一种重组黄花蒿3类变应原蛋白及其应用

摘要

本发明涉及一种哺乳动物细胞表达的黄花蒿主要致敏蛋白Art a3，编码基因、表达方式、纯化工艺，以及重组蛋白检测方法和应用。黄花蒿致敏蛋白本身属于植物蛋白，在现有常用的原核或真核表达系统中表达都有一定困难，也并未见相关文献公开；而传统的提取方式常存在着成分复杂、质量难以控制、易受到外源性有毒物质、病原体微生物的污染等问题。为此，本发明提供了如SEQ ID NO：1所示的重组Art a3的编码基因，以及专为此设计的表达、纯化、重组蛋白检测方法及应用，与现有技术相比，本发明的重组Art a3具有较高的表达量及活性，同时也为该药品开发过程中细胞株开发、工艺优化、临床前和临床研究以及工业化生产建立了基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种重组黄花蒿3类变应原蛋白及其编码基因和表达纯化方法。

背景技术

近年来过敏性花粉症的发病率呈逐年上升，欧洲的发病率由20世纪初的1％上升到了20％，并预计在未来20年内可达到35％。我国花粉症患者已逾1000万人，城市居民发病率为0.9％左右，流行区可达5％，随着城区树木花草品种越来越多，花粉过敏症患者有增加的趋势。

花粉是高等植物的雄性生殖细胞，在风或虫的作用下，在空气中传播，有些人在呼吸过程中吸人花粉后，便会产生过敏反应。花粉的飘散具有明显的季节性。春天的风媒花粉多来源于树木；晚春和初夏的风媒花粉多来源于牧草；夏末和秋初的风媒花粉多来源于杂草。目前已知可以引起人类过敏的花粉主要有蒿属花粉(Artemisia)、豚草属花粉(Ambrosia)、蓖麻属花粉(Ricinus)、葎草属花粉(Hummlus)、藜属花粉(Chenlpldum)、苋属花粉(Amaranthus)、木麻黄属花粉(Casuarina)、桦木属花粉(Betula)、松属花粉(Pinus)、云杉属花粉(Picea)、柳杉属花粉(Cryptomeria)、悬铃木属花粉(Platanus)等。这些植物的花粉因其病原性强，致敏率高，数量大，散播范围广；且植物自身分布的范围广，数量亦丰富，对花粉污染的影响大，因而这些植物成为较重要的花粉污染源植物。由于花粉污染源植物的分布受气候、土壤、生物和地形等因素的影响，因而不同地区，其主要的花粉污染源植物亦不相同。在我国，因多数地区(如北京、新疆、山西、山东、武汉、沈阳、广州、宁夏等地)的主要花粉均为蒿属植物花粉，因此我国的花粉污染源植物以蒿属植物最为严重。

目前，临床上主要采用黄花蒿粗提液治疗蒿属花粉过敏引起的过敏性鼻炎与过敏性哮喘等过敏性疾病的脱敏治疗，例如浙江我武生物2016年6月份批准的黄花蒿粉滴剂即为黄花蒿提取液。由于天然变应原提取液的组成非常复杂，界定其组分非常困难，提取方法耗时长，过程繁琐，成本较高，且容易受到外源性有毒物质、病原体微生物的污染。此外，采用粗提液进行诊断，无法明确患者对变应原各组分的反应程度，易致误诊。

而另一方面，黄花蒿变应原蛋白本身属于植物蛋白，在现有常用的原核或真核表达系统中表达都有一定困难，也并见相关文献公开。

发明内容

为了克服以上缺点，发明人根据NCBI已公开的Artemisia vulgaris clone1Artv3allergen precursor(Art v3)的mRNA序列从NCBI EST检索获得与Art v3高度同源性但未知基因功能的Artemisia annua的cDNA序列，命名为黄花蒿3类变应原(以下简称rArta3)，并将该基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中进行了优化，在分子设计时加入了提高rArt a3表达的作用原件，发明人惊喜地发现，经过基因优化后rArt a3与现有技术相比具有更高的表达量，且与天然蛋白相比具有高度相似的生物学活性，可用于花粉过敏治疗中。

本发明的一个目的是提供一种编码rArt a3蛋白的DNA序列，其碱基序列如SEQ IDNO:1所示。该序列针对哺乳动物细胞CHO表达系统进行了密码子优化，其更利于rArta3在哺乳动物细胞CHO中表达。

本发明的另一个目的是提供一种rArt a3蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的另一个目的是提供一种含有上述编码优化后rArt a3基因的载体，优选的，所述的载体为pcDNa3.1，pcDNa3.3-TOPO，pOptiVECTM-TOPO，pCHO1.0。

本发明的另一个目的是提供一种包含上述所述载体的哺乳动物细胞CHO细胞株，优选的，所述哺乳动物细胞CHO细胞株为CHO-K1，CHO-DHFR，DG44，CHO-S。

上述所述载体优选为pCHO1.0或pOptiVECTM-TOPO，更优选为pCHO1.0。

上述所述哺乳动物细胞CHO细胞株优选为DG44或CHO-S细胞株，更优选为CHO-S细胞株。

本发明的另一个目的是提供一种rArt a3蛋白的表达方法，所述方法包含下述步骤：

A.构建含有上述编码rArt a3基因的载体；

B.将步骤A的载体线性化后转入哺乳动物细胞CHO细胞株中，并在合适的条件下培养；

C.回收纯化蛋白质。

本发明的另一个目的是提供一种rArt a3蛋白纯化方法，所述纯化方法如下：

A.将rArta3分批补料培养液低温高速离心收集上清，20mM磷酸盐缓冲液超滤，0.45μm滤膜过滤。

B.阳离子交换层析，用平衡缓冲液平衡层析柱，接着运用全自动智能蛋白纯化系统(AKTA avant150，购自GE healthcare公司)中Q阀对平衡缓冲液和洗脱缓冲液进行自动配置，将步骤A中预处理的分批补料培养液通过分离填料，然后运用洗脱缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰，平衡缓冲液和洗脱缓冲液pH＝6.0。

本发明在哺乳动物细胞中表达的rArta3不仅具有较高的产量，而且与nArta3相比具有非常相似的生物学活性。并且，制备和纯化工艺简单，经一步纯化即可获得重组变应原。与粗提液相比具有以下优势：(1)重组变应原具有更高的纯度，与粗提液相比不含非变应原成分、酶类、酶抑制剂和毒性蛋白等；(2)重组蛋白具有较好的特异性，粗提液中成分复杂，患者可能只与其中部分成分反应，特异性差，而重组变应原成分单一，特异性好；(3)重组变应原活性可替代天然提取液，与天然提取液相比减少IgE结合的抗原表位，有效降低IgE介导的过敏反应，同时保留变应原T细胞识别所必须的结构域，具有较好的免疫原性，减少免疫治疗的危险性，提高脱敏治疗的效果。

附图说明

图1表示优化前后重组rArt a3基因序列对比图。

其中优化前序列对应的为天然rArt a3基因核苷酸序列；优化后序列对应的为本发明的重组rArta3的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。

图2-a，图2-b为优化前后rArt a3基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中的CAI指数。

其中，图2-a表示天然rArt a3基因核苷酸序列在哺乳动物细胞CHO表达系统中CAI指数经程序计算为0.72；图2-b表示优化后的本发明的rArt a3密码子在哺乳动物细胞CHO表达系统中CAI指数经程序计算为0.96。

图3-a，3-b为密码子优化前后rArt a3基因在哺乳动物细胞CHO表达宿主中最优密码子频率分布区域图。

其中图3-a表示rArt a3天然基因核苷酸序列在哺乳动物细胞CHO系统中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：rArt a3天然基因核苷酸序列的低利用率密码子出现百分比为13％；图3-b表示优化后的本发明的rArt a3密码子在哺乳动物细胞CHO系统中最优密码子频率分布区域图，优化后的本发明的rArt a3密码子序列低利用率密码子出现为0。

图4-a，4-b为密码子优化前后rArt a3基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中平均GC碱基含量分布区域图。

其中，图4-a表示rArt a3天然基因核苷酸序列在哺乳动物细胞CHO表达系统中平均GC碱基含量为：48.20％；图4-b表示优化后的本发明的rArt a3密码子在哺乳动物细胞CHO表达系统中平均GC碱基含量为：56.87％。

图5为rArt a3基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

其中，泳道1为500bp DNA Ladder；泳道2为两端含有AvrII和BstZ17I酶切位点的rArt a3基因PCR产物。

图6为rArta3表达质粒pCHO1.0-rArt a3构建过程图。

图7-a，7-b为rArt a3基因在哺乳动物细胞株中的补料分批流加培养表达鉴定图。

其中，图7-a为rArt a3基因在哺乳动物细胞株中的补料分批流加培养液上清SDS-PAGE凝胶电泳图。其中泳道1为哺乳动物空细胞补料分批流加培养10天后上清培养液，泳道2-3为rArt a3基因在哺乳动物细胞株中的补料分批流加培养第3-4天上清培养液，泳道4为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker，泳道5-10分别为rArt a3基因在哺乳动物细胞株中的补料分批流加培养第5-10天上清培养液。

图7-b为rArt a3基因在哺乳动物细胞株中的补料分批流加培养液液上清蛋白免疫印迹图。其中泳道1为天然Art a3蛋白样品，泳道2为10-250KD范围的预染蛋白上样Marker；泳道3-10分别为rArt a3基因在哺乳动物细胞株中的补料分批流加培养第3-10天上清培养液。

图8-a，8-b为pH＝5.5时，rArt a3补料分批流加培养上清阳离子层析纯化色谱图和凝胶电泳图。

其中，图8-a为pH＝5.5时，rArt a3补料分批流加培养上清阳离子层析纯化色谱图；

图8-b为pH＝5.5时，rArt a3补料分批流加培养上清阳离子层析纯化凝胶电泳图。泳道4为11-100KD非预染蛋白Marker，其他各泳道为各洗脱收集分管。

图9-a，9-b为pH＝6.0时，rArt a3补料分批流加培养上清阳离子层析纯化色谱图和凝胶电泳图。

其中，图9-a为pH＝6.0时，rArt a3补料分批流加培养上清阳离子层析纯化色谱图；

图9-b为pH＝6.0时，rArt a3补料分批流加培养上清阳离子层析纯化凝胶电泳图。泳道6为11-100KD非预染蛋白Marker，其他各泳道为各洗脱收集分管。

图10-a，10-b为pH＝6.5时，rArt a3补料分批流加培养上清阳离子层析纯化色谱图和凝胶电泳图。

其中，图10-a为pH＝6.5时，rArt a3补料分批流加培养上清阳离子层析纯化色谱图；

图10-b为pH＝6.5时，rArt a3补料分批流加培养上清阳离子层析纯化凝胶电泳图。泳道7为11-100KD非预染蛋白Marker，其他各泳道为各洗脱收集分管。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1rArt>

发明人根据NCBI已公开的Artemisia vulgaris clone1Art v3allergenprecursor(Art v3)的mRNA序列(GenBank登录号：EU564846.1)从NCBI EST检索获得与Artv3序列高度同源性但是未知基因功能的Artemisia annua的cDNA序列(NCBI登录号：GW332468.1)，序列如SEQ ID No：2所示，对该基因进行密码子优化后得到本发明的rArt a3基因，核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。下面是对rArt a3密码子优化前后各参数对比如下：

1.密码子适应指数(CAI)

由图2-a可知，密码子没有优化前，rArt a3原始基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中密码子适应指数(CAI)为0.72。由图2-b可知，通过密码子优化，rArt a3基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中CAI指数为0.96。通常CAI＝1时被认为该基因在该表达系统中是最理想的高效表达状态，CAI指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越差，因此可以看出经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高rArt a3基因在哺乳动物细胞CHO表达系统中的表达水平。

2.最优密码子使用频率(FOP)

由图3-a可知，基于哺乳动物细胞CHO表达载体，密码子没有优化前，rArt a3基因序列的低利用率密码子(利用率低于40％的密码子)出现百分比为13％。这条未进行优化的基因采用串联稀有密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物。由图3-b可知，通过密码子优化后，rArt a3基因在哺乳动物细胞CHO系统中出现低利用率密码子的频率为0。

3.GC碱基含量(GC curve)

GC含量理想分布区域为30％-70％，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录和翻译效率。由图4-a、图4-b的rArt a3基因的GC碱基平均含量分布区域图对比可知，由图4-a中显示rArt a3基因GC碱基平均含量为48.20％，由图4-b中显示出优化后去除在30％-70％区域外出现的GC含量峰值，最终得到优化后rArt a3的GC碱基平均含量为56.87％。

实施例2：含有rArt>

将密码子优化后的rArt a3基因在5’端引入AvrII酶切位点序列，在3’端引入BstZ17I酶切位点序列，并进行全基因合成，将合成的基因片段，构建到pUC57质粒(由南京金斯瑞科技有限公司提供)中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-rArt a3质粒。

以pUC57-rArt a3质粒为模板，进行PCR扩增，所用引物序列如下：

上游引物(SEQ ID No：4)：

M13F:TGT AAA ACG ACG GCC AGT

下游引物(SEQ ID No：5)：

M13R:CAG GAA ACA GCT ATG AC

反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶为Q5(#M0491L，购自New England BioLabs公司)，2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃5秒、55℃45秒、72℃30秒，25个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小(420bp)一致(结果如图5所示)。

用AvrII(#R0174S，购自New England BioLabs公司)和BstZ17I(#R0594S，购自NewEngland BioLabs公司)双酶切后，1％琼脂糖电泳，得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒(DP214，购自北京天根生化科技有限公司)纯化。用T4连接酶(#M0202S，购自New EnglandBioLabs)连接到pCHO1.0质粒(购自Life公司)中，转化到Top10感受态细胞(CB104，购自北京天根生化科技有限公司)中，在含有卡那霉素(0408，购自Amresco公司)的LB固体培养基中37℃培养过夜。

第二天挑取阳性克隆菌进行PCR鉴定，并将阳性结果进行测序比对，与预期序列完全一致，即得到rArt a3密码子优化后的表达质粒，记为pCHO-rArt a3(质粒构建如图6所示)。

实施例3：含有rArt>

Puromycin为氨基糖甙类抗生素，通过干扰核糖体功能阻断哺乳动物细胞的蛋白质合成，来自链霉菌的pac基因具有解除Puromycin毒性的作用。pCHO1.0载体含有pac基因，因此可利用Puromycin作为pCHO1.0为表达载体的筛选抗生素。MTX为叶酸拮抗剂，在细胞内经过转换后可抑制DHFR的活性，抑制核酸合成，引起细胞毒性。pCHO1.0含有DHFR基因，可利用MTX作为筛选试剂。利用转染后的细胞含有Puromycin和MTX抗性基因，不断增加筛选试剂的浓度来增加阳性细胞中目的基因拷贝数从而提高表达量。

将测序正确的pCHO-rArt a3质粒用NruI限制内切酶(#R0192S，购自New EnglandBioLabs公司)线性化，电转染到CHO-S宿主细胞中后，分别加入低浓度的Puromycin(A1113802，购自Life公司)和MTX(M8407，购自Sigma-Aldrich公司)置于二氧化碳培养箱中37℃，8％CO₂进行加压筛选。10天后计算细胞活率，当细胞活率大于30％以上转移到摇床中，37℃，8％CO₂，130rpm悬浮培养，并不断提高Puromycin和MTX浓度加压筛选提高目的基因拷贝数从而提高表达量。

实施例4：含有rArt>

将含有高表达rArt a3稳定表达哺乳动物株接种于Dynamis培养基(A2617501，购自life公司)中，37℃，8％CO₂，130rpm摇床中培养。

第3天，取样并计算细胞密度，当细胞密度达到5×10⁶/mL后，加入葡萄糖至终浓度4g/L和10％CD>TM>

每天计算细胞密度，第5，7天加入葡萄糖至终浓度为4g/L和10％CDEfficientFeed^TM>

第10天收集上清培养液或者检测细胞的活率和密度，当细胞的活率低于70％时收集上清培养液。随着葡萄糖和CD>TM>

实施例5：rArt>

通过对本专利构建的rArt a3序列分析，主要对rArt a3培养液采用阳离子交换纯化方法，并通过对阳离子缓冲液和pH筛选，几乎一步纯化rArt a3纯度就达到90％以上，基本上满足对rArt a3蛋白体外生物活性评价。层析填料选择为HiTrap SP HP(17-1152-01，购自GE healthcare公司)，具体步骤如下：

1.培养液除杂预处理

按实施例4得到rArt a3宿主细胞株补料分批培养液，12000rpm，15min低温离心收集上清，20mM磷酸盐缓冲液超滤，0.45μm滤膜过滤即得处理后培养液上清，可进行层析纯化。

2.阳离子交换层析方法优化

首先配置缓冲液母液，其中缓冲液Q1：0.2M Na₂HPO₄，缓冲液Q2：0.2M>2PO₄，缓冲液Q3：ddH₂O，缓冲液Q4：4M>

图8-a为平衡缓冲液和洗脱缓冲液为pH＝5.5时，rArt a3离子交换纯化色谱图，图8-b为平衡缓冲液和洗脱缓冲液为pH＝5.5时，rArt a3离子交换层析后SDS-PAGE分析图；图9-a为平衡缓冲液和洗脱缓冲液为pH＝6.0时，rArt a3离子交换纯化色谱图，图9-b为平衡缓冲液和洗脱缓冲液为pH＝6.0时，rArt a3离子交换层析后SDS-PAGE分析图；图10-a为平衡缓冲液和洗脱缓冲液为pH＝6.5时，rArt a3离子交换纯化色谱图，图10-b为平衡缓冲液和洗脱缓冲液为pH＝6.5时，rArt a3离子交换层析后SDS-PAGE分析图，结果显示，平衡缓冲液和洗脱缓冲液为pH＝6.0，rArt a3纯度和回收率较其他pH都有明显的提高。

实施例6：rArt>

将纯化得到的rArt a3蛋白用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Cat No:23225，购自Pierce公司)测定蛋白浓度，分别与与天然Art a3(以下简称nArt a3)比较，和花粉过敏病人血清反应；表1表示rArt a3和nArt a3与24个花粉过敏病人血清反应OD₄₅₀吸收值，结果表明rArt>450吸收值基本一致，说明在哺乳动物细胞中表达的rArt>

表1：rArt a3与nArt a3与花粉病人血清反应OD₄₅₀吸收值

序列表

<110>江苏众红生物工程创药研究院有限公司 常州京森生物医药研究所有限公司

<120>一种重组黄花蒿3类变应原蛋白及其应用

<130>一种重组黄花蒿3类变应原蛋白及其应用

<160>5

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>354

<212>DNA

<213>Artemisia annua

<400>1

atggcttcta tgactatgcg tgttttatgt gtcattgtag cctgcatggt ggttgtcgca60

ccttatgcgg aagctctctc atgtagtgaa gtaacgagca agttggcgcc atgctttaac 120

tacctaaagt ctggtggtaa ggtgccacca gcatgttgcg acggagtcaa gggactaaac 180

tccgctgcta aaacgacccc tgatagaaag acggcatgca cttgcatgaa gagtgcttat 240

aaatcataca atggcatcaa cgctgataat gctgctggcc ttcctggcaa gtgtggtgtt 300

aatattccct acaagatcag ccttagcacc gactgcaaca aggtcaagtg ataa 354

<210>2

<211>354

<212>DNA

<213>Artemisia annua

<400>2

atggcctcta tgaccatgag ggtgctgtgc gtgatcgtgg cctgtatggt ggtggtggct60

ccttacgccg aggctctgtc ctgcagcgag gtgacatcca agctggcccc atgtttcaat 120

tatctgaaga gcggaggcaa ggtgccacct gcttgctgtg acggcgtgaa gggcctgaac 180

tccgccgcta agaccacacc cgacaggaag accgcctgca catgtatgaa gtccgcctac 240

aagtcttata acggcatcaa tgctgacaac gctgctggac tgcctggcaa gtgcggagtg 300

aatatcccct acaagatctc tctgtccacc gattgtaaca aggtgaagtg atga 354

<210>3

<211>116

<212>PRT

<213>Artemisia annua

<400>3

Met Ala Ser Met Thr Met Arg Val Leu Cys Val Ile Val Ala Cys Met

1 5 1015

Val Val Val Ala Pro Tyr Ala Glu Ala Leu Ser Cys Ser Glu Val Thr

202530

Ser Lys Leu Ala Pro Cys Phe Asn Tyr Leu Lys Ser Gly Gly Lys Val

354045

Pro Pro Ala Cys Cys Asp Gly Val Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Lys

505560

Thr Thr Pro Asp Arg Lys Thr Ala Cys Thr Cys Met Lys Ser Ala Tyr

65707580

Lys Ser Tyr Asn Gly Ile Asn Ala Asp Asn Ala Ala Gly Leu Pro Gly

859095

Lys Cys Gly Val Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Ser Leu Ser Thr Asp Cys

100 105 110

Asn Lys Val Lys

115

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工引物()

<400>4

tgtaaaacga cggccagt18

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工引物()

<400>5

caggaaacag ctatgac 17

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