcgat gcttccacca gcgaggccag 420

ctga424

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<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

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1 5 1015

Glu Asp Leu Cys Ala Ala Phe Asn Val Ile Cys Asp Asn Val Gly Lys

202530

Asp Trp Arg Arg Leu Ala Arg Gln Leu Lys Val Ser Asp Thr Lys Ile

354045

Asp Ser Ile Glu Asp Arg Tyr Pro Arg Asn Leu Thr Glu Arg Val Arg

505560

Glu Ser Leu Arg Ile Trp Lys Asn Thr Glu Lys Glu Asn Ala Thr Val

65707580

Ala His Leu Val Gly Ala Leu Arg Ser Cys Gln Met Asn Leu Val Ala

859095

Asp Leu Val Gln Glu Val Gln Gln Ala Arg Asp Leu Gln Asn Arg Ser

100 105 110

Gly Ala Met Ser Pro Met Ser Trp Asn Ser Asp Ala Ser Thr Ser Glu

115 120 125

Ala Ser

130

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc t 141

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 480

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tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 300

tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 360

cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 420

aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 480

tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 540

tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 600

ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 660

ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 720

cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 780

gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 840

actgattaag cattggta 858

<210> 10

<211> 4654

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggaat tcgctagtta ttaatagtaa 180

tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 240

gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 300

tatgttccca tagtaacgtc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 360

cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 420

gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 480

tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 540

tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 600

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acctccatag aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg attcgaatcc cggccgggaa 840

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caccattcta aagaataaca gtgataattt ctgggttaag gcaatagcaa tatttctgca 1080

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gctacaatcc agctaccatt ctgcttttat tttatggttg ggataaggct ggattattct 1200

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<210> 11

<211> 306

<212> DNA

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<400> 11

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<210> 12

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<400> 12

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tatgttccca tagtaacgtc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 360

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acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 4500

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