具有细胞毒活性的吲哚咔唑类生物碱及制备方法、用途

摘要

针对现有技术中吲哚咔唑生物碱所存在的问题，本发明提供了具有细胞毒活性的吲哚咔唑生物碱及其制备方法。本发明采用通过生物技术手段构建的重组菌株，通过对STA生物合成基因簇spc进行了定向改造，获得新的吲哚咔唑生物碱，为吲哚咔唑生物碱的组合生物合成研究开辟了新的思路。本发明所述的具有细胞毒活性的吲哚咔唑类生物碱对癌细胞株均具有良好的抑制作用；而且与STA相比，其对人正常肝细胞LO2的毒性大大降低，因此，具有用于开发治疗与蛋白激酶相关疾病药物的潜能。此外，本发明所述的方法易于操作和实施，可以实现工业化的大量生产，具有广阔的应用前景和巨大的商业价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和活性化合物制备领域，具体涉及利用生物技术手段构建了一株产生吲哚咔唑生物碱星形孢菌素衍生物的重组菌株，从其发酵产物中得到具有细胞毒活性的吲哚咔唑类化合物。

背景技术

吲哚咔唑类生物碱具有多样的化学结构和广泛的生物学活性，包括抗细菌、抗真菌、抗病毒、抑制血小板凝集和抗肿瘤等。其中，抗肿瘤作用一直是研究的热点。1977年，Omura等从链霉菌Streptomyces staurosporeus中分离出了第一个吲哚咔唑类生物碱星形孢菌素staurosporine(STA)，研究表明，STA具有极强的蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)抑制活性，IC₅₀达到2.7nmol/L。PKC是一组磷脂依赖性的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，其在肿瘤的发生、发展和转移中均发挥着重要作用，是非常有价值的抗肿瘤药物潜在分子靶点。STA对PKC的抑制作用表现在其能够竞争性地结合到PKC的ATP结合位点上，抑制酶的活性，从而影响细胞周期，产生抗肿瘤活性。

此外，研究还发现STA对多种蛋白激酶都具有抑制活性，但是其抑制的非特异性导致毒性较大，限制了其临床应用。因此，通过化学手段对其衍生物进行开发的研究不断深入，目前已有多种STA衍生物进入临床研究，例如，UCN-01目前处于治疗淋巴瘤和乳腺癌的II期临床研究；Lestaurtinib(CEP-701)已于2006年被FDA批准作为治疗急性骨髓性白血病的孤儿药，同时还进入了成人实体瘤的I期临床和多种骨髓瘤、前列腺癌的II期临床研究；2017年4月，Midostaurin被FDA批准，可与化疗疗法联合用于新确诊的FLT3突变阳性的急性骨髓性白血病(AML)初治患者。然而，化学合成往往需要复杂的合成步骤，并产生有毒物质，造成环境污染，从而增加生产成本。

Staurosporine(STA)

在上述技术背景下，研究人员采用菌株直接发酵分离纯化得到类似的吲哚咔唑类生物碱。发明专利200510051437.9提供了“吲哚咔唑生物碱及其制备方法和用途”。该发明从海洋来源的马杜拉放线菌Actinomadura sp.007的发酵产物中分离纯化到新颖结构的吲哚咔唑类生物碱，并经实验证明可用作细胞周期抑制剂、肿瘤细胞增殖抑制剂或抗肿瘤剂。发明专利ZL201010185370.9提供了“一类新颖的十字孢碱类似物及其制备方法和用途”。该发明用从中国海南三亚红树林的土壤样品中分离得到的链霉菌FMA(Streptomycessp.FMA,菌种保藏编号CCTCC M 2010021)发酵产物中获得2个结构新颖的上述类型化合物。该类化合物对白血病细胞HL-60和肺癌细胞A549具有细胞毒活性，可作为细胞增殖抑制剂。发明专利申请201310547718.8公开了“几个具有强杀虫活性的吲哚咔唑生物碱及产生菌株”。该发明从海洋生境硝孢链霉菌Streptomyces nitrosporeus CQT14-24发酵产物中获得4个吲哚咔唑生物碱和1个蒽醌类化合物。所述化合物均对多种栽培植物害虫具有强杀伤作用，而且所述菌株容易培养，对环境没有污染，生产成本低，容易实现产业化。发明专利申请201710452480.9公开了“具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法和应用”。该发明所述的具有抗肿瘤活性的化合物为从链霉菌Streptomyces sp.CICC 11027发酵产物中获得的两个吲哚咔唑类化合物，其可用于治疗与蛋白激酶抑制相关的急、慢性白血病、淋巴癌、乳腺癌、肺癌等癌症，艾滋病，冠心病、糖尿病、老年痴呆症等疾病的药物。然而，采用菌株直接发酵分离纯化的方法制备吲哚咔唑类生物碱不能根据需要实现化合物的定向改造，带有很大的盲目性，不但会导致获得新化合物的效率低，而且会造成时间和物质上不必要的浪费。

组合生物合成是近年来发展起来的一种扩展天然产物结构多样性的方法。与化学合成相比，组合生物合成可以结合发酵工程大量生产目标化合物，从而降低生产成本和减少环境污染。与采用菌株直接发酵分离纯化相比，它可以特异性地修饰天然产物的生物合成途径，获得基因重组菌株，生产所需要的天然产物及其结构类似物。Cesar Sanchez等人在白色链霉菌Streptomyces albus中重构了一类吲哚咔唑类生物碱蝴蝶霉素的生物合成途径，并从该菌株中分离纯化得到多个该类别化合物(Sanchez,C.；Zhu,L.L.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2005,102,461-466)；Aaroa P.Salas等人在白色链霉菌Streptomyces albus中重构了STA的生物合成途径，并且利用糖基转移酶StaG的底物识别多样性，得到一系列带有不同糖环的STA衍生物(Salas,A.P.；Zhu,L.L.,et al.,Mol.Microbiol.2005,58,17-27)。体外活性测试表明，所得化合物对三株癌细胞(乳腺癌细胞株MDA-MB-231，肺癌细胞株A549，结肠癌细胞株HT29)和多种蛋白激酶(如AurA,AurB,Chk1)具有良好的抑制作用(Perez Salas,A.；Sanchez Reillo,C.,et al.US 08598132,Dec 3 2013.)。

然而，目前已申请的专利中均没有报道吲哚咔唑类化合物毒性的测试结果。此外，也没有研究报道本发明得到的具有细胞毒活性的吲哚咔唑生物碱结构、活性及其制备方法。

发明内容

针对现有技术中吲哚咔唑生物碱所存在的问题，本发明提供了具有细胞毒活性的吲哚咔唑生物碱及其制备方法。本发明采用通过生物技术手段构建的重组菌株，通过对STA生物合成基因簇spc进行了定向改造，获得新的吲哚咔唑生物碱，为吲哚咔唑生物碱的组合生物合成研究开辟了新的思路。

本发明的技术方案：

具有细胞毒活性的吲哚咔唑类生物碱，所述结构通式如式I或式II所示：

式中，

R₁-R₄基团为-H,-OH,-OMe,-NH₂,-NO₂,-F,-Cl,-Br,-I,-CO(CH₂)_nCH₃(n＝1-4)；

R₅基团为-H,-(CH₂)_nNH₂,-(CH₂)_nAr,-(CH₂)_nOH(n＝1-4)；

R₆-R₇基团为-H,-OH,＝O；

R₈-R₁₁基团为-H,-OH,-OMe,-NH₂,-NO₂,-F,-Cl,-Br,-I,-CO(CH₂)_nCH₃(n＝1-4)。

进一步的，具有细胞毒活性的吲哚咔唑类生物碱，所述结构通式如式I或式II所示：

式中，

R₁-R₄基团为-H,-OH,-OMe,-NH₂,-NO₂,-F,-Cl,-Br,-I；

R₅基团为-H,-(CH₂)_nNH₂,-(CH₂)_nAr,-(CH₂)_nOH(n＝1-4)；

R₆-R₇基团为-H,-OH,＝O；

R₈-R₁₁基团为-H,-OH,-OMe,-NH₂,-NO₂,-F,-Cl,-Br,-I。

所述的吲哚咔唑类生物碱化合物为化合物1，化合物2，化合物3，化合物4，化合物5，化合物6，化合物7，化合物8，化合物9；其结构式分别如下：

所述的具有细胞毒活性的吲哚咔唑类生物碱在制备抗肿瘤药物中的应用；所述的肿瘤为肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌或白血病。

所述的具有细胞毒活性的吲哚咔唑类生物碱在制备细胞增殖抑制剂中的用途。

一种药物组合物，包括如所述的具有细胞毒活性的吲哚咔唑类生物碱和药学上可接受的载体。

所述的具有细胞毒活性的吲哚咔唑类生物碱的制备方法，由链霉菌液体发酵产生，包括以下步骤：

1)将重组菌株接种于培养基I(TSBY液体培养基)中，30℃，220rpm摇床培养2天，获得种子液。

所述重组菌株为本发明通过生物技术手段构建的菌株M1146/pWLI628，其携带甲基转移酶敲除的spc基因簇。所述的TSBY液体培养基成分为：3％胰胨豆汤粉(Oxoid),10.3％蔗糖，0.05％酵母提取物，0.1％胰蛋白胨，经高温高压灭菌所得。本发明所采用的菌株为发明人通过生物技术手段构建的重组菌株，通过对STA生物合成基因簇spc进行了定向改造，获得新的吲哚咔唑生物碱，为吲哚咔唑生物碱的组合生物合成研究提供借鉴。

2)将上述所得种子液接种培养基II(放线菌2号液体培养基)中，30℃，220rpm摇床培养5天，萃取获得发酵产物。

所述放线菌2号液体培养基成分为：1％可溶性淀粉，2％葡萄糖，1％酵母膏，0.3％牛肉膏，0.4％玉米膏，0.05％硫酸镁，0.05％磷酸二氢钾，0.2％碳酸钙，高温高压灭菌所得。所述的萃取方法为：将发酵液离心，菌体用丙酮超声破碎后，蒸干丙酮，与上清混合，用两倍体积乙酸乙酯萃取发酵产物。

3)将所得发酵产物经制备柱色谱和半制备柱色谱，分离纯化，得到化合物1和2。

所述的制备柱色谱条件为：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的洗脱剂为甲醇-水溶液，体积分数为20％甲醇至100％甲醇。所述的半制备柱色谱条件为：采用的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，采用的洗脱剂为乙腈-水溶液，体积分数为45％乙腈。

本发明采用人结肠癌细胞株HCT-116、人白血病细胞株K562和人肝癌细胞株Huh7.5进行活性评价试验。经过细胞毒活性检测，化合物1和2对人结肠癌细胞株HCT-116、人白血病细胞株K562和人肝癌细胞株Huh7.5具有抑制活性。同时，与STA相比，化合物1对人正常肝细胞LO₂毒性降低约3倍，化合物2对人正常肝细胞LO₂几乎无毒性，具备良好的开发成为细胞增殖抑制剂和抗肿瘤药物的潜力。

本发明的有益效果：

(1)本发明所述的具有细胞毒活性的吲哚咔唑类生物碱对癌细胞株均具有良好的抑制作用；而且与STA相比，其对人正常肝细胞LO₂的毒性大大降低，因此，具有用于开发治疗与蛋白激酶相关疾病药物的潜能。

(2)本发明所采用的菌株为发明人通过生物技术手段构建的重组菌株，通过对STA生物合成基因簇spc进行了定向改造，获得新的吲哚咔唑生物碱，易于操作和实施，可以实现工业化的大量生产，具有广阔的应用前景和巨大的商业价值。

附图说明

图1为化合物1(stauropsorine M1)的HR-ESIMS图谱；

图2为化合物1(stauropsorine M1)的¹H>

图3为化合物1(stauropsorine M1)的¹³C>

图4为化合物1(stauropsorine M1)的¹H-¹H>

图5为化合物1(stauropsorine M1)的HSQC图谱；

图6为化合物1(stauropsorine M1)的HMBC图谱；

图7为化合物1(stauropsorine M1)的NOESY图谱；

图8为化合物2(stauropsorine M3)的HR-ESIMS图谱；

图9为化合物2(stauropsorine M3)的¹H>

图10为化合物2(stauropsorine M3)的¹³C>

图11为化合物2(stauropsorine M3)的¹H-¹H>

图12为化合物2(stauropsorine M3)的HSQC图谱；

图13为化合物2(stauropsorine M3)的HMBC图谱；

图14为化合物2(stauropsorine M3)的NOESY图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：M1146/pWLI628菌株的构建

发明人前期获得了含有spc基因簇的黏粒pWLI625，采用同源重组的方法用硫酸安普拉霉素抗性基因aac(3)IV替代spcMA基因，aac(3)IV基因后被XbaI酶切去除。再用aac(3)IV基因替代spcMB基因，aac(3)IV基因后被speI酶切去除。将获得的黏粒加载上异源表达元件aac(3)IV-oriT--attP/int，导入天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor M1146中异源表达，获得重组菌株M1146/pWLI628。

实施例2：化合物1-9的制备

1)将重组菌株M1146/pWLI628接种于含200mL TSBY培养基(3％胰胨豆汤粉，10.3％蔗糖，0.05％酵母提取物，0.1％胰蛋白胨，121℃灭菌20min)的500mL锥形瓶中摇床培养，培养条件为30℃，220rpm培养2天，获得种子液；

2)将步骤1)所得的种子液以10％接种量转接至放线菌2号培养基(1％可溶性淀粉，2％葡萄糖，1％酵母膏，0.3％牛肉膏，0.4％玉米膏，0.05％硫酸镁，0.05％磷酸二氢钾，0.2％碳酸钙，121℃灭菌20min)中摇床培养，培养条件为30℃，220rpm培养5天，获得发酵液。

3)将步骤2)所得的发酵液离心，菌体用丙酮浸泡后超声破碎，蒸干丙酮后与上清合并，用两倍体积乙酸乙酯萃取2次，浓缩后获得粗浸膏。将粗浸膏用制备色谱(填料为十八烷基硅烷键合硅胶)进行分离，洗脱剂为体积分数20％-100％甲醇-水溶液，每1/3柱体积为一个组分，HPLC分析含目标化合物的组分。对目标组分用半制备色谱(YMC-Pack ODS-A,250mm×10mm,5μm)进行分离，检测波长为294nm，流动相为体积分数45％乙腈-水溶液以1.5mL/min等梯度洗脱，收集得到目标化合物。

实施例3：化合物1和化合物2的表征

化合物1：黄色无定型粉末，分子式为C₂₈H₂₄N₄O₄。

鉴定为3'-N-acetyl-4'-hydroxylstaurosporine,命名为staurosporine M1。

[α]²¹_D+9.8(c>max(logε)206(4.21),292(4.38),336(3.89),372(3.81)nm；CD(MeOH)λ_max(Δε)212(-6.84),247(+1.98),273(-0.75),297.5(+3.93),314.5(+0.28),329(+0.67)nm；HR-ESIMS>+。NMR见表1。

化合物2：黄色无定型粉末，分子式为C₃₂H₂₆N₄O₄。

鉴定为3'-[3-methylpyridin-2(1H)-one]-4'-hydroxylstaurosporine，命名为staurosporine M3。

[α]²¹_D+198.0(c>max(logε)244(4.19),292(4.47),336(3.78),372(3.49)nm；CD(MeOH)λ_max(Δε)208.5(-10.56),228.5(-2.58),237(-7.48),251.5(+2.21),264(-10.16),298(+39.59),327(+3.84),332.5(+4.05)nm；HR-ESIMS>+。NMR见表1。

表1化合物1和化合物2的¹H和¹³C数据

实施例4：化合物1和化合物2的活性检测

采用噻唑蓝(MTT)法对化合物1、化合物2和STA对人结肠癌细胞株HCT-116、人白血病细胞株K562和人肝癌细胞株Huh7.5增殖的抑制作用。同时，选取人正常肝细胞LO₂对上述化合物和STA进行毒性测试。

取对数生长期的三种细胞以6000个/孔(细胞体积为180μL/孔)接种于96孔板，培养24h后，加入不同浓度的待测样品，每个浓度设4个复孔。溶剂对照组DMSO用量以受试组所用的最大剂量为准。药物作用72h后，肿瘤细胞在37℃、5％CO₂条件下培养72小时后加入20μL>570对照孔－OD_570给药孔)/OD_570对照孔]×100％，根据各浓度抑制率计算半数抑制浓度IC₅₀，其结果如表2所示。

表2化合物1，2和STA对三株癌细胞和一株正常细胞的半数抑制浓度IC₅₀

癌细胞HCT-116癌细胞K562癌细胞Huh 7.5正常细胞LO₂STA0.03μM1.69μM0.62μM9.47μM化合物11.03μM5.20μM2.09μM27.20μM化合物23.86μM10.49μM2.75μM＞100μM

由表2可知，化合物1和2能够有效抑制人结肠癌细胞株HCT-116、人白血病细胞株K562和人肝癌细胞株Huh7.5。同时，与STA(IC₅₀＝9.47μM)相比，化合物1(IC₅₀＝27.20μM)对人正常肝细胞LO₂毒性降低约3倍；化合物2对人正常肝细胞LO₂几乎无毒性(IC₅₀＞100μM)。充分说明，上述化合物具备开发成为细胞增殖抑制剂和抗肿瘤药物的潜力。此外，本发明所采用的菌株为发明人通过生物技术手段构建的重组菌株易于操作和实施，可以实现工业化的大量生产，具有广阔的应用前景和巨大的商业价值。