一种人急性B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药细胞株及其构建方法和应用

摘要

本发明提供一种人急性B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药细胞株及其构建方法和应用，其细胞名称是人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM‑6/HDR，保藏编号为CCTCCNO：C2017234；先将人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM‑6置于低氧条件下培养后，一次性加入0.25μM地塞米松，然后继续低氧培养，最后置于常氧条件下扩大培养，从而获得人急性B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药细胞株NALM‑6/HDR。本发明为复发难治人急性淋巴细胞白血病的研究和生物医药研发提供新的细胞模型，在探索人急性B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药的发病机制、复发难治机制和逆转耐药药物研发的应用中有较大的实用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种人急性B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药细胞株及其构建方法和应用。

背景技术

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）是儿童期最常见的恶性肿瘤，儿童ALL病例85%为急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）。虽然，近50年，儿童ALL的预后取得了飞跃式的进展，5年生存率从1960s的10%提高到90%，5年无事件生存率超过80%，但仍有10~20%的患者难治、复发，预后差，且5年后仍有患者因ALL复发或第二肿瘤而死亡。由于其高发病率，在发展中的中国甚至是发达国家，难治、复发ALL仍然是导致儿童因肿瘤死亡的首要因素。青少年和成人的B-ALL发病率远低于儿童，但其5年生存率仅30~40%。因此，难治、复发ALL是目前临床治疗的难点，亟待解决。

难治、复发ALL的共同特点是对化疗药物耐药，尤其是对糖皮质激素，糖皮质激素（glucocorticoid，GC）耐药是ALL复发、难治的重要原因之一。GC能特异性诱导恶性淋巴细胞增殖停滞并促发凋亡，一直是治疗ALL和其他淋巴源性恶性肿瘤的首选药物之一，几乎所有ALL联合化疗方案均包含GC。目前化疗方案中常用的GC是强的松和地塞米松。GC敏感性是儿童ALL临床危险度分组，指导治疗和判断预后的重要指标之一，GC耐药是临床亟待解决的治疗难题。因此，建立T-ALL GC耐药细胞模型，将有助于阐明GC耐药的分子机理，找到早期精确预警GC耐药生物标志物，完善白血病危险度分型，明确逆转耐药的治疗靶点，建立个性化高效低毒的化疗方案；有利于解决目前难治、复发ALL治疗的难点，进一步提高儿童及成人ALL，乃至其他淋巴源性肿瘤治愈率，改善患者长期生存质量，极具临床应用价值。

药物筛选法是建立肿瘤耐药细胞株的常用方法，具体技术分为两种，一是逐步增加药物浓度、持续诱导法，二是大剂量冲击间断给药法，或者两种方法结合实用。通过上述方法目前国内外已经建立了多种肿瘤的耐药细胞株，但是获得耐药细胞株所需时间较长，超过6月，操作繁琐、复杂，培养成本高，且在传代过程中会造成耐药特性的丢失，因此，实验过程中需要用药物对细胞进行筛选加压，以维持耐药特性。NALM-6是B-ALL细胞株，1976年从一名19岁男性非T非B急性淋巴细胞白血病患者外周血分离建立的，是研究B-ALL常用细胞株，也是研究GC耐药常用的敏感对照株，但是NALM-6细胞对GC高度敏感，其48小时对地塞米松的半数抑制浓度在0.0024±0.0002μM，传统药物筛选法需要从很低的浓度开始诱导，药物驯化时间长，很难在NALM-6细胞株的基础上成功构建GC耐药细胞株。

发明内容

本发明提供了一种人急性 B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药细胞株，其细胞名称是人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM-6/HDR，保藏编号为：CCTCC NO：C2017234，保藏日期：2017年10月25日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。

本发明还提供所述的人急性B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药细胞株NALM-6/HDR的构建方法：其过程是，先将对数生长期的人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM-6按1～3×10⁴个/ml接种，置于低氧环境下培养至细胞密度为1～3×10⁵个/ml（时间约4天）后一次性的加入0.25μM地塞米松，然后继续培养至细胞密度为2～10×10⁵个/ml（时间约4周），然后置于常氧条件下扩大培养，从而获得人急性B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药细胞株NALM-6/HDR。

上述方法中，所述低氧条件是模拟急性B淋巴细胞白血病细胞在骨髓中生存微环境，所述常氧条件是模拟急性B淋巴细胞白血病细胞从骨髓释放入外周血的生长环境。

上述方法中，仅通过一次0.25μM 地塞米松诱导。

具体的步骤如下：

（1）将人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM-6常规培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度、21%O₂常氧培养箱培养；

（2） 取步骤（1）中培养至对数生长期的NALM-6细胞，按1～3×10⁴个/ml接种入6孔板，置于模拟急性B淋巴细胞白血病细胞在骨髓中生存微环境（37℃、5%CO₂、饱和湿度、1%O₂）的低氧培养箱培养4天后，加入0.25μM>

（3）将步骤（2）培养得到的细胞置于模拟急性B淋巴细胞白血病细胞从骨髓释放入外周血的生长环境（37℃、5% CO₂、饱和湿度、21%O₂）下培养，当细胞增殖到1×10⁶个/ml，常规传代，换液，得到人急性B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药细胞株NALM-6/HDR。

本发明所获得的人急性B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药细胞株NALM-6/HDR具有以下生物学特性：

NALM-6/HDR细胞形态完整，圆形，大小基本一致，悬浮生长，可见成团细胞，轻吹即散；体外培养生长良好，按2×10⁵/ml密度接种，2~3天传代一次，已在体外连续培养超过8个月，传代超过90代，群体倍增超过280代，稳定增殖，状态良好，耐药指数大于25000。经液氮或超低温冻存、复苏后性状不变，保持良好的耐药特性。

细胞从处理到获得耐药细胞株的时间共5周，细胞高度耐药，药物敏感试验证实NALM-6/HDR细胞对地塞米松的耐药指数大于25000。群体倍增次数在10代时，细胞对地塞米松的耐药指数达到40000以上，之后略有回落，到100代以后，耐药指数稳定在25000~30000，不需再次用药物筛选，耐药特性稳定。

STR检测和细胞免疫表型分析证实NALM-6/HDR细胞与亲本细胞NALM-6为同一来源，免疫分型为Pre-B；STR结果与DSMZ细胞库结果对比，结果如下表1所示；

表1：NALM-6/HDR与NALM-6细胞STR检测结果并与DSMZ细胞库结果对比结果

染色体G显带核型分析证实NALM-6/HDR细胞与亲本细胞NALM-6为同一克隆来源，核型均为46, XY, t(5;12)(q33;p13), t(7;19)(q11.1;p13.3)。

采用台盼蓝染色细胞计数和MTT法绘制NALM-6/HDR细胞的生长曲线，计算细胞倍增时间为18～20小时，增殖速率稳定，可见分裂相。

采用PI染色法检测NALM-6/HDR细胞周期，可见NALM-6/HDR细胞S期比例明显高于NALM-6，提示NALM-6/HDR增殖较NALM-6更为活跃。

采用甲基纤维素半固体培养实验证实NALM-6/HDR细胞株具有高半固体克隆形成能力。

NALM-6/HDR细胞接种NOD/SCID小鼠具有高致瘤性，且成瘤细胞与体外培养的NALM-6/HDR细胞来源一致。

转录组测序发现NALM-6/HDR细胞相较于亲本细胞有140个基因表达上调，201个基因表达下调。

本发明构建的人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM-6/HDR具有以下应用：

（1）人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM-6/HDR在建立人源化糖皮质激素耐药急性B淋巴细胞白血病动物模型中的应用，细胞株NALM-6/HDR具有高致瘤性，将NALM-6/HDR细胞接种NOD/SCID小鼠，10天即可在皮下触及肿块，15天后肿块迅速生长，致瘤率100%，且成瘤细胞与体外培养的NALM-6/HDR细胞来源一致。

（2）人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM-6/HDR在筛选或评估治疗糖皮质激素耐药急性B淋巴细胞白血病药物以及逆转糖皮质激素药物中的应用，通过向NALM-6/HDR细胞培养基中添加不同化疗药物，观察细胞生长增殖、死亡、周期等改变，并明确药物能否逆转糖皮质激素耐药，获得初步有效的候选药物，再将候选药物用于上述急性B淋巴细胞白血病动物模型，检测药物的体内作用，观察动物的一般情况、存活时间、肿瘤大小改变以及药物作用后机体内凋亡、坏死及其它相关信号通路的改变等情况，从而对候选药物进行疗效评估和机制分析。

（3）人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM-6/HDR在研究糖皮质激素耐药急性B淋巴细胞白血病发生机制、细胞形态学、生物学特点中的应用，采用光镜、电镜观察细胞形态结构及超微结构，比较NALM-6/HDR和其亲本细胞NALM-6形态和生物学特点的区别，应用蛋白组学、全基因组学以及代谢组学的方法对NALM-6/HDR和NALM-6细胞进行分析，试图寻找具有差异的致病基因、蛋白或代谢物质，从而深入探讨糖皮质激素耐药的发病机制。

（4）人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM-6/HDR在建立急性淋巴细胞白血病免疫学及造血微环境研究平台中的应用，将NK细胞、CAR-T或者其它免疫抗体、配体等应用于NALM-6/HDR和NALM-6细胞及其人源化动物模型，探讨免疫治疗对糖皮质耐药白血病细胞生长、机体免疫和白血病发展和转归的影响；建立模拟骨髓造血龛的三维培养环境，比较包括免疫疗法在内的不同药物对糖皮质激素耐药急性淋巴细胞白血病治疗和转归的影响。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明的人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM-6/HDR为复发难治人急性淋巴细胞白血病的研究和生物医药研发提供新的细胞模型，在探索人急性B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药的发病机制、复发难治机制和逆转耐药药物研发的应用中将有广阔的前景和较大的实用价值。

2、现有药物筛选法构建耐药细胞株，需要逐步增加药物浓度，进行持续诱导，或是大剂量冲击间断给药，或者两种方法结合，上述方法对药物高度敏感的细胞较难筛选出耐药株，且需要更多时间对细胞进行药物驯化。本发明的人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM-6/HDR的构建方法采用低氧条件培养后用地塞米松大剂量冲击，模拟临床白血病细胞耐药形成过程，实验过程简单，造模条件稳定，能够在短期内得到耐药细胞株，无需再次用药物对细胞进行筛选加压，可显著降低造模成本；同时，该方法可对药物高度敏感的细胞造模，因为低氧条件下，恶性肿瘤细胞对多种化疗药物较常氧条件时更为耐受，此方法可广泛用于各种恶性肿瘤细胞，获得对不同药物的耐药，或同时对多种药物进行筛选，得到多药耐药的细胞株。

3、肿瘤细胞耐药程度的判定常用耐药指数（resistant index, RI）来表示，RI是耐药细胞半数抑制浓度（50% inhibitory concentration, IC50)与亲本细胞IC50的比值。Snow等按耐药指数的高低将耐药性分为低度（<5)、中度（5-15)、高度（> 15)。本发明所建立的耐药细胞株NALM-6/HDR其RI为25000～30000，即对地塞米松的IC50是亲本细胞的25000～30000倍。

附图说明

图1为倒置相差显微镜下NALM-6、NALM-6/HDR及其单克隆NALM-6/HDR-C5细胞观察图（×400）；

图2为普通光学显微镜下NALM-6、NALM-6/HDR及其单克隆NALM-6/HDR-C5细胞瑞士-吉木萨染色图（×1000）；

图3为地塞米松对NALM-6/HDR及其单克隆细胞作用48小时的半数抑制浓度（IC50）及其耐药指数（RI），其中，A：地塞米松对NALM-6/HDR细胞作用48小时的IC50；B：NALM-6/HDR对地塞米松的RI；C：地塞米松对NALM-6/HDR单克隆细胞C1、C3、C4、C5、C6和C9作用48小时的IC50；D：NALM-6/HDR单克隆细胞C1、C3、C4、C5、C6和C9对地塞米松的RI；PDL：细胞群体倍增次数（population doubling level）；

图4为NALM-6、NALM-6/HDR及其单克隆NALM-6/HDR-C5细胞生长曲线；

图5为倒置相差显微镜下NALM-6/HDR细胞克隆形成观察图，A：×100；B：×200；

图6为NALM-6/HDR与亲本NALM-6细胞染色体G显带核型分析结果图（×1000）；

图7为流式检测NALM-6、NALM-6/HDR及其单克隆NALM-6/HDR-C5细胞周期图，其中A：NALM-6；B：NALM-6/HDR；C：NALM-6/HDR-C5；

图8为转录组学测序检测NALM-6/HDR和NALM-6细胞基因表达差异，其中X轴代表A值(log2转换后的平均表达水平)，Y轴代表M值(log2转换后的差异倍数)；

图9为NALM-6/HDR细胞NOD/SCID小鼠皮下肿瘤形成实验图。

人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM-6/HDR，保藏编号为：CCTCC NO：C2017234，保藏日期： 2017年10月25日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保存单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内（武汉大学第一附小对面），武汉大学保藏中心。

具体实施方式

本发明结合具体实施例对发明做进一步说明，但本发明的实施并不仅限于此。

下述实施例如无特殊说明所用方法均为常规方法

实施例1

地塞米松快速诱导的人急性B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药细胞株NALM-6/HDR的构建方法：

1. 细胞培养：复苏人急性B淋巴细胞白血病细胞株NALM-6细胞，悬浮于含10%胎牛血清（Thermo公司）的RPMI 1640细胞培养基（Gibco公司）中，37℃、5%CO₂、饱和湿度、21%O₂常氧培养箱培养。

2. 筛选培养条件：取步骤1中对数生长期的NALM-6细胞，按2×10⁴个/ml接种入6孔板，2ml/孔，分别置于37℃、5%CO₂、饱和湿度、21%O₂常氧培养箱（常氧组）及37℃、5%CO₂、饱和湿度、1%O₂低氧氧培养箱（低氧组）培养，4天后，在常氧和低氧组均加入0.25μM>

关于地塞米松的加入量，本实施例在预实验中分别加入0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.25 μM、0.5 μM和1 μM地塞米松，结果发现在小于0.1 μM浓度时，细胞在低氧环境能有效耐受地塞米松，大于0.25μM时细胞在大剂量冲击后较难恢复增殖能力，因此，本发明采用0.25 μM剂量的地塞米松。

3. 构建耐药模型：加药4天后，常氧组在地塞米松处理后细胞完全死亡，低氧组在地塞米松处理后尚有存活细胞，继续低氧培养，4周后置常氧培养，当细胞增殖到1×10⁶个/ml，常规传代，换液，1周后检测细胞对地塞米松的半数抑制浓度，并计算其耐药指数为47750±166，将此细胞命名为NALM-6/HDR。甲基纤维素培养，挑选出单克隆细胞C1、C3、C4、C5、C6和C9。计算细胞倍增时间，并检测细胞周期。

4. 耐药性跟踪：将NALM-6/HDR及其单克隆细胞C1、C3、C4、C5、C6和C9在常氧中常规培养，传代，每月重复检测细胞对地塞米松作用48小时半数抑制浓度，并计算耐药指数，其结果显示，在群体倍增次数100代以后，NALM-6/HDR及其单克隆细胞对地塞米松的半数抑制浓度稳定在50～120µM，耐药指数稳定在20000～50000。

5. 细胞经反复冻存复苏，稳定生长，不影响其耐药特性和生物学特性。

实施例2

人急性B淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药细胞株NALM-6/HDR的生长、生物学特性和耐药特性鉴定

（1） 细胞形态学观察：取对数生长期的NALM-6/HDR细胞、单克隆细胞NALM-6/HDR-C5和其亲本细胞NALM-6于倒置显微镜下观察活细胞形态，结果如图1所示。NALM-6/HDR细胞和亲本细胞一样，在RPMI 1640完全培养基中悬浮生长，圆形、比较均一，较亲本细胞更易成团生长，体外培养生长良好。

取对数生长期的NALM-6/HDR细胞、单克隆细胞NALM-6/HDR-C5和其亲本细胞NALM-6，常规涂片固定，瑞士-吉木萨染色，于正置显微镜下观察细胞形态，结果如图2所示：NALM-6/HDR、NALM-6/HDR-C5和其亲本NALM-6细胞大小、形态结构相似。

（2）MTT法检测细胞对糖皮质激素的耐药性：离心收集对数生长期的NALM-6/HDR细胞、单克隆细胞NALM-6/HDR（C1，C3，C4，C5，C6，C9）和其亲本细胞NALM-6，分别调整细胞浓度为5×10⁵个细胞/ml，接种于96孔板中，每孔100µl，每组3复孔；在NALM-6/HDR、单克隆细胞NALM-6/HDR（C1，C3，C4，C5，C6，C9）和NALM-6细胞中分别加入浓度递增的地塞米松，其中NALM-6细胞加入0.00001～0.1>

（3）生长曲线和倍增时间测定：离心收集对数生长期的NALM-6/HDR、单克隆细胞NALM-6/HDR-C5和NALM-6细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个细胞/ml，接种于6孔板中，置37℃、5%CO₂、21%>2培养箱中培养7天，每天用台盼蓝染色计数细胞，并用MTT法检测细胞增殖情况，96孔板中加入细胞悬液，每孔100µl，每组3复孔，设置空白对照，加入5mg/mlMTT（Sigma公司）10µl/孔，充分混匀，37℃孵育4小时后加入酸化的SDS（10%SDS含0.01MHCl），100µl>

（4）甲基纤维素半固体培养，如图5所示：NALM-6/HDR细胞在甲基纤维素半固体培养基中培养7天即可见明显的克隆，证实NALM-6/HDR细胞株具有高半固体克隆形成能力。

（5）STR检测，结果如表1所示，NALM-6/HDR和其亲本细胞NALM-6的STR结果与DSMZ细胞库的结果比对，证实NALM-6/HDR细胞和其亲本细胞NALM-6为同一来源。

（6）染色体G显带核型分析，结果如图6所示：NALM-6/HDR和其亲本细胞NALM-6的核型均为46, XY, t(5;12)(q33;p13), t(7;19)(q11.1;p13.3)，证实NALM-6/HDR与亲本细胞NALM-6为同一克隆来源。

（7）PI染色法比较NALM-6/HDR及其单克隆细胞NALM-6/HDR-C5和亲本细胞NALM-6的细胞周期状况，结果如图7所示：NALM-6/HDR及其单克隆NALM-6/HDR-C5细胞周期分布相似，其G₀/G₁期比例明显低于NALM-6，而S期比例明显高于NALM-6，提示NALM-6/HDR和其单克隆细胞的增殖较NALM-6更活跃。

（8）流式检测细胞免疫分型，证实NALM-6/HDR细胞和其亲本细胞NALM-6为同一来源，表达CD10、CD19、CD22、cCD79a和HLA-DR，不表达CD20和sIgM，免疫分型为Pre-B，NALM-6免疫分型结果与DSMZ细胞库的结果一致。

（9）转录组测序，如图8所示，NALM-6/HDR细胞相较于亲本NALM-6细胞有140个基因表达上调，201个基因表达下调。

实施例3

建立人源化糖皮质激素耐药急性B淋巴细胞白血病动物模型

NOD/SCID小鼠成瘤实验：将处于对数生长期的NALM-6/HDR细胞按6×10⁶/100µl/只，接种于Balb/c>