IMB-301在制备抗病毒药物中的应用

摘要

本发明涉及化合物IMB‑301在以hA3G为靶点制备抗病毒药物中的应用。公开了一种以hA3G为靶点抗病毒的活性化合物，其通过虚拟筛选得到，生物学活性表明，IMB‑301能够通过抑制Vif与hA3G结合特异性抑制Vif降解hA3G；并且IMB‑301上调细胞内hA3G水平有效抑制病毒(如HIV)的复制，即IMB‑301抑制病毒依赖于hA3G。本发明中的活性化合物选择hA3G作为靶点，解决了病毒高变异导致的耐药性问题，且与目前临床应用的抗病毒药物无交叉耐药性。

说明书

技术领域

本发明涉及化合物的新用途，具体地，涉及化合物IMB301(1-[2-(2,4-二氯苯基)-4-(4-氟苯氧基)丁基]咪唑，1-[2-(2,4-dichlorophenyl)-4-(4-fluorophenoxy)butyl]imidazole，CAS：64009-84-3)在制备抗病毒药物中的应用。

背景技术

人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(human apolipoprotein B mRNAediting enzyme-catalytic polypeptide-like 3G，hA3G)是发现最早的宿主限制因子，属于固有免疫中APOBEC家族成员。hA3G抗病毒活性的发现与HIV-1相关，主要通过被包装到病毒颗粒中，在新的一轮感染发生时，使病毒负链cDNA的dC脱氨变成dU，这种变化会直接导致正链cDNA上形成大量的G到A的超突变，从而使病毒感染性丧失。

HIV-1辅助蛋白Vif通过结合hA3G，募集辅助转录因子CBF-β，并与Cullin5蛋白、ElonginB蛋白、ElonginC蛋白和RING-box蛋白形成的E3泛素连接酶复合体相结合，对hA3G进行泛素化降解，从而拮抗hA3G的抗病毒活性。此外，hA3G在体外可以抑制HBV的复制。也有文献报道称，hA3G通过直接与NS3蛋白结合抑制HCV的复制。

目前，艾滋病的防治工作主要是依靠抗HIV药物。在药物长期的选择压力下，由于病毒高变异而产生的多重及交叉耐药性等问题表明研发针对新药物靶点的新型抗艾滋病药物仍然迫在眉睫。而解决HIV-1的耐药性问题的关键之一在于必须突破传统的“以病原病毒本身为靶”的药物发展模式。在不影响宿主生存能力的前提下，特异性地上调宿主天然的抗病毒机制不仅可以有效地抑制病毒的复制，同时也可以明显减小甚至是避免药物对病毒的选择压力，从而降低耐药性突变发生的可能性。因此，“以宿主为靶”的药物发展模式已经成为解决目前抗病毒药物耐药性难题的重要研究策略之一。

Vif与hA3G的相互作用为发展新型的抗HIV-1药物提供了新靶点，阻断Vif对hA3G的泛素化降解可恢复hA3G的抗病毒能力，从而抑制HIV-1的复制，针对hA3G-Vif相互作用的抗HIV-1抑制剂已经成为研究热点。

发明内容

本发明目的是提供化合物IMB-301在以hA3G为靶点制备抗HIV-1药物中的应用。

为实现上述目的，本发明借助分子对接手段在分子水平对化合物的结合模式和作用机制进行解释和分析，首先，有研究组利用功能性分析的方法，确定了Vif与hA3G相互作用的3个特异位点，其中包括hA3G-128，进而确定了Vif与A3G的相互作用平面，利用这种结合模式，分析IMB26和IMB35特异性结合在hA3G抑制hA3G-Vif相互作用的机制，用分子对接手段预测它们的结合模式。根据IMB26和IMB35与hA3G的结合模式，建立了一个针对hA3G-Vif相互作用抑制剂的虚拟筛选方法，以期找到与hA3G-128特异结合的小分子化合物，从而抑制Vif与hA3G的结合，进而抑制HIV-1病毒的复制。利用此模型对数据库进行筛选，经过多软件打分最终得到目标化合物，对其进行生物学活性检测。

前述的软件为Discovery Studio(DS)，Molecular Operating Environment(MOE)，Genetic Optimization for Ligand Docking(GOLD)等。

本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了IMB-301作为Vif降解hA3G拮抗剂的应用，其成分是IMB-301(CAS号64009-84-3)。

IMB-301为一种已知化合物，可购自市售产品，具体的获取手段为现有技术，本发明对此不作特别限定。

IMB-301能够有效抑制Vif降解hA3G。hA3G是发现最早的宿主限制因子，以HIV-1为例，HIV-1辅助蛋白Vif通过结合hA3G，募集E3泛素连接酶复合体，对hA3G进行泛素化降解，从而拮抗hA3G的抗病毒活性。

经过实验发现，化合物IMB-301在Vif存在的情况下，能够提高细胞内hA3G的水平约1.5～2倍。免疫共沉淀(Co-IP)结果显示化合物IMB-301能有效抑制Vif与hA3G的结合。

进一步地，经过实验发现，IMB-301能够与纯化的hA3G蛋白结合，得到KD＝15.6μM，并且能够在不影响整个泛素化蛋白酶体降解途径的前提下特异性抑制Vif降解APOBEC3G。

第二方面，本发明提供了IMB-301在以hA3G为靶点制备抗HIV-1药物中的应用。

hA3G可以有效地抑制HIV-1的复制，其编辑核酸的功能可以使mRNA上的胞嘧啶残基脱氨形成尿嘧啶，或单链DNA上的脱氧胞嘧啶残基脱氨形成脱氧尿嘧啶。hA3G不仅可以高效抑制包含HIV-1在内的各种逆转录病毒的复制，而且对非逆转录病毒如乙肝病毒也有很好的灭活效果，因此成为宿主抵御病毒感染的固有免疫系统的一个重要组成。

HIV-1病毒编码的Vif蛋白可以特异性地结合hA3G，并与细胞蛋白Cu15，elonginsB和C以及Rbx1相互作用，形成Skp1-cullin-F-box(SCF)复合物，通过泛素介导的降解途径，导致hA3G的降解，从而阻断了宿主细胞hA3G抗病毒系统对HIV-1病毒复制的抑制作用。鉴于人体内表达hA3G的细胞和组织主要是HIV-1的靶细胞(外周血单核细胞、T-淋巴细胞、单核巨噬细胞)，如果能特异而有效地阻断Vif介导的降解途径，宿主细胞就可以利用自身编码的hA3G抑制HIV-1的复制。

如上所述，IMB-301能够抑制Vif降解hA3G。进一步的，IMB-301能恢复hA3G本身的抗病毒效应，实现以hA3G为靶点的抗病毒。

经过实验发现，化合物IMB-301在hA3G存在情况下对HIV-1NL4-3毒株的抑制效果远远高于hA3G不存在的情况，提示IMB-301很可能是通过hA3G来产生抗病毒活性的。进一步的实验证据说明IMB-301能够在hA3G存在的情况下抑制HIV-1单轮感染假病毒的活性约50％，而hA3G不存在的情况下对感染性几乎没有影响，并且这种抑制作用与化合物产生的细胞毒性无关。

进一步地，经过实验发现，IMB-301能够提高子代病毒颗粒中hA3G的水平，进而提高新一轮感染中hA3G造成的超突变率，并且以IMB26作为对照，IMB-301与之有相似的作用时间点。说明IMB-301能够通过抑制Vif降解hA3G从而抑制HIV-1的感染性。

基于上述发现及试验结果，本发明进一步提供了化合物IMB301在制备抗病毒试剂或药物中的应用，和在制备抑制病毒复制的试剂或药物中的应用。以及化合物IMB301在提高子代病毒颗粒中hA3G的水平和提高新一轮感染中hA3G造成的超突变率中的应用。

由于上述抗病毒机理不仅仅涉及HIV-1病毒，因此，虽然前文以HIV-1病毒为例具体说明本发明技术方案的抗病毒机理，但本发明对化合物IMB301新用途的保护范围并不限于HIV-1病毒。任何适用上述抗病毒机理的病毒均在本发明所述病毒的范围之内，例如可以是HIV、HBV或HCV等。

本发明的有益效果在于：

本发明首次公开了化合物IMB-301在抗HIV中的新用途。其抗病毒机制以hA3G作为靶点，通过抑制Vif降解hA3G，恢复hA3G水平，不仅可以解决病毒高变异导致的耐药性问题，而且与目前临床应用的抗HIV-1药物无交叉耐药性。同时hA3G作为宿主内源性的抗病毒宿主因子，还将具有低毒副作用的优点。

附图说明

图1为实施例1化合物IMB-301结构。

图2为实施例1中化合物通过抑制hA3G-Vif相互作用抑制Vif降解hA3G。

图3为实施例2中IMB-301能够结合hA3G。

图4为实施例2中IMB-301能够特异性抑制Vif降解hA3G。

图5为实施例3中IMB-301抑制HIV-1复制依赖hA3G。

图6为实施例4中IMB-301的抗病毒活性与其细胞毒性无关。

图7为实施例5中IMB-301能够增加病毒内hA3G水平，提高突变率。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例1化合物通过抑制hA3G-Vif相互作用抑制Vif降解hA3G

取293T细胞进行培养，待细胞长满培养瓶后，弃旧培养基，用含0.25％胰酶和0.02％EDTA的消化液消化。待细胞变圆，弃消化液，立即加入含10％FBS(购自GIBCO)的高糖DMEM培养基(GIBICO)，用吸管轻轻吹打瓶底，使细胞完全脱离瓶底且使之分散为单细胞悬液。计数后，用培养基将细胞浓度调整为2.2×10⁵个/ml，接种于6孔板，2mL/孔。24h后(细胞丰度约为70％)转染，质粒用量(每孔)：Vif为200ng和hA3G-HA>

48小时后弃旧培养基，加入1mL预冷PBS，移液器直接吹打6 孔板中293T细胞。收集细胞到1.5mL EP管中。2×10³g离心5min收集细胞，80μL>

12％SDS-PAGE分离蛋白样品。75V湿法转膜1h后，5％脱脂奶粉封闭1h，先后与一抗(2h)和二抗(1h)孵育，然后ECL显色。抗体使用浓度为，β-actin(1:2000)，P24(1:5000)，HA(1:3000)，Vif(1:4000)，山羊抗小鼠(1:2000)、山羊抗兔(1:5000)。本实验步骤采用常规免疫印迹(Western blots)实验方法。共转Vif和hA3G-HA时，化合物会对Vif降解hA3G-HA产生影响。IMB-301能够在不影响细胞内Vif水平的基础上，上调hA3G水平，有效抑制Vif降解hA3G。

进一步的，如上述进行细胞培养计数后，用培养基将细胞浓度调整为2.2×10⁵个/ml，接种于10cm皿，7mL/皿。24h后(细胞丰度约为70％)转染，质粒用量(每孔)：Vif为1000ng和hA3G-HA>3g离心5min，弃上清。1mL预冷PBS重悬，转移到1.5mlLEP管中。2×10³g离心5min，弃上清。加入0.5mL>

实施例2 IMB-301能够结合hA3G，特异性抑制Vif降解hA3G

RAD-Octet结合实验，验证IMB-301与hA3G是否存在直接相互作用。生物素(NHS-Biotin Reagents，Cat.#21343,Thermo)：蛋白摩尔比为3:1，室温反应1hr后过脱盐柱(Zeba^TM>

RAD-Octet结合实验基于光纤生物传感器的生物膜层光学干涉技术(BLI，BioLayer Interferometry)，能够进行分子相互作用的动力学分析以及蛋白质定量。利用此系统验证IMB-301与hA3G蛋白的结合作用。结果显示，IMB-301能够与纯化的hA3G蛋白结合，得到KD＝15.6μM。说明IMB-301能够与hA3G蛋白结合(图3)。

另外，为了验证IMB-301作用的特异性，同样验证了IMB-301对于Vif降解hA3F的影响。细胞培养及免疫印迹流程如上所述，结果显示，IMB-301对于Vif降解hA3F的无明显抑制作用，说明IMB-301对于Vif降解hA3G的抑制作用在一定程度上具有特异性(图4)，同时也说明IMB-301并不影响整个泛素化蛋白酶体降解途径。

实施例3 IMB-301抑制HIV-1复制依赖hA3G

SupT1/H9细胞浓度为1.5×10⁶/mL，24小时后换液，保持细胞浓度为1.0×10⁶/mL，铺24孔板，加入化合物的各个浓度，处理1小时后，用NL4-3株进行转染，转染浓度为10ng/mL，并同时加入VSVG提高病毒的感染性。24小时后用新鲜培养基洗两遍，同时保持化合物处于其中。24小时后，收集病毒感染TZM-bl细胞，浓度约为1.5×10⁵个/mL，感染体积比为1:20。48h后检测荧光素酶活性。

在本实验中，选择无hA3G表达的SupT1细胞和高表达的H9细胞，如果化合物能够抑制Vif降解hA3G，那么就能提高hA3G的抗病毒能力。从结果可以看出，化合物IMB-301随着浓度梯度的变化，抗病毒活性有着相应的变化。值得注意的是IMB-301化合物在两种细胞系中抗病毒活性有着显著差异，在H9细胞中的抗病毒活性明显高于SupT1中，IC50分别约为：IC50_(H9)≈8.6μM，IC50_(SupT-1)≈72.2μM，两者的IC50相差约8.5倍，化合物IMB-301在hA3G存在情况下对HIV-1病毒的抑制效果远远高于hA3G不存在的情况，提示IMB-301很可能是通过hA3G来产生抗病毒活性(图5)。

另外，在HIV-1单轮感染假病毒系统中，293T细胞培养于含10％FBS的DMEM培养基中。转染前接种于6孔板(细胞浓度为1.5×10⁵/mL)，于2mL培养基中培养。24h后转染，质粒用量(每孔)：pNL4-3-luc为300ng和VSV-G为210ng，(或者共转hA3G>5个/mL，感染体积比为1:20。48h后检测荧光素酶活性。

实施例4 IMB-301的抗病毒活性与其细胞毒性无关。

CCK-8试剂盒，为MTT法的替代方法，是一种基于WST-8(水溶性四唑盐，化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。检测时，细胞上清更换为含有10％CCK-8试剂的细胞培养液，细胞在37℃、5％CO₂孵箱中继续培养1h，使用EnSpire>

为了排除由于化合物毒性而产生的非特异性差异，验证化合物IMB-301对细胞活性的影响。利用上述试剂盒测得CC50_(SupT1)≈47μM，CC50_(H9)≈60Μm(图6)，这个浓度远远高于测得的IC50值(图5)。由此说明，IMB-301的抗病毒活性与其细胞毒性无关，更重要的是，两种细胞中产生的抗病毒差异也与细胞毒性无关。

实施例5 IMB-301能够增加病毒内hA3G水平，提高突变率。

hA3G具有胞嘧啶脱氨酶活性，一旦降解受到抑制，被包装到病毒颗粒中的hA3G水平将上升，进而在新的一轮感染中，使病毒负链cDNA的dC脱氨变成dU，这种变化会直接导致正链cDNA上形成大量的G到A的超突变，抑制病毒DNA合成及整合等，从而抑制病毒感染性。如果IMB-301能够通过抑制Vif降解hA3G从而抑制HIV-1感染性，那么IMB-301就能够提高子代病毒颗粒中hA3G的水平，进而提高新一轮感染中hA3G造成的超突变率。

为了验证这一想法，分别利用Vif(+/-)的NL4-3质粒与hA3G共转293T细胞，12小时后加入化合物处理，48小时后同时收集细胞样品，超速离心实验收集病毒样品。WesternBlots分析各组分蛋白表达，在IMB-301存在的情况下与对照组相比，细胞内hA3G水平明显增加，与前面结果一致，与此同时病毒颗粒内的hA3G水平也有明显上升，而对病毒蛋白表达没有影响，说明化合物IMB-301能够提高子代病毒颗粒中hA3G的水平。用收集的病毒感染TZM-bl细胞提取全基因组DNA，选取gag上一段700bp左右的序列，PCR扩增，利用T载体连接技术，转化挑取单克隆进行随机测序，计算突变率(图7)。结果显示，与DMSO组相比，IMB-301能够明显提高超突变效率，P值<0.05，具有统计学意义。由此得到结论，IMB-301能够增加病毒内hA3G水平，提高病毒基因组超突变率。进一步说明IMB-301抑制HIV-1病毒与hA3G密切相关。