日本毛连菜提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用

摘要

本发明提供一种日本毛连菜提取物在制备α‑葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用，所述日本毛连菜提取物为式一化合物，结构如下，

说明书

技术领域

本发明属毛连菜提取物应用领域，特别涉及一种日本毛连菜提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用。

背景技术

糖尿病是一种代谢性、终身性疾病，其并发症严重威胁着人类的健康。糖尿病是由于胰岛素分泌不足等原因而引起蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列的代谢紊乱，其中以高血糖为主要标志。目前治疗糖尿病的主要手段是抑制血糖升高。α-葡萄糖苷酶抑制剂可以推迟淀粉、蔗糖等糖类物质在消化道内的转化和吸收，减少肾脏负担，控制饭后血糖急剧上升，使血糖浓度波动较小，因此开发出新的α-葡萄糖苷酶抑制剂可以有效控制血糖。

日本毛连菜(Picris japoncia Thunb.)为菊科植物，又名抢刀菜。其具有清热、消肿止痛作用。民间常口服日本毛连菜煎液防止糖尿病；现有技术公开日本毛连菜水提物具有显著的降血糖作用，并且公开其他部位提取物的降糖效果明显低于日本毛连菜水提物；基于以上研究，对日本毛连菜其他部分的降血糖效果有待进一步研究。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明在日本毛连菜提取物中发现一种新的具有降血糖作用的化合物，并具体公开了该化合物的制备方法。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供一种日本毛连菜提取物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物中的应用，所述日本毛连菜提取物为式一化合物，结构如下：

进一步的改进，所述日本毛连菜提取物在制备预防或治疗由α-葡萄糖苷酶引起的糖尿病药物中的应用。

进一步的改进，式一化合物是由日本毛连菜中提取得到的。

本发明另一方面提供一种日本毛连菜提取物的提取方法，该提取方法包括如下步骤：

A：称取日本毛连菜，粉碎，于超声仪中，用石油醚超声处理三次，每次处理的条件为：日本毛连菜和石油醚的固液比为1:7，超声功率120-130W，超声时间5-6min，超声温度为2-5℃，过滤，获得滤渣；

B：滤渣加浓度为95％乙醇溶液回流提取三次，第一次加12.5倍量乙醇溶液，回流2.5h，第二次加8倍量乙醇溶液，回流2h，第三次加6.5倍量乙醇溶液，回流2h，合并滤液，过滤，回收乙醇，得乙醇提取物；

C：将乙醇提取物通过柱层析洗脱，重结晶制得日本毛连菜提取物。

进一步的改进，步骤C柱层析具体方法为：

C-1：将乙醇提取物用乙醇溶解，上硅胶柱，以洗脱液进行洗脱，先以环己烷洗脱，弃去洗脱液；再以体积比为17:1的环己烷和乙酸乙酯的混合液洗脱，弃去洗脱液；再以体积比为10:1的环己烷和乙酸乙酯的混合液洗脱，弃去洗脱液；再以8.5:1的环己烷和乙酸乙酯的混合液进行洗脱，收集洗脱液；浓缩，得粗提物。

在以环己烷进行洗脱过程中可以根据需要洗脱10-20个柱体积，17:1的环己烷和乙酸乙酯混合液进行洗脱时，可以根据需要洗脱20-30个柱体积；10:1的环己烷和乙酸乙酯的混合液进行洗脱时，用TLC时刻监控着目标物的出现，当有目标物点时，弃去洗脱液，直接用体积比为8.5:1的环己烷和乙酸乙酯的混合液进行洗脱，收集洗脱液，浓缩。

进一步的改进，步骤C重结晶具体方法为：

C-2：将粗提物用重结晶溶剂进行重结晶，重结晶溶剂为体积比为1：3:12的丙酮、二氯甲烷和石油醚的混合液。

进一步的改进，粗提物和重结晶溶剂的固液比为1:16。

进一步的改进，重结晶具体条件为：将粗提物置于丙酮和二氯甲烷的混合液中，加热至50℃，保持此温度，滴加石油醚，缓慢冷却至室温，静置，过滤，收集沉淀，即得。

有必要的前提下，经过重结晶的物质还需要经过反相HPLC制备色谱(C18，250mm×10mm，5μm)的分离。

本发明提在日本毛连菜提取物中发现一个新的具有抑制α-葡萄糖苷酶的化合物，该化合物可以用于制备α-葡萄糖苷酶抑制剂药物，由此可以预防或治疗由α-葡萄糖苷酶引起的糖尿病，效果好于日本毛连菜水提物和醇提物，与市售的降糖药相当。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1一种日本毛连菜提取物的提取方法

该提取方法包括如下步骤：

A：称取日本毛连菜，粉碎，于超声仪中，用石油醚超声处理三次，每次处理的条件为：日本毛连菜和石油醚的固液比为1:7，超声功率120W，超声时间5min，超声温度为2℃，过滤，获得滤渣；

B：滤渣加浓度为95％乙醇溶液回流提取三次，第一次加12.5倍量乙醇溶液，回流2.5h，第二次加8倍量乙醇溶液，回流2h，第三次加6.5倍量乙醇溶液，回流2h，合并滤液，过滤，回收乙醇，得乙醇提取物；

C：将乙醇提取物通过柱层析洗脱，重结晶制得日本毛连菜提取物。实施例2一种日本毛连菜提取物的提取方法

该提取方法包括如下步骤：

A：称取日本毛连菜，粉碎，于超声仪中，用石油醚超声处理三次，每次处理的条件为：日本毛连菜和石油醚的固液比为1:7，超声功率130W，超声时间6min，超声温度为5℃，过滤，获得滤渣；

B：滤渣加浓度为95％乙醇溶液回流提取三次，第一次加12.5倍量乙醇溶液，回流2.5h，第二次加8倍量乙醇溶液，回流2h，第三次加6.5倍量乙醇溶液，回流2h，合并滤液，过滤，回收乙醇，得乙醇提取物；

C：将乙醇提取物通过柱层析洗脱，重结晶制得日本毛连菜提取物。

实施例3一种日本毛连菜提取物的提取方法

该提取方法包括如下步骤：

A：称取日本毛连菜，粉碎，于超声仪中，用石油醚超声处理三次，每次处理的条件为：日本毛连菜和石油醚的固液比为1:7，超声功率125W，超声时间5.5min，超声温度为2-5℃，过滤，获得滤渣；

B：滤渣加浓度为95％乙醇溶液回流提取三次，第一次加12.5倍量乙醇溶液，回流2.5h，第二次加8倍量乙醇溶液，回流2h，第三次加6.5倍量乙醇溶液，回流2h，合并滤液，过滤，回收乙醇，得乙醇提取物；

C：将乙醇提取物通过柱层析洗脱，重结晶制得日本毛连菜提取物，具体方法如下：

C-1：将乙醇提取物用乙醇溶解，上硅胶柱，以洗脱液进行洗脱，先以环己烷洗脱，弃去洗脱液；再以体积比为17:1的环己烷和乙酸乙酯的混合液洗脱，弃去洗脱液；再以体积比为10:1的环己烷和乙酸乙酯的混合液洗脱，弃去洗脱液；再以8.5:1的环己烷和乙酸乙酯的混合液进行洗脱，收集洗脱液；浓缩，得粗提物；

C-2：将粗提物用重结晶溶剂进行重结晶，重结晶溶剂为体积比为1：3:12的丙酮、二氯甲烷和石油醚的混合液。

实施例4一种日本毛连菜提取物的提取方法

该提取方法包括如下步骤：

A：称取日本毛连菜，粉碎，于超声仪中，用石油醚超声处理三次，每次处理的条件为：日本毛连菜和石油醚的固液比为1:7，超声功率125W，超声时间5.5min，超声温度为2-5℃，过滤，获得滤渣；

B：滤渣加浓度为95％乙醇溶液回流提取三次，第一次加12.5倍量乙醇溶液，回流2.5h，第二次加8倍量乙醇溶液，回流2h，第三次加6.5倍量乙醇溶液，回流2h，合并滤液，过滤，回收乙醇，得乙醇提取物；

C：将乙醇提取物通过柱层析洗脱，重结晶制得日本毛连菜提取物，具体方法如下：

C-1：将乙醇提取物用乙醇溶解，上硅胶柱，以洗脱液进行洗脱，先以环己烷洗脱，弃去洗脱液；再以体积比为17:1的环己烷和乙酸乙酯的混合液洗脱，弃去洗脱液；再以体积比为10:1的环己烷和乙酸乙酯的混合液洗脱，弃去洗脱液；再以8.5:1的环己烷和乙酸乙酯的混合液进行洗脱，收集洗脱液；浓缩，得粗提物；

C-2：将粗提物用重结晶溶剂进行重结晶，粗提物和重结晶溶剂的固液比为1:16，重结晶溶剂为体积比为1：3:12的丙酮、二氯甲烷和石油醚的混合液，具体条件为：将粗提物置于丙酮和二氯甲烷的混合液中，加热至50℃，保持此温度，滴加石油醚，缓慢冷却至室温，静置，过滤，收集沉淀，干燥，经反相HPLC半制备色谱分离，得白色粉末。¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ:5.23(1H，dd，J＝3.7，3.7，H-12)，

4.10(1H，m，H-2)，3.55(1H，m，H-22)，3.23(1H，d，J＝4.0，H-3)，1.99(1H，m，H-18)，1.26(3H，s，H-25)，1.15(3H，s，H-27)，1.03(3H，s，H-23)，1.02(3H，s，H-24)，1.00(3H，s，H-26)，0.99(3H，s，H-28)，0.93(3H，s，H-30)，0.92(3H，s，H-29)，0.84(1H，m，

H-5)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ:143.9(C-13)，122.6(C-12)，78.6(C-3)，76.5(C-22)，71.3(C-2)，55.3(C-5)，48.2(C-9)，47.5(C-18)，46.2(C-19)，44.4(C-1)，42.9(C-21)，42.5(C-14)，40.2(C-8)，38.4(C-17)，38.3(C-4)，36.8(C-10)，33.5(C-29)，32.7(C-7)，31.8(C-20)，29.9(C-23)，26.5(C-27)，25.6(C-15)，25.1(C-30)，24.8(C-28)，23.8(C-11)，19.2(C-16)，18.3(C-6)，17.5(C-24)，16.9(C-26)，16.7(C-25)。

实验例1日本毛连菜提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性检测

1.1仪器与试剂

仪器：酶标仪：ELISA plate reader(Bio-Tek Instruments，USA)；

试剂：α-葡萄糖苷酶(α-D-Glucosidase，Sigma，SOOU/毫升)；4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPC，Merck)，还原性谷胱甘肽(上海生工)，阿卡波糖即拜糖平(拜耳医药保健有限公司，北京)，

日本毛连菜水提物(称取日本毛连菜100g，加20倍量蒸馏水浸泡15min后，煎煮1h，过滤，得滤液，再加滤渣10倍量蒸馏水，煎煮1h，过滤，得滤液，合并滤液，离心，浓缩，即得日本毛连菜水提物)

日本毛连菜醇提物(称取日本毛连菜100g，加20倍量的95％乙醇浸泡15min后，回流提取1h，过滤，得滤液，滤渣再加10倍的95％乙醇回流提取1h，过滤，合并滤液，离心，浓缩，制得日本毛连菜醇提物)。

1.2测试方法

化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用测定采用比色法。样品孔中加入磷酸缓冲液(67毫摩尔/升，pH 6.8，170微升)，还原型谷胱甘肽(毫克/毫升，5微升)，α-葡萄糖苷酶(用磷酸缓冲液稀释成0.2U/毫升，25微升)，阿卡波糖、式一化合物、日本毛连菜水提物和日本毛连菜醇提取分别用二甲亚飒溶解，用磷酸缓冲液稀释，每孔25微升，使其终浓度为0.5毫克/毫升，0.5毫克/毫升，2毫克/毫升，2毫克/毫升，最后加入底物4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(23.2毫摩尔/升，25微升)，37℃，水浴反应15分钟后，加入碳酸钠(1摩尔/升，50微升)终止反应，在405nm波长处比色测定。空白孔中用相同体积的Tris-HCl缓冲液代替底物。溶剂对照孔中加入与式一化合物等浓度的二甲亚飒，各组抑制率由样品OD值对于空白和对照OD值计算，结果见表1。

表1各组对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用结果

1.3实验结论

本发明提供的式一化合物具有强效抑制α-葡萄糖苷酶的作用，其抑制活性超过阿卡波糖及日本毛连菜水提物和日本毛连菜醇提取。

实验例2日本毛连菜提取物对糖尿病小鼠降糖作用实验

2.1实验材料

2.1.1实验动物

昆明种小鼠，体重20-22g，雌雄各半，由山西医科大学实验动物中心提供。

2.1.2试剂及设备

式一化合物由本发明提供的方法制备；

四氧嘧啶、生理盐水、葡萄糖试剂盒、格列本脲均从制药公司购买；其余所用试剂均为分析纯；旋转蒸发器、循环水式真空泵、电热恒温水浴锅、紫外可见分光光度计、控温电热套及离心机等设备也从市面上购买。

2.1实验方法

2.1.1四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型的建立

将小鼠禁食不禁水12后，尾部静脉注射现配制的四氧嘧啶生理盐水50mg/kg，72h后，对禁食不禁水的小鼠眼眶后静脉丛采血，3500r/min离心l5min，取血清10μL，按葡萄糖试剂盒的葡萄糖氧化酶法测血糖值，选取空腹血糖高于11.1mmol/L者用于实验。

2.1.2实验分组与给药

按血糖值随机分成7组，每组10只：格列本脲阳性对照组(2mg/kg)；日本毛连菜水提物(2g/kg)，日本毛连菜醇提物(2g/kg)，式一化合物低剂量(2mg/kg)，式一化合物中剂量组(6mg/kg)，式一化合物高剂量组(10mg/kg)，糖尿病模型组；另取10只正常小鼠作为正常对照组。糖尿病模型组和正常对照组给予等体积的生理盐水，实验小鼠均灌胃给药，0.2ml/10g，每日1次，连续给药14天。

2.1.3血样的采集及测定

于第7天、第14天给药前小鼠禁食不禁水8h，给药后继续禁食不禁水2h后，从小鼠眼眶后静脉丛采血，3500r/min离心l5min，取血清10μL，按葡萄糖试剂盒的葡萄糖氧化酶法测空腹血糖值。

2.1.4数据统计与处理方法

实验数据用均值±标注差表示，使用t检验进行比较组间差异的显著性。

2.1.5实验结果

各组对糖尿病小鼠的血糖影响结果见表2。

表2各组对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响结果(n＝10)

与糖尿病模型组比较，P^*＞0.05，P^&＜0.05，与日本毛连菜水提物比较，P^#＞0.05，与毛连菜醇提物比较，P^#＜0.05。

2.1.6实验结论

从上表中可以看出，本发明提供的式一化合物具有非常好的降血糖作用，效果好于日本毛连菜醇提物，略优于日本毛连菜水提物，与市售的格列本脲疗效相当，并且呈现剂量依赖性。