接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球及其制备方法与应用，该接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球由纳米级Fe3O4磁球，包覆于Fe3O4磁球表面的聚多巴胺高分子中间层以及接枝于聚多巴胺高分子中间层上的精氨酸聚合物刷构成；精氨酸聚合物刷由聚合引入至聚多巴胺高分子中间层上的PAMA聚合物刷和接枝于PAMA聚合物刷上的精氨酸组成。本发明提供的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球，以Fe3O4磁球作为内核，具有很好的磁响应性能；在Fe3O4磁球表面依次引入厚度可控的聚多巴胺高分子中间层和接枝有精氨酸的PAMA聚合物刷，磁性纳米球粒径均匀且分布较窄，对外加磁场能很好地响应，从而有利于磷酸化多肽的富集和分离，在研究生理行为蛋白磷酸化过程中具有十分重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，涉及接枝有富集磷酸化多肽的高分子刷的磁性纳米球及其制备方法与应用。

背景技术

胍基基团表现出对磷酸化多肽很好的亲和性能，鉴于此，一系列带有胍基基团的新型材料被制备出来。如文献Guanidyl-functionalized graphene as a bifunctionaladsorbent for selective enrichment of phosphopeptides(Chem.Commun.,2014,50,10963-10966)公开了一种富集磷酸化多肽的双功能吸附剂，是以石墨烯为基底材料，然后利用石墨烯上的-COOH基团引入-COCL基团，再引入-NH₂，最后通过缩合反应引入胍基。这种材料表面的胍基是单分子层，对于磷酸化多肽的富集存在富集量小、不能磁分离的技术缺陷，且该材料制备过程复杂，不易于工业化生产。

文献Facile synthesis of guanidyl-functionalized magnetic polymermicrospheres for tunable and specific capture of global phosphopeptides oronly multiphosphopeptides(ACS Appl.Mater.Interfaces 2014,6,22743-22750)公开了一种基于胍基刷的磁性复合材料用于富集磷酸化多肽，先合成具有超顺磁性的四氧化三铁纳米球，然后表面包裹一层MPS高分子层，再在高分子层表面利用回流沉淀聚合方式接枝上PGMA(poly(glycidyl methacrylate),聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯))的聚合物刷，并在聚合物刷上修饰-NH₂，利用氨基接枝上胍基。这种材料的优点在于利用表面聚合物刷可以引入大量的胍基，从而有利于磷酸化多肽的富集；然而由于需要经过多次表面改性，使得四氧化三铁磁球表面高分子层过厚，降低了所制备材料整体的饱和磁化强度和磁含量，进而影响了所制备材料的磁分离性能；且由于采用回流沉淀聚合方式接枝聚合物刷，存在聚合效率不高，所用试剂不环保的缺点，不利于推广。

文献A poly(ethylene glycol)-brush decorated magnetic polymer forhighly specific enrichment of phosphopeptides(Chem.Sci.,2012,3,2828-2838)公开了一种基于聚合物刷螯合Ti离子的磁性复合材料用于富集磷酸化多肽，先合成具有超顺磁性的四氧化三铁纳米球，然后在纳米球表面包裹一层SiO₂，再在SiO₂层上修饰上-NH₂，引入引发剂2-溴异丁酰溴，然后通过ATRP(Atom>

发明内容

本发明的目的旨在针对上述现有技术中存在的问题，提供一种接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球，以提高对于磷酸化多肽的富集效率，并便于实现磁分离。

本发明另一目的旨在提供一种反应条件温和、操作简单的制备方法，用于制备上述接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球。

本发明再一目的旨在提供上述接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球在磷酸化多肽富集方面的应用。

本发明提供的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球，由纳米级Fe₃O₄磁球，包覆于Fe₃O₄磁球表面的聚多巴胺层以及接枝于聚多巴胺层上的精氨酸聚合物刷构成；所述精氨酸聚合物刷由聚合引入至聚多巴胺层上的PAMA聚合物刷和接枝于PAMA聚合物刷上的精氨酸组成。

上述接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球，呈现完整的球形，粒径均匀且分布较窄，平均粒径约为350nm～500nm，这种形状规整、尺寸均匀的纳米球比较适合用于蛋白多肽的富集与分离应用。该磁性纳米球以超顺磁性四氧化三铁(Fe₃O₄磁球)作为内核，使得接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球整体饱和磁化强度达到40-60emu>-1,具有较高的磁含量和磁饱和磁化强度，从而对外加磁场具有很好的磁响应性能。包裹在Fe₃O₄磁球表面的聚多巴胺层作为过渡层，不仅可以实现对磁性纳米球厚度的调控，而且聚多巴胺上具有丰富的羟基，可以便于通过引发剂引发带有氨基的单体AMA(2-氨基丙烯酸甲酯盐酸盐)聚合形成聚合物刷。精氨酸可以通过PAMA聚合物刷上的氨基接枝到磁性纳米球的表面；精氨酸上带有对磷酸化多肽具有富集作用的胍基，此外精氨酸上还带有对磷酸化多肽具有亲和作用的氨基，所以引入精氨酸一个分子相当于引入了两种亲和位点。因此接枝有精氨酸的聚合物刷带有大量的胍基和氨基基团，具有很高的磷酸化多肽富集效率，尤其是在检测灵敏度上，可以达到10^-11M检测限；同时精氨酸由于是小分子，空间位阻小，利于引入，也利于后面磷酸化多肽的富集，而且价格便宜易得；此外，精氨酸作为一种氨基酸，比一般化合物生物毒性小，有利于生物医学方面的应用。

本发明进一步提供了一种接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的制备方法，主要通过多巴胺自聚合和ARGET-ATRP(电子转移活化再生催化剂原子转移自由基聚合)方法结合来得到接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球，具体步骤如下：

(1)制备Fe₃O₄/Polymer纳米球

向含有多巴胺的Tris缓冲液中加入纳米级Fe₃O₄磁球，之后于有氧条件下搅拌反应至少2h，得到第一反应液，对第一反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物洗涤得到聚多巴胺层包覆的Fe₃O₄磁球，即Fe₃O₄/Polymer纳米球；所述多巴胺与纳米级Fe₃O₄磁球的质量比为：1：(1.2～12)；

(2)制备Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球

将Fe₃O₄/Polymer纳米球均匀分散到DMF中得到Fe₃O₄/Polymer纳米球悬浮液；在氮气环境、搅拌条件下，向Fe₃O₄/Polymer纳米球悬浮液中滴入三乙胺得到第一混合液，之后在冰浴条件和搅拌下向第一混合液中滴入2-溴异丁酰溴，滴加完毕后继续在冰浴条件下反应0.5～2h，之后撤去冰浴，再搅拌反应至少6h，得到第二反应液；对第二反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物洗涤得到聚多巴胺层表面引入引发剂的Fe₃O₄/Polymer纳米球，即Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球；Fe₃O₄/Polymer纳米球悬浮液中，每100mgFe₃O₄/Polymer纳米球至少需要添加1mL三乙胺；所述2-溴异丁酰溴与三乙胺的体积比为1：(1.11～1.25)；

(3)制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球

将Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球均匀分散到溶剂A中得到Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球悬浮液；在氮气环境下、搅拌条件下，向Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球悬浮液中依次加入催化剂和配合物的溶剂A溶液及单体AMA的溶剂A溶液，得到第二混合液，再向所得第二混合液中滴入还原剂的溶剂A溶液，然后搅拌反应至少2h，得到第三反应液；对第三反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物洗涤得到接枝有PAMA聚合物刷的Fe₃O₄/Polymer纳米球，即Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球；所述Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球、催化剂与单体AMA的质量比为3：(0.23～0.38)：(5～50)，所述催化剂与配合物的摩尔比为1:(5～10)，所述还原剂与Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球的质量比为(1～2)：3；

(4)制备接枝有精氨酸聚合物刷的磁性纳米球

将精氨酸溶解于去离子水中，得到精氨酸水溶液；在搅拌条件下向DMF加入精氨酸水溶液和缩合剂，继续搅拌至缩合剂完全溶解得到第一溶液；随后在搅拌条件下向第一溶液中加入有机碱，继续搅拌至有机碱和第一溶液混合均匀得到第二溶液；继后在搅拌条件下向第二溶液中加入步骤(3)得到的Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球，在搅拌条件下进行缩合反应，反应时间为至少12h，得到第四反应液，对第四反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物洗涤得到接枝有精氨酸聚合物刷的磁性纳米球；

所述DMF用量为能完全溶解缩合剂和有机碱；所述精氨酸与缩合剂摩尔比1：(1-3)；所述缩合剂为由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂、由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和1-羟基苯并三唑按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂或者由N,N’-二环己基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂；所述有机碱与缩合剂中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐或N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为(1.5～3)：1大于1；所述精氨酸与Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球质量比为(0.5～5)：1。

上述接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的制备方法，所述步骤(1)以Fe₃O₄磁球和多巴胺为原料，采用多巴胺自聚合的方法在Fe₃O₄磁球表面包覆一聚多巴胺层。Fe₃O₄磁球可以采用水热法来制备；本发明中主要是以氯化铁、醋酸铵、柠檬酸钠为原料，以乙二醇为溶剂的水热法合成超顺磁性四氧化三铁纳米球；通过调节水热反应时间可调控磁球粒径分布在约200nm～300nm。制备Fe₃O₄磁球的具体实现方式可以参考现有技术中已经披露的常规制备方法得到，参见The>4+-immobilized>3O₄磁球分散性良好，浓度不宜过大，搅拌时间不宜过长，多巴胺浓度优选为0.5mg/mL～1.5mg/mL，搅拌反应时间优选为5h～9h。多巴胺自聚合反应式在有氧条件下进行的，若采用的是敞口反应容器，只要搅拌反应过程中保持容器敞口即可；若采用的是封闭式容器，可以在搅拌反应过程中保持通氧状态，对于氧气压强没有特殊要求，只要常压即可。本步骤可以用磁铁对第一反应液进行磁分离，分离出的固体产物，需要进一步采用去离子水对第一反应液磁分离出的固体产物洗涤3～5遍，以去除未包覆在Fe₃O₄磁球表面的聚多巴胺层和未参加反应的多巴胺原料等。

上述接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的制备方法，所述步骤(2)的目的是接枝上用于引发单体AMA发生聚合反应的引发剂，三乙胺用于提供碱性反应环境，2-溴异丁酰溴作为引发剂。用于分散Fe₃O₄/Polymer纳米球的DMF(N,N二甲基甲酰胺)同时作为Fe₃O₄/Polymer纳米球和2-溴异丁酰溴的反应环境，因此，在优选实施方式中，每50mg>3O₄/Polymer纳米球需要用10～30mL>

上述接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的制备方法，所述步骤(3)的目的是采用反应条件相对温和、对工艺要求相对简单、制备方法简单易行的ARGET-ATRP聚合方法利用接枝在聚多巴胺层上的引发剂，在催化剂、配合物和还原剂组成的催化体系中，引发单体AMA发生聚合反应，在聚多巴胺层表面引入PAMA聚合物刷。用于得到Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球悬浮液的溶剂A主要是用于将Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球分散均匀，因此每60mg>3O₄/Polymer-Br纳米球至少需要2mL溶剂A；从节约原料、降低经济成本考虑，用于分散60mgFe₃O₄/Polymer-Br纳米球的溶剂A用量可以控制在2～6mL。由催化剂、配合物和还原剂组成的催化体系为本领域聚合反应常规选择，催化剂为CuBr₂或CuCl₂；配合物为2,2'-联二吡啶、三(2-吡啶甲基)胺(TPMA)、五甲基二乙烯基三胺(PMDETA)和三(2-二甲氨基乙基)胺(Me₆TREN)中的一种；所述还原剂为抗坏血酸钠(SA)或抗坏血酸。催化剂和配合物的溶剂A溶液是由催化剂和配合物溶解于溶剂A中得到，溶剂A的用量为将催化剂和配合物溶解完全；单体AMA的溶剂A溶液是由单体AMA溶解于溶剂A中得到，溶剂A的用量为将单体AMA溶解完全；还原剂的溶剂A溶液是由还原剂溶解于溶剂A中得到，溶剂A的用量为将还原剂溶解完全。所述溶剂A为DMF(二甲基甲酰胺)或由异丙醇和水按照体积比1:(1～10)组成的混合溶剂。经研究发现，通过调节单体AMA、催化剂、配合物和还原剂的比例、溶剂A、聚合反应温度和反应时间可以将PAMA聚合物刷厚度调控在5～80nm范围内。此外，通过调节还原剂的溶剂A溶液滴入到第二混合液中的滴入速率，也可以调整PAMA聚合物刷的厚度，本发明中滴加时间以在30～60min内，将还原剂的溶剂A溶液滴入到所得第二混合液中计量，但当速度过快时，会影响单体AMA的聚合度。聚合反应的时间可以根据原料用量以及所需要得到的PAMA聚合物刷的厚度进行设定，本发明中聚合反应时间为2～24h。本步骤原料的添加以及反应均是在氮气环境下进行的；氮气环境的实现方式为：首先将反应容器内真空抽5～10min，然后再通入氮气至常压，如此反复操作三至五次。本步骤可以用磁铁对第三反应液进行磁分离，分离出的固体产物，需要进一步依次采用DMF、丙酮和去离子水对第三反应液磁分离出的固体产物洗涤3～5遍，以去除催化剂、配合物、还原剂、未发生聚合反应的单体AMA等。

上述接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的制备方法，所述步骤(4)通过缩合反应，将精氨酸接枝于磁性纳米球上的PAMA聚合物刷上。本发明缩合反应采用的缩合剂是由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂、由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-羟基苯并三唑(HOBT)按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂或者由N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和1-羟基苯并三唑(HOBT)按照摩尔比(1～3)：1组成的复合缩合剂。缩合反应采用的溶剂DMF，可以有效保证缩合反应的效率。本发明缩合反应中所采用的有机碱可以在为缩合反应提供碱性环境的同时，起到稳定缩合剂的作用，所述有机碱可以为三乙胺或N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)等。缩合反应时间可以根据原料量进行调整，本发明缩合反应时间为12-72h。本步骤可以用磁铁对第四反应液进行磁分离，分离出的固体产物，需要进一步依次用DMF、乙醇和去离子水对固体产物洗涤3～5遍，去除吸附在固体产物表面未反应的原料精氨酸、缩合剂和有机碱等。

上述接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的制备方法，本发明所涉及的搅拌条件均为磁力搅拌，转速一般为600rpm～700rpm。

上述接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的制备方法，对于未对温度特别说明的操作，均是在室温下进行的。

本发明进一步提供所述接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球在磷酸化多肽富集中的应用。所述磁性纳米球聚合物刷上大量的亲和基团赋予了其对于磷酸化多肽具有很好的富集效果，从而提升了磷酸化多肽的检测灵敏度；此外，所述接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球对生物样本脱脂牛奶中的磷酸化多肽也具有很好的富集效果。通过调节磷酸化多肽富集过程中使用的缓冲液的组分可以同时对于单磷酸化位点和多磷酸化位点的磷酸化多肽的富集，也可以只对多磷酸化位点的磷酸化多肽的富集，对研究生理行为蛋白磷酸化过程具有很重要的意义。其具体方式为：首先要将磷酸化蛋白β-酪蛋白或者脱脂牛奶用胰蛋白酶消化成磷酸化多肽，用缓冲液进行稀释，然后加入接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球混合搅拌，在室温下利用摇床摇动20min-2h使磷酸化多肽都富集在磁球表面，再在外加磁场的作用下利用磁分离将纳米球从混合液中分离出来，将表面吸附了磷酸化多肽的纳米球加入到解吸附缓冲液中将磷酸化多肽从纳米球上解吸附下来。吸附磷酸化多肽的是磁性纳米球表面接枝有精氨酸的聚合物刷，利用氨基和胍基对于磷酸化多肽的亲和作用实现了对于磷酸化多肽的富集。通过减小缓冲溶液的pH实现了被吸附磷酸化多肽从纳米球表面脱离，从而实现了磷酸化多肽的富集和分离。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球，以Fe₃O₄磁球作为内核，具有很好的磁响应性能；在Fe₃O₄磁球表面依次引入厚度可控的聚多巴胺层和接枝有精氨酸的PAMA聚合物刷，使磁性纳米球呈规则球形，粒径均匀且分布较窄，平均粒径在350～500nm，从而使磁性纳米球具有较高的磁含量和磁化强度，对外加磁场能很好地响应，从而有利于磷酸化多肽的富集和分离；

2、本发明提供的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球，磁性纳米球表面通过PAMA聚合物刷引入精氨酸，提供大量的胍基和氨基亲和基团，从而使磁性纳米球对磷酸化多肽具有较高的富集效率和检测灵敏度；同时精氨酸由于是小分子，空间位阻小，利于引入，也利于后面磷酸化多肽的富集，而且价格便宜易得；此外，精氨酸作为一种氨基酸，比一般化合物生物毒性小，有利于生物医学方面的应用；

3、本发明提供的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球，既可以同时对单磷酸化位点和多磷酸化位点的磷酸化多肽的富集，也可以仅对多磷酸化位点磷酸化多肽的富集，在研究生理行为蛋白磷酸化过程中具有十分重要的意义；

4、本发明提供的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的制备方法，首先在Fe₃O₄磁球表面包裹聚多巴胺层，然后通过工艺简单、条件温和的ARGET-ATRP聚合方法在聚多巴胺层表面引入PAMA聚合物刷，整个过程操作简单、反应条件温和，并且所采用的原料和溶剂相对绿色无毒，因此易于在生物医药领域内推广应用。

附图说明

图1为本发明所述接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的结构及其制备方法流程图。

图2为本发明实施例制备的纳米球检测得到的形貌表征图；其中，(A)为实施例3制备的Fe₃O₄/Polymer纳米球的形貌表征图，(B)为实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的形貌表征图。

图3为本发明实施例制备的纳米球检测得到的粒径表征图；其中(a)为Fe₃O₄磁球的粒径表征图，(b)为实施例3制备的Fe₃O₄/Polymer纳米球的粒径表征图，(c)为实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的粒径表征图。

图4为本发明实施例制备的纳米球检测得到的红外图谱；其中(a)为实施例3制备的Fe₃O₄/Polymer纳米球的红外图谱，(b)为实施例9制备的Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球的红外谱图，(c)为实施例27制备的Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球的红外图谱，(d)为实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的红外图谱。

图5为本发明实施例制备的纳米球在-18000Oe到18000Oe范围内检测得到的磁滞回线图谱；其中(a)为Fe₃O₄磁球的磁滞回线图谱，(b)为实施例3制备的Fe₃O₄/Polymer纳米球的磁滞回线图谱，(c)为实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的磁滞回线图谱。

图6为本发明所述接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球对于磷酸化多肽的富集与分离过程示意图。

图7为本发明应用例1得到的MS图；其中(a)为未经富集处理的β-酪蛋白消化液的MS图，(b)为经实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球富集处理的第一β-酪蛋白消化液的MS图，(c)为经实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球富集处理的第二β-酪蛋白消化液的MS图。

图8为本发明应用例2得到的MS图。

图9为本发明应用例3得到的MS图；其中(a)为未经富集处理的生物样本脱脂牛奶消化液的MS图，(b)为经实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球富集处理的第一预处理消化液的MS图，(c)为经实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球富集处理的第二预处理消化液的MS图。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。

本发明提出的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球结构，如图1所示，该接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球由纳米级Fe₃O₄磁球，包覆于Fe₃O₄磁球表面的聚多巴胺层以及接枝于聚多巴胺层上的精氨酸聚合物刷构成；所述精氨酸聚合物刷由聚合引入至聚多巴胺层上的PAMA聚合物刷和接枝于PAMA聚合物刷上的精氨酸组成。本发明是基于图1给出的工艺流程制备接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的，首先利用溶剂热法制备Fe₃O₄磁球；再在制得的Fe₃O₄纳米球表面包覆一层由多巴胺自聚合得到的聚多巴胺层，得到聚多巴胺层包覆的Fe₃O₄纳米球(Fe₃O₄/Polymer纳米球)；然后利用ARGET-ATRP聚合方法在聚多巴胺层表面引入PAMA聚合物刷；最后通过缩合反应，将精氨酸接枝到PAMA聚合物刷上。

为了对本发明提供的技术方案更加清楚，下面结合实施例给出更加详细的说明和解释。

以下实施例中采用的Fe₃O₄磁球的具体制备过程为：将原料1.157gFeCl₃·6H₂O、3.303g

NH₄Ac(醋酸铵)和0.4gNa₃CT(柠檬酸钠)加入到盛有60mL溶剂乙二醇的反应釜中，磁力搅拌1小时使上述原料混合均匀；然后移除搅拌子，将反应釜温度升至200℃，反应16小时；再将反应釜冷却至室温，对反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物；然后依次用乙醇对固体产物重复洗涤五次、用去离子水对产物重复洗涤五次即得到Fe₃O₄磁球。通过调节水热反应时间12～16h，可以调节得到的Fe₃O₄磁球粒径在200～300nm之间。

通过上述方法得到的纳米磁球可以很好的分散在水中，形成稳定的超顺磁性纳米颗粒悬浮液。利用Zetasizer Nano ZS90型粒度分析仪对得到的Fe₃O₄磁球进行DLS(DynamicLight>3O₄磁球粒径在300nm左右。

实施例1-实施例5制备Fe₃O₄/Polymer纳米球

按照表1称取原料，并结合表1中给出的工艺参数依据下述方法制备Fe₃O₄/Polymer纳米球：向含有多巴胺的pH值8.2～8.5的Tris缓冲液中加入Fe₃O₄磁球，之后于反应容器开口条件下搅拌反应2h～12h，得到第一反应液，对第一反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再对固体产物用去离子水洗涤，除去未包覆在Fe₃O₄磁球表面的聚多巴胺层和未参加反应的多巴胺原料等得到聚多巴胺层包覆的Fe₃O₄磁球，即Fe₃O₄/Polymer纳米球；含有多巴胺的pH值8.2～8.5缓冲液是由多巴胺溶解于Tris缓冲液中形成，缓冲液中多巴胺浓度为0.25mg/mL～2.5mg/mL。

表1制备Fe₃O₄/Polymer纳米球的原料及其配比和工艺参数

利用Zetasizer Nano ZS90型粒度分析仪对实施例1-实施例5制备的Fe₃O₄/Polymer纳米球进行DLS(Dynamic>3O₄/Polymer纳米球的平均粒径在310nm～360nm左右，表明聚多巴胺层的厚度可以控制在5nm-30nm，考虑到聚多巴胺层对Fe₃O₄磁球磁性能的影响，厚度不宜太厚，以下实施例6-9中选用的是实施例3制备的320nm的Fe₃O₄/Polymer纳米球。

实施例6-实施例9制备Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球

按照表2称取原料，并结合表2中给出的工艺参数依据下述方法制备Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球：将实施例3得到的Fe₃O₄/Polymer纳米球均匀分散到DMF中，得到Fe₃O₄/Polymer纳米球悬浮液；首先将加入搅拌子的二口瓶反应容器抽真空5min～10min，然后通氮气至常压，如此重复操作三次，确保反应容器内氧气去除干净，整个反应在通氮气的状态下进行；然后加入Fe₃O₄/Polymer纳米球悬浮液，在磁力搅拌状态下，向Fe₃O₄/Polymer纳米球悬浮液中滴入0.5mL～2mL三乙胺得到第一混合液，之后在冰浴条件和搅拌下向第一混合液中滴入0.4mL～1.8mL2-溴异丁酰溴，滴加完毕后继续在冰浴下反应0.5～2h，之后撤去冰浴，再搅拌反应6h～24h，得到第二反应液，对第二反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再依次采用DMF、乙醇和去离子水对固体产物洗涤(每种洗液洗五遍)，去除三乙胺和未接枝到聚多巴胺层上的2-溴异丁酰溴等得到表面引入引发剂后的Fe₃O₄/Polymer纳米球，即Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球。

表2制备Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球的原料及其配比和工艺参数

实施例10-实施例13制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球

按照表3称取原料，并结合表3中给出的工艺参数依据下述方法制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球：将实施例9制备的Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球均匀分散到DMF中，得到Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球悬浮液；首先将加入搅拌子的二口瓶反应容器抽真空5min～10min，然后通氮气至常压，如此重复操作三次，确保反应容器内氧气去除干净；在氮气环境下，向反应容器内加入Fe₃O₄/Polymer纳米球悬浮液，在磁力搅拌状态下，向Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球悬浮液中依次加入催化剂和配合物的DMF溶液及单体AMA的DMF溶液，得到第二混合液，再向所得第二混合液中滴入还原剂的DMF溶液，然后搅拌反应12h，得到第三反应液，对第三反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再依次采用DMF、丙酮和去离子水对固体产物洗涤(每种洗液洗五遍)，以去除催化剂、配合物、还原剂、未发生聚合反应的单体AMA等得到接枝有PAMA聚合物刷的Fe₃O₄/Polymer纳米球，即Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球。

表3制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球的原料及其配比和工艺参数

利用Zetasizer Nano ZS90型粒度分析仪对实施例10-实施例13制备的Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球进行DLS分析显示，Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球的平均粒径在330nm～380nm左右，表明PAMA聚合物刷的厚度可以控制在5nm-30nm，表明配合物的种类和用量对聚合反应有一定的影响，可以通过选择合适的配合物，来实现对聚合物刷厚度的调控。

实施例14-实施例17制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球

按照表4称取原料，并结合表4中给出的工艺参数依据下述方法制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球：将实施例9制备的Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球均匀分散到DMF中，得到Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球悬浮液；首先将加入搅拌子的二口瓶反应容器抽真空5min～10min，然后通氮气至常压，如此重复操作三次，确保反应容器内氧气去除干净；在氮气环境下，向反应容器内加入Fe₃O₄/Polymer纳米球悬浮液，在磁力搅拌状态下，向Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球悬浮液中依次加入催化剂和配合物的DMF溶液及单体AMA的DMF溶液，得到第二混合液，再向所得第二混合液中滴入还原剂的DMF溶液，然后搅拌反应12h，得到第三反应液，对第三反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再依次采用DMF、丙酮和去离子水对固体产物洗涤(每种洗液洗三遍)，以去除催化剂、配合物、还原剂、未发生聚合反应的单体AMA等得到接枝有PAMA聚合物刷的Fe₃O₄/Polymer纳米球，即Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球。

表4制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球的原料及其配比和工艺参数

利用Zetasizer Nano ZS90型粒度分析仪对实施例14-实施例17制备的Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球进行DLS分析显示，Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球的平均粒径在330nm～420nm左右，PAMA聚合物刷的厚度可以控制在5nm-50nm，表明单体AMA的浓度对聚合反应有一定的影响，可以通过调整单体AMA的浓度来实现对聚合物刷厚度的调控。

实施例18-实施例22制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球

按照表5称取原料，并结合表5中给出的工艺参数依据下述方法制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球：将实施例9制备的Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球均匀分散到DMF中，得到Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球悬浮液；首先将加入搅拌子的二口瓶反应容器抽真空5min～10min，然后通氮气至常压，如此重复操作三次，确保反应容器内氧气去除干净；在氮气环境下，向反应容器内加入Fe₃O₄/Polymer纳米球悬浮液，在磁力搅拌状态下，向Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球悬浮液中依次加入催化剂和配合物的DMF溶液及单体AMA的DMF溶液，得到第二混合液，再在1-60min滴定时间内向所得第二混合液中滴入还原剂的DMF溶液，然后搅拌反应12h，得到第三反应液，对第三反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再依次采用DMF、丙酮和去离子水对固体产物洗涤(每种洗液洗五遍)，以去除催化剂、配合物、还原剂、未发生聚合反应的单体AMA等得到接枝有PAMA聚合物刷的Fe₃O₄/Polymer纳米球，即Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球。

表5制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球的原料及其配比和工艺参数

利用Zetasizer Nano ZS90型粒度分析仪对实施例18-实施例22制备的Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球进行DLS分析显示，Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球的平均粒径在380nm～440nm左右，PAMA聚合物刷的厚度可以控制在30nm-60nm。表明还原剂的滴入速度对聚合反应有一定的影响，可以通过调整滴定时间来控制还原剂的滴入速度，进而对聚合物刷厚度实现调控。实验结果表面还原剂的滴加速度在相对较慢的情况下可以促进聚合反应的进行，得到较厚的聚合物刷。

实施例23-实施例25制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球

按照表6称取原料，并结合表6中给出的工艺参数依据下述方法制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球：将实施例9制备的Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球均匀分散到由异丙醇和水组成的溶剂A中，得到Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球悬浮液；首先将加入搅拌子的二口瓶反应容器抽真空5min～10min，然后通氮气至常压，如此重复操作三次，确保反应容器内氧气去除干净；在氮气环境下，向反应容器内加入Fe₃O₄/Polymer纳米球悬浮液，在磁力搅拌状态下，向Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球悬浮液中依次加入催化剂和配合物的溶剂A溶液和单体AMA的溶剂A溶液，得到第二混合液，再在30min滴定时间内向所得第二混合液中滴入还原剂的溶剂A溶液，然后搅拌反应12h，得到第三反应液，对第三反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再依次采用DMF、丙酮和去离子水对固体产物洗涤(每种洗液洗三遍)，以去除催化剂、配合物、还原剂、未发生聚合反应的单体AMA等得到接枝有PAMA聚合物刷的Fe₃O₄/Polymer纳米球，即Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球。

表6制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球的原料及其配比和工艺参数

利用Zetasizer Nano ZS90型粒度分析仪对实施例23-实施例25制备的Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球进行DLS分析显示，Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球的平均粒径在400nm～440nm左右，PAMA聚合物刷的厚度可以控制在40nm-60nm。表明由异丙醇和水组成的混合溶剂完全可以替代DMF，提高PAMA刷的聚合度，而且进一步降低使用溶剂的毒性。

实施例26-实施例30制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球

按照表7称取原料，并结合表7中给出的工艺参数依据下述方法制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球：将实施例9制备的Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球均匀分散到由异丙醇和水组成的溶剂A中，得到Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球悬浮液；首先将加入搅拌子的二口瓶反应容器抽真空5min～10min，然后通氮气至常压，如此重复操作三次，确保反应容器内氧气去除干净；在氮气环境下，向反应容器内加入Fe₃O₄/Polymer纳米球悬浮液，在磁力搅拌状态下，向Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球悬浮液中依次加入催化剂和配合物的溶剂A溶液和单体AMA的溶剂A溶液，得到第二混合液，再在30min滴定时间内向所得第二混合液中滴入还原剂的溶剂A溶液，然后搅拌反应2-24h，得到第三反应液，对第三反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再依次采用DMF、丙酮和去离子水对固体产物洗涤(每种洗液洗三遍)，以去除催化剂、配合物、还原剂、未发生聚合反应的单体AMA等得到接枝有PAMA聚合物刷的Fe₃O₄/Polymer纳米球，即Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球。

表7制备Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球的原料及其配比和工艺参数

利用Zetasizer Nano ZS90型粒度分析仪对实施例26-实施例30制备的Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球进行DLS分析显示，Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球的平均粒径在340nm～480nm左右，PAMA聚合物刷的厚度可以控制在10nm-80nm。表明搅拌反应时间对单体AMA聚合反应有重要影响，可以通过调整搅拌反应时间来调整PAMA聚合物刷的厚度。

实施例31-实施例33制备接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球

按照表8称取原料，并结合表8中给出的工艺参数依据下述方法制备接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球：将精氨酸溶解于去离子水中，得到精氨酸的水溶液；在磁力搅拌条件下于室温向DMF中加入精氨酸的水溶液和缩合剂，继续搅拌至缩合剂完全溶解得到第一溶液；随后在搅拌条件下于室温向第一溶液中加入有机碱，继续搅拌至有机碱和第一溶液混合均匀得到第二溶液；继后在搅拌条件下于室温向第二溶液中加入实施例27得到的Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球，在搅拌条件下于室温进行缩合反应，反应时间12h-72h，得到第四反应液，对第四反应液进行磁分离并收集分离出的固体产物，再依次用DMF、乙醇和去离子水对固体产物洗涤(每种洗液洗三遍)，去除吸附在固体产物表面未反应的原料精氨酸、缩合剂和有机碱等对固体产物洗涤得到接枝有精氨酸聚合物刷的磁性纳米球。

表8制备接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的原料及其配比和工艺参数

为了探究聚多巴胺层以及接枝有精氨酸的PAMA聚合物刷是否成功复合到Fe₃O₄纳米磁球上，对Fe₃O₄磁球、实施例3制备的Fe₃O₄/Polymer纳米球、实施例9制备的Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球、实施例27制备的Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球以及实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的形貌尺寸和微观结构进行了表征，如图2至图4所示。

(1)形貌

将实施例3制备的Fe₃O₄/Polymer纳米球和实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球悬浮液滴加到铜网上，自然干燥后用JEM-CX100透射电子显微镜(TEM)进行观察，结果如图2所示；从图2可以看出，制备的Fe₃O₄/Polymer纳米球以及接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球均成大小均一、形貌规整的球形；此外，从图2(A)看出，Fe₃O₄/Polymer纳米球由于聚多巴胺层的包覆，其表面十分光滑，且可以明显看到一层晕；而图2(B)中，接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球表面出现明显的两层晕，里层的晕是聚多巴胺层，外圈晕是接枝有精氨酸的聚合物刷，这证明PAMA聚合物刷成功地合成到了Fe₃O₄/Polymer纳米球表面。

(2)尺寸分布

利用Zetasizer Nano ZS90型粒度分析仪检测了Fe₃O₄磁球、实施例3制备的Fe₃O₄/Polymer纳米球、实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的粒径分布，检测结果如图3所示，从图中可以看出，Fe₃O₄磁球、Fe₃O₄/Polymer纳米球、接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球平均粒径分别为300nm、320nm、480nm，因此包裹在Fe₃O₄磁球表面的聚多巴胺层厚度为10nm左右、生长在Fe₃O₄/Polymer纳米球表面的PAMA聚合物刷厚度为80nm左右；从而说明聚合物刷成功地合成到了Fe₃O₄/Polymer纳米球表面。

(3)微观结构

采用PE spectrometer型傅里叶变换红外光谱仪检测实施3制备的Fe₃O₄/Polymer纳米球、实施例9制备的Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球、实施例27制备的Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球以及实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球在500cm^-1-4000cm^-1波数范围内的红外光谱(检测步长为4cm^-1)，检测结果如图4所示。从图中可以看出，实施例9制备的Fe₃O₄/Polymer-Br纳米球对应的红外光谱谱图中1750cm^-1处的峰对应脂键的伸缩振动峰，说明引发剂已经成功接枝到聚多巴胺层上；实施例27制备的Fe₃O₄/Polymer/PAMA纳米球对应的红外光谱谱图中1646cm^-1处的峰对应氨基的伸缩振动峰，说明PAMA聚合物刷已经成功接枝到Fe₃O₄/Polymer纳米球悬浮液聚多巴胺层上；实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球对应的红外光谱谱图中1636cm^-1处的峰对应酰胺键的伸缩振动峰，说明精氨酸已经成功被缩合到PAMA聚合物刷上。

本发明通过调整聚多巴胺层、PAMA聚合物刷的厚度，可以将接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的平均粒径分布在350nm～500nm。

为了探究接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的磁性能，采用Model BHV-525型振动样品磁强计(VSM)分别检测了Fe₃O₄磁球、实施例3制备的Fe₃O₄/Polymer纳米球以及实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球在-18000Oe到18000Oe范围内的磁滞回线，结果如图5所示；从图中可以看出，所有样品的磁滞回线均经过原点，无剩磁和矫顽力，说明Fe₃O₄磁球、Fe₃O₄/Polymer纳米球、接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球均污剩磁和矫顽力，具有超顺磁性，其中接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球的饱和磁化强度达到43emug^-1。

本发明进一步提供了接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球在富集磷酸化多肽方面的应用，接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球对于磷酸化多肽的富集与分离过程，如图6所示，首先将接枝了精氨酸的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球加入到待处理的样本中，然后在摇床中进行富集，时间可以根据样本多少进行调整，富集过程结束后通过磁分离方式将固体产物分离出来，之后再用解吸附的缓冲液对表面吸附有磷酸化多肽的磁球进行解吸附，从而得的含有磷酸化多肽的缓冲液。可以对得到的含有磷酸化多肽的缓冲液进行MS(Mass Spectrometry，质谱)分析，以进一步确定接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球对磷酸化多肽的富集效果。

应用例1 β-酪蛋白消化液中磷酸化多肽的富集

取1mgβ-酪蛋白溶解在1ml 50Mm pH为8.2的NH₄HCO₃缓冲液里，再加入25ug的胰蛋白酶，37℃条件下消化16h；然后用第一缓冲液(体积浓度为50％的乙腈水溶液,其中含有摩尔浓度为0.1mol>-1的乙酸，即50％ACN-H₂O，0.1mol>-1Hac)稀释到10^-6M的浓度得到第一β-酪蛋白消化液。

取1mgβ-酪蛋白溶解在1ml 50Mm pH为8.2的NH₄HCO₃缓冲液里，再加入25ug的胰蛋白酶，37℃条件下消化16h；然后用第二缓冲液(体积浓度为70％的乙腈水溶液,其中含有体积浓度为0.1％的三氟乙酸TFA，即70％ACN-H₂O，0.1％TFA)稀释到10^-6M的浓度得到第二β-酪蛋白消化液。

分别取1mg实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球加入到100μl第一β-酪蛋白消化液样本和第二β-酪蛋白消化液样本中，然后在摇床150-200rpm条件下于室温富集30min得到第一悬浮液和第二悬浮液；之后用第一缓冲液对第一悬浮液清洗3遍(每次400μl)把非特异性吸附的多肽从磁球表面除去，得到第一组吸附了磷酸化多肽的磁球；用第二缓冲液对第二悬浮液清洗3遍(每次400μl)把非特异性吸附的多肽从磁球表面除去，得到第二组吸附了磷酸化多肽的磁球；最后将两组吸附了磷酸化多肽的磁球加入到20ul第三缓冲液(体积浓度为50％的乙腈水溶液,其中含有体积浓度为2％的三氟乙酸，即50％ACN-H₂O>

从图7可以看出，未经富集处理的β-酪蛋白消化液，用质谱检测得不到磷酸化多肽的信号【见图7(a)】；用接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球富集处理后，整个质谱图上都是磷酸化多肽的信号峰，且信号极强，没有任何非磷酸化多肽的峰，表明接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球对磷酸化多肽具有良好的选择性富集性能【见图7(b)和(c)】。同时从质谱特征峰的强度(选择同一条多肽β_1s作为标记)可以看出接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球富集后的信号强度相对于未经接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球富集处理的β-酪蛋白消化液中信号强度明显更高。上述分析结果表明本发明所述的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球实现同时对于单磷酸化位点和多磷酸化位点的磷酸化多肽的富集，同时具有很高的效率。此外，从图中可以看出，利用接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球在第一缓冲液稀释得到的第一β-酪蛋白消化液中能同时富集单磷酸化位点磷酸化多肽【见图7(b)，β_1s、β_2s为两个不同位置的单磷酸化位点的磷酸化多肽的特征峰】和多磷酸化位点磷酸化多肽【见图7(b)，β_3m、β_4m为两个不同位置的多磷酸化位点的磷酸化多肽的特征峰】；利用接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球在第二缓冲液稀释得到的第二β-酪蛋白消化液中只能富集多磷酸化位点磷酸化多肽【见图7(c)，β_3m、β_4m为两个不同位置的多磷酸化位点的磷酸化多肽的特征峰】，且信号强度明显强于第一β-酪蛋白消化液；表明，通过调节缓冲液成分，既可以实现同时对单磷酸化位点和多磷酸化位点磷酸化多肽富集，也可以实现只对多磷酸化位点的磷酸化多肽富集，这在研究生理行为蛋白磷酸化过程具有十分重要的意义。

经研究发现，当采用第二缓冲液(体积浓度为50％～80％的乙腈水溶液,其中含有体积浓度为0.01％～0.1％的三氟乙酸TFA，即50％～80％ACN-H₂O，0.01％0.1％TFA)时，接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球均可实现只对多磷酸化位点的磷酸化多肽的富集。

应用例2 β-酪蛋白消化液中磷酸化多肽的富集

取1mgβ-酪蛋白溶解在1ml 50Mm pH为8.2的NH₄HCO₃缓冲液里，再加入25ug的胰蛋白酶，37℃条件下消化16h；然后用第一缓冲液(体积浓度为50％的乙腈水溶液,其中含有摩尔浓度为0.1mol>-1的乙酸，即50％ACN-H₂O，0.1mol>-1Hac)稀释到10^-11M的浓度得到第三β-酪蛋白消化液。取1mg实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球加入到100μl第一β-酪蛋白消化液样本中，然后在摇床150-200rpm条件下于室温富集30min得到第三悬浮液；之后用第一缓冲液对第三悬浮液清洗3遍(每次400μl)把非特异性吸附的多肽从磁球表面除去，得到第三组吸附了磷酸化多肽的磁球；最后将第三组吸附了磷酸化多肽的磁球加入到20ul第三缓冲液(体积浓度为50％的乙腈水溶液,其中含有体积浓度为2％的三氟乙酸，即50％ACN-H₂O>2s为单磷酸化位点的磷酸化多肽的特征峰】和多磷酸化位点【图中β_3m、β_4m为两个不同位置的多磷酸化位点的磷酸化多肽的特征峰】的磷酸化多肽信号，表明接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球对磷酸化多肽具有很好的检测灵敏度(1fmol)，原因可能在于精氨酸聚合物刷上大量的功能基团赋予了其良好的富集性能，从而提升了磷酸化多肽的检测灵敏度。

应用例3生物样本脱脂牛奶消化液中磷酸化多肽的富集

为了进一步考察接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球在富集磷酸化多肽方面的实用性，下面以脱脂牛奶消化液为生物样本，进行进一步的研究。

取30ul脱脂牛奶加入到1ml 25Mm pH为8.2的NH₄HCO3缓冲液里，先14000rpm高速离心处理20min；取上清液在100℃高温下进行蛋白变性处理，时间为10min；然后向变性处理后的溶液中加入40ug胰蛋白酶，在37℃条件下消化16h，得到脱脂牛奶消化液；接下来取20μl消化液用200μl第一缓冲液(体积浓度为50％的乙腈水溶液,其中含有摩尔浓度为0.1mol>-1的乙酸，即50％ACN-H₂O，0.1mol>-1Hac)进行稀释，得到第一预处理消化液；取20μl消化液用200μl第二缓冲液(体积浓度为70％的乙腈水溶液,其中含有体积浓度为0.1％的三氟乙酸TFA，即70％ACN-H₂O，0.1％TFA)进行稀释，得到第二预处理消化液；分别将1mg实施例32制备的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球加入到100ul上述第一预处理消化液和第二预处理消化液中，然后在摇床150-200rpm条件下于室温富集30min得到第四悬浮液和第五悬浮液；之后用第一缓冲液对第四悬浮液清洗3遍(每次400μl)把非特异性吸附的多肽从磁球表面除去，得到第四组吸附了磷酸化多肽的磁球；用第二缓冲液对第五悬浮液清洗3遍(每次400μl)把非特异性吸附的多肽从磁球表面除去，得到第五组吸附了磷酸化多肽的磁球；最后将两组吸附了磷酸化多肽的磁球分别加入到20μl第三缓冲液(体积浓度为50％的乙腈水溶液,其中含有体积浓度为2％的三氟乙酸，即50％ACN-H2O>

从图9可以看出，未经富集处理的脱脂牛奶消化液，用质谱检测几乎得不到磷酸化多肽的信号【见图9(a)】；用接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球富集处理后，整个质谱图上都是磷酸化多肽的信号峰，没有任何非磷酸化多肽的峰，表明接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球对磷酸化多肽具有良好的选择性富集性能【见图9(b)和(c)】。上述分析结果表明本发明所述的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球实现同时对于单磷酸化位点和多磷酸化位点的磷酸化多肽的富集，同时具有很高的效率。此外，从图中可以看出，利用接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球在第一缓冲液稀释得到的第一预处理消化液中能同时富集单磷酸化位点磷酸化多肽【见图9(b)，β_1s、β_2s、β_3s、β_5s、β_6s等为多个不同位置的单磷酸化位点的磷酸化多肽的特征峰】和多磷酸化位点磷酸化多肽【见图9(b)，β_4m、β_7m、β_8m、β_9m、β_10m等为多个不同位置的多磷酸化位点的磷酸化多肽的特征峰】；利用接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球在第二缓冲液稀释得到的第二预处理消化液中只能富集多磷酸化位点磷酸化多肽【见图9(c)，β_4m、β_7m、β_8m、β_9m、β_10m等为多个不同位置的多磷酸化位点的磷酸化多肽的特征峰】；表明，通过调节缓冲液成分，既可以实现同时对单磷酸化位点和多磷酸化位点磷酸化多肽富集，也可以实现只对多磷酸化位点的磷酸化多肽富集，说明本发明提供的接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球对于复杂的生物样本也能特异性的选择性富集磷酸化多肽，有一定的实用性，在生物医药领域具有推广实用的潜在能力。

经研究发现，当采用第二缓冲液(体积浓度为50％～80％的乙腈水溶液,其中含有体积浓度为0.01％～0.1％的三氟乙酸TFA，即50％～80％ACN-H₂O，0.01％0.1％TFA)时，接枝精氨酸聚合物刷的磁性纳米球均可实现只对多磷酸化位点的磷酸化多肽的富集。