杜梨中钠、氢逆向转运蛋白PbrNHX2及其在提高植物耐盐能力中的应用

摘要

本发明提供了杜梨中钠、氢逆向转运蛋白PbrNHX2及其在提高植物耐盐能力的应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了杜梨中钠、氢逆向转运蛋白、编码基因及用于克隆所述编码基因cDNA序列的引物对。所述的杜梨中钠、氢逆向转运蛋白、所述的编码基因或所述的引物对克隆的编码基因对在提高植物耐盐能力中的应用。构建烟草转化载体和秋子梨转化载体，获得的阳性植株苗进行盐处理，发现阳性植株苗的电导率较野生型显著降低，叶绿素含量较野生型显著升高，成活率比野生型显著提高，同时阳性植株苗比野生型有更强的抗ROS的能力。过表达的编码基因能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的耐盐性。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及杜梨中钠、氢逆向转运蛋白 PbrNHX2及其在提高植物耐盐能力中的应用。

背景技术

梨是世界上主栽的果树树种之一。梨树在中国的种植分布非常广泛，梨 主要产区布局为“三区四点”，从东北到广西，从云南到山东均有梨树的种植。 梨优势产区的布局与规划极大的促进了我国梨产业的发展，但正是因为分布 广泛，所以其很容易受到各种环境因素的的影响，如干旱，涝害，盐碱等。 因此，是否能培育出优良的抗逆新品种便成为了梨产业发展最至关重要的因 素。因为梨的育种存在：遗传背景复杂，童期长、自交不亲和、育种目标不 可确定性等原因，使得常规的育种方法已经远远不能满足现代梨种植的品种 需求。所以，如何在短时间内培育出能用于生产的梨抗逆新品种，便成为了 摆在育种学家面前的一道难题。随着生物技术与组织培养技术的快速进步， 植物的育种又有了新的途径，如组织培养技术育种，遗传转化育种，体细胞 杂交等方法。利用植物基因工程技术对植物的性状进行改良，使得梨抗逆新 品种的高效准确培育成为了可能。

盐胁迫对植物造成的伤害最开始表现为渗透胁迫，并且会持续在植物的 生长周期存在；紧接着是因为离子失调引起的毒害和营养元素的缺失；最后 导致氧化胁迫造成膜透性的改变及生理代谢的紊乱和有毒物质的积累，最终 致使植物的生长发育受到阻碍和影响，甚至死亡(Flowers,2004)。植物主要 通过离子平衡的重建、渗透调节、细胞内活性氧的清除来提高植物的耐盐。

根据现有的研究可知，植物中的NHX基因和植物的耐盐性有密切的关 系。NHX基因的功能是负责编码Na⁺/H⁺逆向转运蛋白，可以通过改变NHX>+/H⁺逆向转运蛋白的合成，从而改变植>+/H⁺逆向转运蛋白的功能主要是：>+的外排及限制Na⁺向地上部分的运输(Shi>+/H⁺逆向转运蛋白这时将被激活，Na⁺/H⁺逆向转运蛋白通过将Na⁺逆浓度梯度运输，将细胞内的Na⁺外排或者区隔化到>+外排和区隔>+/H⁺逆向转运蛋白还具有将K⁺区>+区隔化到液泡中的作用，通过将K⁺区隔化到液泡中，使细胞产生细胞质中产生K⁺降低的信号，从而激活质膜上高亲和K⁺的转>+转运体可以特异性地从低K⁺环境将更多的K⁺转运>+/H⁺。目前研究来看，盐胁迫能有效的>+/H⁺逆向转运蛋白的表达，提高植物的耐盐性>+，OH^-决定的，NHX蛋白在细胞内通过H⁺的转运，能>

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的首次发现是在哺乳动物当中，在植物当中则是在>+/H⁺逆向转运蛋白普遍存在，在常见的物种当中已经有了>+/H⁺向转运蛋白在动植物和真菌当中被发现，慢慢构成了一个>+/H⁺逆向转运蛋白，根据其定位不同分为两类，一>

Apse等，通过将拟南芥AtNHX1基因转入拟南芥中，获得了过表达的拟 南芥植株，该株系的耐盐性有很大提高(Apse et al,1999)。张等，将AtNHX1 基因转入番茄后发现，过表达的番茄植株能在200mM NaCl中正常生长 (Zhang,2001)。Ohta等将滨藜属中的NHX基因转入水稻中，也获得了具有耐 盐性的转基因水稻植株(Ohta et al.,2002)。通过过表达NHX基因的植株不仅 能改变植物的耐盐性，He等，在棉花的过表达AtNHX1基因植株中发现，在 200mmol/L的NaCl处理条件下，转基因植株的棉花产量不仅有提高，并且能 够产生更多更好的棉纤维(He et al.,2005)。有的NHX基因还能花中有特异性 表达，如牵牛花中的TvNHX1基因，主要在花中特异性表达，其可以通过调 节液泡的酸碱度来改变花色(Ohnishiet al.,2005)。NHX基因还有一定的增产 作用，玉米中ZmNHX1基因的超表达在增强植物耐盐性的同时，还提高了玉 米的产量(Li et al.,2010)。大多数物种中的NHX基因在非胁迫下亦能表达， 部分NHX基因表达在盐胁迫下根茎叶等组织中升高，还有报道表明基因受ABA、脱水、干旱、KCl、冷胁迫诱导表达(Rodriguez-Rosales et al.,2009)。 据研究显示，在拟南芥、番茄、水稻、大麦、大豆、碱蓬、盐角草等植物中 分离得到。

杜梨是梨产业中应用较广泛的一种砧木，极耐盐，是研究木本植物耐盐 性及克隆有关抗盐基因的理想材料。因此，克隆杜梨抗盐相关基因是抗盐基 因工程的关键和基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供杜梨中钠、氢逆向转运蛋白PbrNHX2 及其在提高植物耐盐能力的应用，所述PbrNHX2具有调控抗盐功能，有效提 高转基因植物的抗盐性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了杜梨中钠、氢逆向转运蛋白PbrNHX2，具有如序列表中 SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明提供了所述的杜梨中钠、氢逆向转运蛋白PbrNHX2的编码基因， 具有如序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种用于克隆所述编码基因cDNA序列的引物对，包括正 向引物和反应引物，所述正向引物具有如序列表中SEQ ID NO.3所示的核苷 酸序列；所述反向引物具有如序列表中SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

本发明提供了所述的杜梨中钠、氢逆向转运蛋白PbrNHX2、所述的编 码基因或所述的引物对在提高植物耐盐能力中的应用。

优选的，所述应用包括以下步骤：将所述的杜梨中钠、氢逆向转运蛋白 PbrNHX2或所述的编码基因或所述的引物对克隆的编码基因在植物中重组 表达，得到的重组植物具有耐盐性。

优选的，所述克隆的程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退 火90s，72℃延伸90s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。

优选的，所述植物包括烟草或秋子梨。

优选的，所述植物耐盐的盐浓度为不高于1000mmol/L。

优选的，所述植物耐盐的盐包括Na⁺或K⁺。

本发明提供了杜梨中钠、氢逆向转运蛋白PbrNHX2，具有如序列表中 SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。在所述PbrNHX2在盐敏感酵母突变体 AXT3中功能回补分析实验中表明，将PbrNHX2在盐敏感酵母突变体AXT3 中重组表达，表明所述PbrNHX2可部分回补盐敏感酵母突变体AXT3的耐 盐能力；同时测定了酵母中的含盐能力，结果显示：重组酵母含盐量显著低 于空白对照组酵母，含K⁺量要高于对照组酵母，说明所述PbrNHX2具有吸>+排Na⁺的功能，从而说明蛋白PbrNHX2具有抗盐的功能。

本发明提供了所述的杜梨中钠、氢逆向转运蛋白PbrNHX2的编码基因， 具有如序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。将杜梨实生苗在200mM NaCl溶液处理下，在相应的时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明提 供的所述编码基因的相对表达量，结果发现，在12h内随着NaCl溶液处理 实验的延长，所述编码基因的相对表达量逐渐增高，这表明所述编码基因响 应盐胁迫处理，具有调控抗盐功能。

本发明提供了所述的杜梨中钠、氢逆向转运蛋白PbrNHX2、所述的编 码基因或所述的引物对克隆的编码基因对在提高植物耐盐能力中的应用。通 过分别构建烟草转化载体和秋子梨转化载体，分别获得阳性植株苗进行盐处 理，结果发现：阳性植株苗的电导率较野生型(WT)显著降低，叶绿素含 量较野生型显著升高，且成活率比野生型提高了116％～129％，表明阳性植 株苗比野生型有更强的抗ROS的能力。转基因烟草的中的过氧化氢(H₂O₂)>2-)的含量活性均要比野生型要低，植株体内活性氧残留更>

附图说明

图1为一种本发明的技术流程示意图；

图2为实施例2中PbNHX2编码基因在盐，脱水和低温胁迫下的表达示 意图；其中，图2-A是所述编码基因在杜梨实生苗(未转基因)在200mM NaCl 溶液处理下，相应的时间点取样，采用实时定量PCR分析所述编码基因的 相对表达量；图2B是杜梨的实生苗室温下脱水不同时间点的表达模式；图 2-C是杜梨的实生苗在4℃处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分 析本发明的基因相对表达量；

图3为实施例3中PbrNHX2编码基因亚细胞定位，其中图3-A为GFP 基因在明场、紫外线、光下的成像；图3-B为PbrNHX2编码基因在明场、 紫外、光下的成像；

图4为实施例4中PbrNHX2在盐敏感酵母突变体AXT3中功能回补分 析结果；

图5为实施例5中转PbrNHX2烟草植株的获得，图5-a为载体构建， 图5-b为PbrNHX2转烟草的整个流程图，图5-c为PCR鉴定转基因植株， 图5-d为RT-PCR鉴定转基因植物的超表达分析，图5-e为Western blotting分 析超表达植株的蛋白表达水平；

图6为实施例6中PbrNHX2转化秋子梨及植株再生过程示意图，其中 图6-A是转化后的照片；图6-B是在筛选培养基上生长30天的材料；图6-C 是再生芽诱导生根；图6-D是转基因植物移在土里生长30天的照片；图6-E 是利用基因特异引物进行PCR鉴定烟草后T0代转基因植株，其中M： Marker，+：质粒，-：野生型植株，1-8：转基因株系；图6-F为实时定量PCR分析秋子梨不同转基因株系中的PbrNHX2的编码基因的表达量；

图7为实施例7中转PbrNHX2的编码基因株系及野生型(WT)氯化钠 处理前后的表型和生理指标测定，其中图7-A是45天大的烟草植株在300 mM氯化钠处理20天前的表型；图7-B是45天大的烟草植株在300mM氯 化钠处理20天后的表型；图7-C是30天大的烟草植株在200mM盐溶液处 理4天前的表型；图7-D是30天大的烟草植株在200mM盐溶液处理4天 的表型；图7-E是30天大的烟草植株在200mM盐溶液处理4天的成活率 统计结果，图7-F是30天大的烟草植株在200mM盐溶液处理4天的电导 率测定结果，图7-G是45天大的烟草植株在300mM氯化钠处理25天后的 表型，图7-H是45天大的烟草植株在300mM氯化钠处理25天后的叶绿素 测定，图7-I是30天大的烟草植株在200mM盐溶液处理4天的叶绿素提取；

图8为实施例8中PbrNHX2转基因秋子梨株系(OE2，OE6和 OE8)及野生型植株(WT)500mM氯化钠浇15天的表型和生理指 标测定结果，其中图8-A是500mM氯化钠浇15天的表型，图8-B 是500mM氯化钠浇15天电导率测定，图8-C～图8-D是500mM氯 化钠浇15天叶绿素测定(图8-C)及叶绿素提取(图8-D)；

图9为实施例9中转PbrNHX2的编码基因烟草和秋子梨组织化 学染色分析H₂O₂和O^2-积累，图9-A和图9-B是45天大的烟草植株>2O₂(图9-A)和O^2-(图9-B)进行染色，图9-C为转基因烟

具体实施方式

本发明提供了杜梨中钠、氢逆向转运蛋白PbrNHX2，具有如序列表中 SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。所述PbrNHX2编码542个氨基酸，等电 点为8.49，分子量为60.09KDa。所述PbrNHX2具有吸K⁺排Na⁺的功能，同>

本发明提供了所述的杜梨中钠、氢逆向转运蛋白PbrNHX2的编码基因， 具有如序列表中SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。所述编码基因的来源优选 采用克隆的方法获得。

本发明提供了一种用于克隆所述编码基因cDNA序列的引物对，包括正 向引物和反应引物，所述正向引物具有如序列表中SEQ ID NO.3所示的核苷 酸序列；所述反向引物具有如序列表中SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。所 述引物对的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的生物合成公司合成即 可。在本发明实施例中，所述引物对委托南京一道生物科技有限公司合成。

本发明提供了所述的杜梨中钠、氢逆向转运蛋白PbrNHX2、所述的编 码基因或所述的引物对克隆的编码基因对在提高植物耐盐能力中的应用。

在本发明中，所述应用优选包括以下步骤：将所述的杜梨中钠、氢逆向 转运蛋白PbrNHX2或所述的编码基因或所述的引物对克隆的编码基因在植 物中重组表达，得到的重组植物具有耐盐能力(见图1)。

在本发明中，所述克隆的程序优选为94℃预变性3min；94℃变性30s， 58℃退火90s，72℃延伸90s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。 所述编码基因优选以pMV-PbrNHX2重组载体的形式转化入植物中。本发明 对所述pMV-PbrNHX2重组载体的构建方法没有特殊限制，采用本领域所熟 知的构建方法即可。

所述的编码基因或所述的引物对克隆的编码基因在植物中重组表达的 方法优选采用农杆菌介导遗传转化的方法。本发明对所述农杆菌介导遗传转 化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的常规方法即可。所述植物优选 包括烟草或秋子梨。

在本发明中，所述检验重组植物的耐盐能力前，优选还包括阳性转基因 植株的筛选。所述阳性转基因植株的筛选方法优选采用PCR扩增的方法进 行。所述筛选时，PCR扩增用引物的正向引物具有如序列表中SEQ ID NO.3 所示的核苷酸序列；所述PCR扩增用引物反向引物具有如序列表中SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。所述PCR扩增的反应程序如下：

步骤94℃58℃延伸温度4℃循环数步骤13min1步骤230s30s55s(58℃)3590s(60℃)1步骤310min(72℃)步骤430min

所述PCR扩增用PCR反应体系如下：

反应组分用量(μl)模板DNA1PCR缓冲液2dNTDMix(2.5mmol/L)1.6正向引物1反向引物1TaqDNA聚合酶(5U)0.2无核酶水13.2

所述PCR扩增结束后，如果待检测植株系能扩增出预期大小的片段 (1626bp)，这表明它们为阳性转基因株系。

在本发明中，将得到的阳性转基因株系进行盐处理，测定处理后得到的 阳性转基因株的表型、生理指标和活性氧，以验证其耐盐功能。所述活性氧 的测定方法优选为用DAB和NBT组织化学染色法对植株叶片H₂O₂和O^2-积累情况进行分析(根据染色的深浅及程度)，用肉眼观察并拍。测定的活>2O₂)和超氧阴离子(O^2-)。通过测定活性氧含量>2O₂和O^2-)积累，从而保证细胞损伤更小。

在本发明中，电导率测定和叶绿素的提取和测定方法没有特殊限制，采 用本领域所熟知的提取和测定方法即可。分析电导率和叶绿素的测定结果发 现：阳性植株苗的电导率较野生型(WT)显著降低，叶绿素含量较野生型 显著升高，且成活率比野生型提高了116％～129％，表明阳性植株苗比野生 型有更强的抗ROS的能力。

在本发明中，所述植物耐盐的盐浓度优选为不高于1000mmol/L。所述 植物耐盐的盐优选包括Na⁺或K⁺。所述植物优选包括烟草或秋子梨。

下面结合实施例对本发明提供的杜梨中钠、钾、氢逆向转运蛋白 PbrNHX2及其在提高植物耐盐能力的应用进行详细的说明，但是不能把它们 理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

杜梨PbNHX2基因全长cDNA的克隆

本课题组前期采用高效的酵母表达体系，从杜梨中筛选到一个钠氢逆向 转运蛋白PbrNHX2，根据PbrNHX2基因的序列和primer premier 5.0设计引 物，用RT-PCR方法从杜梨上扩出其全长。详细步骤如下：取杜梨RNA 1μg 经1U的DNase I 37℃处理30min后立即放入冰上，加入1μl 50mM EDTA 65℃处理10min后立即置于冰上。cDNA第一链的合成参照TOYOBO反转 录试剂盒的操作手册进行。所得的第一链cDNA用于PbrNHX2基因的扩增。 PCR按以下程序完成：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火90s， 72℃延伸90s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。扩增完成后产生 单一条带的PCR产物，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒按照使 用说明提取步骤，回收特异目的条带。

回收纯化的溶液与pMD19-T载体进行连接，连接体系中基因与载体的 摩尔比为3:1连接。反应总体积是10μl，其中5μl buffer，4.5μl的PCR纯 化的产物，0.5μl载体。16℃连接过夜，采用热击法转化到大肠杆菌感受态 DH5α中，以目的基因序列引物进行PCR验证并测序(由上海英潍捷基公司 完成)。

生物信息学分析cDNA序列显示，PbNHX2基因全长1626bp，包括编码 阅读框编码542个氨基酸，等电点为8.49，预测的分子量为60.09KDa。 BLASTX分析该序列与已知的(所有已发表的文献和数据库)的植物序列高 度同源。氨基酸序列对比显示，推导的PbrNHX2基因的氨基酸序列与报道的 胡杨PeNHX2、珠美海棠MzNHX1、苹果MdNHX2和MdNHX1、玉米ZmNHX2、拟南芥AtNHX1和AtNHX2序列高度同源。ExPASy分析表明编码 的氨基酸PbrNHX2有一个液泡膜定位信号。根据氨基酸的多序列比对构建的 进化树来看，梨PbrNHX2家族蛋白同苹果MdNHX2亲缘关系最近，MdNHX1 次之，同拟南芥AtNHX5和AtNHX6进化上离得最远。

实施例2

不同逆境条件处理下PbrNHX2基因的qRT-PCR分析和PbrNHX2基因的 亚细胞定位

为了分析杜梨中PbrNHX2基因对低温，高盐和脱水的响应模式，使用 Real-timePCR技术对PbrNHX2基因的表达模式进行分析。采用CTAB法提取 RNA，DNA第一链的合成参照TOYOBO反转录试剂盒的操作手册进行。在 20μl的反应体系中有：10μl 2×Mix，0.1μlcDNA，5μl引物(以ubiqutin为内 参引物(SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)，长度为208)，4.9μl水。定量PCR的 程序如表1所示：

表1 定量PCR程序

结果见图2。图2为一种本发明的PbNHX2编码基因在盐，脱水和低温胁 迫下的表达示意图，其中，图2-A是所述编码基因在杜梨实生苗(未转基因) 在200mM NaCl处理下，相应的时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明 基因的相对表达量；图2-B是杜梨的实生苗室温下脱水不同时间点的表达模 式；图2-C是杜梨的实生苗在4℃处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR 分析所述编码基因的相对表达量。由图2-A可以看出，随着处理时间的延长， 在12h内编码基因的表达量呈现递增的趋势，12个小时后表达量开始下降。 这表明所述编码基因受盐胁迫的影响，从而响应抗盐机制，使杜梨实现耐盐 功能。

实施例3

PbrNHX2的编码基因的亚细胞定位

根据PbrNHX2的编码基因的核苷酸序列和pJIT166-GFP载体图，在基 因序列前后分别加入SalI和BamHI酶切位点。将测序结果正确的目的基因 提取质粒作为模板，用加入酶切位点的引物(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8) 扩增，所用PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火1min， 72℃延伸1min 30s，35个循环；72℃延伸10min。基因3′去除了终止密码 子TAG，目的是让基因与GFP融合。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，利 用凝胶试剂盒回收目的条带。回收纯化的扩增片段克隆到pMD19-T载体中， 转化到大肠杆菌感受态DH5α中。将转化后的菌液用PCR检测，PCR鉴定呈 阳性的菌液送去测序，提取测序结果正确菌液和pJIT166-GFP载体的质粒。 将两者均用SalI和BamHI进行双酶切，分别纯化回收酶切过后的产物 PbrNHX2基因和pJIT166-GFP载体。两者经T4-DNA连接酶连接，16℃过 夜，转化大肠杆菌感受态DH5α，将得到的重组载体命名为pJIT166-GFP- PbrNHX2。

采用原生质体转化的试剂和方法，所用试剂：拟南芥原生质体酶解液(提 前一天晚上配好，4℃保存)：0.4M甘露醇；1％纤维素酶；0.1％离析酶； 5mM MES；0.1％果胶酶。

方法：在55℃水浴中加热10min，使各种蛋白酶失活，同时增强纤维 素酶等的溶解性，然后冷却到室温，再加入以下两种试剂：0.15％BSA和8 mM CaCl₂；MaMg溶液：0.4M甘露醇；0.1％MgCl₂；4mM>2；>2溶解，如不溶解的话，可以放到65℃助溶。将两者混到一起，完全混>

结果见图3。图3是所述PbrNHX2的编码基因亚细胞定位，其中图3-A， GFP基因(对照)在明场(图右)、紫外线(UV)光(图左)下的成像，图 (中)为二者叠加后的成像；图3-B，PbrNHX2基因在明场(右)、UV光(左) 下的成像，图(中)为二者叠加后的成像。根据细胞定位图能够得到蛋白 PbrNHX2定位在液泡膜部位。

实施例4

酵母菌株AXT3(ean1::HIS3::ena4,nha1::LEU2,nhx1::TRP1)(Na⁺转运蛋>600＝1.0，>1、10²、和10³倍的酵母培养物打点至分>+量要高于空载，说明这个基因具有吸K⁺排Na⁺的功能(见>

实施例5

烟草的遗传转化

1.植物转化载体构建

根据pMV载体(切除GUS基因的植物二元转化载体pBI121中)的多 克隆位点和PbrNHX2基因的编码区序列，按照一般设计引物的原则用primer primier5.0软件设计出扩增基因整个编码区的上、下游PCR引物(该引物对 就是扩增PbrNHX2基因cDNA序列的引物对)。以PbrNHX2基因的克隆子 为模板进行PCR扩增。PCR扩增的退火温度为58℃，PCR反应体系及扩增 程序与PbrNHX2基因克隆相同。在扩增过后进行双酶切，双酶切体系总体 积为20μl，其中：PCR的纯化产物10μl，10×G缓冲液2μl，KpnI及SalI 各1μl，双蒸水6μl。酶切在37℃中进行，酶切过夜后做胶纯化回收。pMV 载体双酶切反应体积为20μl，其中：有pMV的载体质粒8μl，10×M缓冲 液2μl，KpnI及XhoI各1μl，加双蒸水8μl。同样放置于37℃酶切过夜后纯化回收。在连接反应体系中加入PbrNHX2基因与载体pMV的摩尔比为 3:1，反应总体积为10μl。其中含有：10×buffer 1μl，T4DNA连接酶1μl， 双酶切回收的PbrNHX2基因4ul，双酶切回收的pMV载体产物2μl，双蒸 水2μl，在16℃反应14-16h得到连接产物。连接产物转化大肠杆菌DH5α， 在含有50mg/L的卡那霉素的LB固体平板中培养。将筛选出的阳性克隆， 调点后摇菌，抽提质粒进行酶切及PCR鉴定，测序确定没有编码框突变， 获得含有插入目的片段的重组克隆，将其命名为pMV-PbrNHX2重组载体， 应用冻融法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》第三版， 科学出版社，2002年)将重组载体pMV-PbrNHX2导入到农杆菌GV3101 中。

2.农杆菌介导的烟草遗传转化步骤如下：

(1)农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了 卡那霉素50mg/L的LB的平板上划线，刮取划线菌斑，加入液体MS基本 培养基中，28C°转min振荡培养，待菌液浓度达到OD＝0.3-0.8时作浸染。

(2)浸染：取未转基因的烟草叶片，切成0.5×0.5cm大小，然后放入 制备好的根癌农杆菌菌液中，浸泡8-10min，期间不断振荡。

(3)共培养：取浸染后的烟草叶片，无菌滤纸吸干上面的的菌液，然 后接种于共培养培养基上(叶背面向下)，25℃暗培养3d。

(4)筛选培养：经共培养3d后的烟草叶片，用500mg/L浓度的头孢 霉素溶液洗一遍，然后无菌水冲洗次3-5次，再转移入添加了100mg/L卡那 霉素和500mg/L头孢霉素的蹄选培养基中。

(5)生根培养：待蹄选培养基上的不定芽长到1cm左右时，切下并转 入添加了100mg/LKm和500mg/L的Cef生根培养基上。

(6)烟草苗转入土培：待生根后的转化苗长满培养瓶，由生根培养基 中取出，用自来水洗净转化苗上的培养基，并栽植于灭菌的营养土中。烟草 转化苗所用培养基见表2。

表2 烟草转化苗所用培养基配方

3.转基因阳性苗的的筛选

按照上述方法得到转PbrNHX2基因烟草，把每株烟草提取DNA，设计 引物基因内引物进行PCR扩增鉴定阳性苗。

3.1烟草叶片DNA提取

(1)取适量的烟草幼嫩叶片放入1.5mL离心管中，加液氮，充分研磨 成粉末状；然后加入700μl 65℃预热的DNA提取缓冲液十六烷基三乙基溴 化铵(简称CTAB，配方：100mMTris-HCl(pH8.0)，1.5MNaCl，50mM EDTA(pH＝8.0)溶液加1％聚乙烯吡咯烷酮，2％(体积)CTAB，65℃水浴充 分溶解备用，用前在65℃水浴预热后，加入1～4％(体积)巯基乙醇，混匀)，

(2)65℃温浴60-90min，隔15min取出上下轻轻颠倒混匀；10000g 常温离心10min；取上清(可直接倒入离心管内)，加600μl氯仿异戊醇(氯 仿：异戊醇体积比为24：1)，颠倒混匀抽提3min；

(3)10000g离心15min；取上清450μl(注意勿吸取蛋白层，导致蛋 白污染)，加入900μl-20℃预冷无水乙醇，34μl 5MNaCl，颠倒混匀后， -20℃冰冻30min。

(4)10000g，离心10min；弃上清后，用1mL 75％的乙醇洗涤3次后， 空管离心一分钟，放到超净工作台吹半小时，直至DNA呈无色透明状，加 适量双蒸水，放置于37℃培养箱中溶解40min，做胶检测。

3.2阳性转基因植株检测

采用引物基因特异引物进行PCR扩增。反应程序及体系分别见表3、表 4。采用35S基因右侧内引物(SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10)进行PCR， 选取的转基因株系中，有转基因株系能扩增出预期大小的片段，表明这它们 为阳性转基因株系。

表3 PCR反应程序

步骤94℃58℃72℃4℃循环数步骤13min1步骤230s30s55s35步骤390s1步骤410min步骤530min

表4 PCR反应体系

反应组分用量(μl)模板DNA1PCRBuffer2dNTDMix(2.5mmol/L)1.6右侧正向引物1左侧反向引物1TaqDNA聚合酶(5U)0.2无核酶水13.2

通过农杆菌介导在烟草中表达PbrNHX2。通过分子遗传分析，鉴定得到了 单拷贝纯合插入、从T1-T2代均稳定表达PbrNHX2的转基因烟草，因此表型性 状能够稳定遗传。插入位点分析证明分别转PbrNHX2转基因材料的表型变化不 是由转基因操作影响其他基因而引起的。因此该转基因材料为本项目的研究提供 了材料保障。载体构建如图5-a，转基因烟草整个流程见图5-b，利用RT-PCR鉴 定转基因植物如图5-c(35S引物+基因下游引物)，利用RT-PCR及Western blotting 进一步鉴定TG17和TG20是两个超表达系(图5-d和图5-e)。

实施例6

转基因秋子梨植株的超表达分析

按照实施例5的方法构建转基因秋子梨植株。提取移栽成活的8株转基 因阳性苗的RNA，通过跑胶检测其结构完整，如图6，利用nanodrop测定 其浓度后(浓度均在200-600ng/ul)，将RNA总量调整为3ug后进行反转录 成cDNA，再用梨的Tublin作为内参进行扩增。Tublin引物核苷酸序列为：

Tublin正向引物：5’-TGGGCTTTGCTCCTCTTAC-3’(SEQ ID NO.11)

Tublin反向引物：5’-CCTTCGTGCTCATCTTACC-3’(SEQ ID NO.12)

用Tublinn扩增出来的条带亮度均一致，说明反转录的cDNA浓度相同， 后再用PbrNHX2特异引物作为模板扩增目的条带，PbrNHX2引物核苷酸序 列为：

正向引物：5’-ATGGCTGTTGCACATTTGAGCATGATG-3’(SEQ ID NO.3)

反向引物：5’-TTGCCACTGAACGTTGTTGTCCCGTTC-3’(SEQ ID NO.4)。

根据PbrNHX2特异引物扩增出来的目的条带的亮度大小，可以判断出 PbrNHX2基因在阳性转基因梨中的表达量，选择亮度高的2,6和8，即表达 量高的三个超表达株系命名OE2，OE6和OE8作为单独的转基因株系，然 后分别扩繁。

结果见图6所示。图6为PbrNHX2转化秋子梨及植株再生过程示意图， 其中图6-A是转化后的照片；图6-B是在筛选培养基上生长30天的材料； 图6-C是再生芽诱导生根；图6-D是转基因植物移在土里生长30天的照片； 图6-E是利用基因特异引物进行PCR鉴定烟草后T0代转基因植株，其中M： Marker，+：质粒，-：野生型植株，1-8：转基因株系；图6-F为实时定量 PCR分析秋子梨不同转基因株系中的PbrNHX2编码基因的表达量。图6说 明了梨转PbrNHX2基因植株的PbrNHX2基因超表达的。

实施例7

PbrNHX2转基因抗性植株抗性鉴定

1.转基因烟草植株的抗盐分析

为了鉴定PbrNHX2转基因烟草是否和抗盐胁迫有关，将对照系和转基 因系进行短时间的盐胁迫和长期的盐逆境处理。同一批次收到的PbrNHX2 转基因系(TG17，TG20)烟草种子和野生型(WT)种子灭菌处理后分别播 于MS筛选培养基和常用的MS无抗培养基上，等发芽后约3天将其移栽到 土里进行培养。取不同苗龄的转基因植株进行盐处理，观察其处理后的表型， 统计成活率，测定电导率及叶绿素等。

图7为转PbrNHX2的编码基因株系及野生型(WT)氯化钠处理前后的 表型和生理指标测定，其中图7-A是45天大的烟草植株在300mM氯化钠 处理20天前的表型；图7-B是45天大的烟草植株在300mM氯化钠处理20 天后的表型；图7-C是30天大的烟草植株在200mM盐溶液处理4天前的 表型；图7-D是30天大的烟草植株在200mM盐溶液处理4天的表型；图 7-E是30天大的烟草植株在200mM盐溶液处理4天的成活率统计结果，图 7-F是30天大的烟草植株在200mM盐溶液处理4天的电导率测定结果，图 7-G是45天大的烟草植株在300mM氯化钠处理25天后的表型，图7-H是 45天大的烟草植株在300mM氯化钠处理25天后的叶绿素测定，图7-I是 30天大的烟草植株在200mM盐溶液处理4天的叶绿素提取。上述指标的测 定均为评价其抗盐性的重要衡量指标，图7中能够得到PbrNHX2这个基因 增强了转基因植株的抗盐性。

2.转基因秋子梨的抗盐分析

为了鉴定PbrNHX2转基因秋子梨是否和抗盐胁迫有关，将对照系和转 基因系进行盐逆境处理。将PbrNHX2转基因秋子梨株系(OE2，OE6和OE8) 及野生型植株(WT)500mM氯化钠浇15天的表型和生理指标测定。

结果如图8所示。图8为实施例8中PbrNHX2转基因秋子梨株 系(OE2，OE6和OE8)及野生型植株(WT)500mM氯化钠浇15

3、组织化学染色分析H₂O₂和O^2-积累

在转基因株系中(烟草/秋子梨)，电导率较低和成活率高表明他们可能 具有比WT有更强的抗ROS的能力。那么通过鉴定植株中ROS的积累量便 成为必要。用DAB和NBT组织化学染色法对植株叶片进行染色，分别用 来检测过氧化氢(H₂O₂)及超氧阴离子(O^2-)的含量。

结果入图9所示。图9为转PbrNHX2基因烟草和秋子梨组织化 学染色分析H₂O₂和O^2-积累，图9-A和图9-B是45天大的烟草植株>2O₂(图9-A)和O^2-(图9-B)进行染色，图9-C为转基因烟>2O₂(图9-D)和O^2-(图9-E)进行染色，图9-F>2O₂和>2-)积累。同样的结果在转基因秋子梨植物中得到类似的结果(如>

4、综合分析表明，将该基因转入烟草和秋子梨中后鉴定其功能，发现 转基因超表达株系与对照野生型相比抗盐能力有了很大提升。转基因烟草的 中的过氧化氢(H₂O₂)及超氧阴离子(O^2-)的含量活性均要比野生型要低，>

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 杜梨中钠、氢逆向转运蛋白PbrNHX2及其在提高植物耐盐能力中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 542

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Val Ala His Leu Ser Met Met Ile Ser Lys Leu Gln Asn Val

1 5 1015

Ser Thr Ser Asp His Ser Ser Val Val Ser Met Asn Leu Phe Val Ala

202530

Leu Leu Leu Ala Cys Ile Val Ile Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg

354045

Trp Val Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Leu Ile Gly Leu Cys Thr Gly

505560

Val Val Ile Leu Leu Ile Ser Arg Gly Arg Ser Ser His Leu Leu Val

65707580

Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Pro Pro Ile Ile Phe

859095

Asn Ala Gly Phe Gln Val Lys Lys Lys Gln Phe Phe Val Asn Phe Met

100 105 110

Thr Ile Val Met Phe Gly Ala Ile Gly Thr Leu Val Ser Cys Thr Ile

115 120 125

Ile Ser Leu Gly Ala Thr Gln Phe Phe Lys Lys Leu Asp Ile Gly Thr

130 135 140

Leu Glu Leu Gly Asp Phe Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ala Ala Thr

145 150 155 160

Asp Ser Val Cys Thr Leu Gln Val Leu Asn Gln Asp Glu Thr Pro Leu

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser

180 185 190

Val Val Leu Phe Asn Ala Ile Gln Ser Phe Asp Leu Thr His Ile Asp

195 200 205

Ser Ser Ile Ala Leu His Phe Met Gly Asn Phe Leu Tyr Leu Phe Phe

210 215 220

Ala Ser Thr Met Leu Gly Val Phe Ala Gly Leu Leu Ser Ala Tyr Ile

225 230 235 240

Ile Lys Lys Leu Tyr Phe Gly Ser His Ser Thr Asp Arg Glu Val Ala

245 250 255

Leu Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Ile Leu Ala Glu Leu Phe

260 265 270

Tyr Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile Val Met Ser

275 280 285

His Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg Thr Thr Lys His

290 295 300

Ala Phe Ala Thr Leu Ser Phe Val Ala Val Glu Thr Phe Ile Phe Leu

305 310 315 320

Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Ile Glu Lys Trp Arg Phe Val Ser

325 330 335

Asp Ser Pro Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ser Ile Leu Leu Gly Leu

340 345 350

Val Met Leu Gly Arg Ala Ala Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser

355 360 365

Asn Leu Thr Lys Lys Asn Gln Arg Asp Lys Ile Ser Leu Arg Gln Gln

370 375 380

Val Ile Ile Trp Trp Ala Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Met Ala

385 390 395 400

Leu Ala Tyr Asn Gln Phe Thr Arg Ser Gly His Thr Gln Leu Arg Ala

405 410 415

Asn Ala Ile Met Ile Thr Ser Thr Ile Thr Val Val Leu Val Ser Thr

420 425 430

Val Val Phe Gly Leu Met Thr Lys Pro Leu Ile Arg Phe Leu Leu Pro

435 440 445

His Ser Pro Lys Gln Thr Thr Ser Met Leu Ser Ser Glu Pro Thr Ser

450 455 460

Pro Lys Ser Val Ile Val Pro Leu Leu Gly Gln Asp Ser Val Asp Asp

465 470 475 480

Leu Val Gly Gln Asp Ile Arg Arg Pro Ala Ser Leu Arg Asp Leu Leu

485 490 495

Thr Thr Pro Thr His Thr Val His Arg Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Asn

500 505 510

Ala Phe Met Arg Pro Val Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe Val

515 520 525

Pro Gly Ser Pro Thr Glu Arg Asp Asn Asn Val Gln Trp Gln

530 535 540

<210> 2

<211> 1629

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctgttg cacatttgag catgatgatc tcaaagttac aaaatgtatc cacttcggac 60

cactcctccg tggtttcgat gaacctattt gtggcgctac ttttagcttg tattgtgatc 120

ggacatcttc tcgaggagaa tcgatgggtg aatgagtcga tcaccgccct tttgattggg 180

ctttgcaccg gagtagttat tcttctgatc agtagaggaa gaagctcgca tcttttggtt 240

ttcagtgaag atcttttctt tatatacctc ttgccgccta ttatttttaa tgccgggttc 300

caggtgaaaa agaagcagtt ctttgttaac ttcatgacca ttgtaatgtt tggtgctatt 360

ggtacattag tatcctgcac tatcatatca ttaggtgcta cacaattctt taagaagttg 420

gacattggaa ctctggagtt gggggacttc cttgcaattg gtgcaatatt tgctgcaacg 480

gattctgttt gcacgttgca ggtgctcaat caggatgaga cacctttact ctacagtctt 540

gtatttggag agggtgtcgt taacgatgcg acatctgtgg tccttttcaa tgctattcag 600

agctttgatc tcacccacat tgattccagt attgctttgc actttatggg caacttctta 660

tatttgtttt tcgcaagcac tatgctagga gtgtttgcag ggctgcttag tgcttacatt 720

atcaaaaagc tttattttgg aagccactct acggatcgtg aggttgctct tatgatgctc 780

atggcatact tgtcatatat actggctgaa ttattctatt tgagtggcat tctcactgtt 840

ttcttttgtg ggatcgtgat gtcgcattac acttggcaca atgtgactga gagttcaaga 900

gttacgacca agcatgcttt cgcaaccttg tcatttgttg ccgaaacatt tatcttcctt 960

tatgttggta tggatgcctt ggacattgaa aagtggcgat ttgtaagtga cagtcctgga 1020

acatcagtgg cagtgagttc aatactgcta ggtcttgtta tgcttggaag agcagctttc 1080

gtcttcccct tatcattctt gtcgaactta acaaagaaaa accaacgtga taaaattagc 1140

ctccggcagc aagttataat atggtgggct ggtctcatga gaggtgctgt gtctatggca 1200

cttgcttaca atcagtttac aaggtcaggc cacacgcaat tgcgagcaaa tgcaatcatg 1260

atcactagca cgataactgt tgttcttgtc agcacagtgg ttttcggatt gatgacgaaa 1320

cctcttataa ggttcttgct gcctcattca ccaaaacaaa caaccagcat gttgtcgtca 1380

gaaccaacct ctccaaaatc agtcattgtt ccacttctag ggcaggattc tgtagatgat 1440

cttgttggcc aagatattcg acggccggcc agcttacgcg atcttctgac aactccaacg 1500

cacacagtcc atcgctattg gcgtaagttt gacaacgcat tcatgcgtcc agtgtttgga 1560

ggccggggtt ttgttccctt tgttcccggg tcaccaactg aacgggacaa caacgttcag 1620

tggcaatga 1629

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctgttg cacatttgag catgatg 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgccactga acgttgttgt cccgttc 27

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgggctttgc tcctcttac 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccttcgtgct catcttacc 19

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcgacatgg ctgttgcaca tttgagcatg atg 33

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggatccttgc cactgaacgt tgttgtcccg ttc 33

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgccgtaaag actggcgaac agttcat 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttgccactga acgttgttgt cccgttc 27

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgggctttgc tcctcttac 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccttcgtgct catcttacc 19