一种促发木本植物成年树萌发幼态芽的方法及基于幼态芽的快速繁殖种苗的方法

摘要

本发明公开了一种促发木本植物成年树萌发幼态芽的方法及基于幼态芽的快速繁殖种苗的方法。本发明将剥皮伤害处理结合吊瓶输液方法来促发木本植物成年树萌发幼态芽以利于其较容易完成其组织培养快速繁殖种苗的技术，综合利用伤害刺激和细胞分裂素对木本植物成年树促发幼态萌芽作用，为性状优良的成年树优选单株的组织培养快速繁殖种苗提供足够的外植体材料，从而高效地通过组织培养快速生产出优质的种苗，解决通常取的生理年龄较大的嫩芽为外植体时而导致的增殖和生根率不高的问题。采取该幼态芽为外植体，较易有效完成其增殖、生根过程，增殖和生根效果更好，十分利于木本植物成年树优秀单株的组织培养快速繁殖种苗，应用前景广阔。

说明书

技术领域：

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种促发木本植物成年树萌发幼态芽的方法及基于幼态芽的快速繁殖种苗的方法。

背景技术：

植物组织培养已广泛应用于农业生产中的多个领域，已经在种苗脱毒生产、种苗快速繁殖、植物新资源的规模化应用、植物新品种选育等方面给现代农业产生了深远的影响，是农业生物技术在现代农业应用上的典范，是现代种业的重要组成部分。目前，我国植物组培苗已经在花卉、果树、阴生植物、药用植物等取得了大面积的推广与应用，全世界植物组培苗的年贸易额已超过150亿美元，并且，每年以超过10％的速度在递增。利用基于离体培养技术的植物种苗组培快繁方法来生产种苗，比常规繁殖方法快万倍乃至十万倍以上，一个植株一年可以繁育几万到几百万个植株。利用组培快繁技术来繁殖种苗的成本非常低廉，比用常规的种苗生产方法生产成本低10倍以上。并且，对一些营养繁殖系数低且不能通过种子繁殖的农业植物(如香蕉等)、或在自然条件下种子难以萌发的植物(如铁皮石斛等)、或数量稀少的优良材料(如生产过程中发现的某些优良变异单株等)而言，如果没有组培快繁技术，要想实现其规模化产业化生产是非常困难的，对一些通过种子来繁殖时农艺性状会出现分离的作物(如番木瓜等)而言，如果没有种苗的组培脱毒快繁技术，要想进一步提高其生产效益也是非常困难的。正是基于种苗组培快繁技术在繁殖速度高和成本低廉等方面的优势，植物种苗组培快繁目前已在农业领域发展成了一个巨大的产业，并取得了巨大的社会经济效益。我省的种苗组培快繁产业年产值和技术在全国处于领先地位，目前我省涉及到利用组培快繁来生产种苗的农业植物有300多种，估计组培产业年产值在10亿元以上。

目前在国内的植物组培苗生产中能够成功进行大规模种苗生产的木本植物的种类比例远低于草本植物种类，从已有的报道当中公认木本植物组织培养难度比草本植物高很多，这也是能够进行商品化生产种苗的木本植物种类较少的原因。经过我们多年的研究发现，木本植物一般都是多年生，虽然采集的外植体是当年生的嫩芽，但其生理年龄已经比较大，而以此为外植体进行其组织培养快速繁殖种苗时，其增殖倍率和生根率往往比较低，难以将技术应用于商品化生产；相反如果能够从成年树中获取生理年龄低的幼嫩的萌芽，其组织培养难度大幅度降低，组织培养过程中的增殖倍率和生根率都比较高，其组织培养技术能应用于规模化种苗生产。

目前，国内已有木本植物成年树优良单株的组织培养快速繁殖种苗的报道，但未见促发木本植物成年树优良单株萌发幼态芽以较容易建立其组织培养技术体系的报道。

发明内容：

本发明的目的是针对木本植物组织培养难度大的问题，提出一种促发木本植物成年树萌发幼态芽的方法及基于幼态芽的快速繁殖种苗的方法。本发明通过剥皮伤害结合植物生长调节剂吊瓶输液处理来获取生理年龄小的幼态芽供其组织培养时采用的外植体，由此来降低木本植物组织培养难度，有效地完成其组培苗的生产过程，解决因生理年龄大的嫩芽为外植体时带来增殖和生根效率低下的问题。

本发明的第一个目的是提供促发木本植物成年树萌发幼态芽的方法，包括以下步骤：选择木本植物成年树优良单株，在旺盛生长期于树主干距离地面20-40厘米处往上进行剥皮，剥皮时保留韧皮部，剥皮宽度为6-10厘米，剥皮长度为50-100厘米，剥皮后将割口处的韧皮部修整平滑，切割韧皮部及形成层，然后将浓度为400-500mg/L的6-苄基腺嘌呤溶液输入到剥皮位置的韧皮部，定期施肥，其他按常规管理，直至树主干切口位置下方萌发出幼态芽。

所述的6-苄基腺嘌呤溶液的输入量优选为500-800毫升。

所述的将浓度为400-500mg/L的6-苄基腺嘌呤溶液输入到剥皮位置的韧皮部，其输液速度优选为0.05-0.1mL/min。

所述的定期施肥具体为：输液后根部灌施氮磷钾1:1:1复合肥1500倍稀释液2-3升，以后每隔10天灌施1次。

所述的木本植物优选为海南槐(Sophora tomentosa)、海南蒲桃(Syzygiumcumini(L.)Skeels)或檀香(Santalum album L.)。

本发明的第二个目的是提供木本植物组织培养快速繁殖种苗的方法，包括以下步骤：

a、不定芽诱导培养：将上述获得的幼态芽作为外植体，清水冲洗干净后剪去叶片，然后进行消毒处理，切取带节的顶芽接种至不定芽诱导培养基，培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，诱导获得不定芽；

b、不定芽增殖培养：将获得的不定芽接种至不定芽增殖培养基上进行增殖培养，培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，增殖培养得到的不定芽可用于不定芽生根培养或者继续不定芽增殖培养；

c、不定芽生根培养：切下单个不定芽插植至诱导不定根培养基，培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，培养获得出根苗；

或者，切下单个不定芽插植至诱导不定根培养基，培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，培养15-20天后将获得的无根苗插植至种植基质中，保持温度25℃-30℃，湿度80％-90％，培养获得出根苗。

当木本植物为海南槐(Sophora tomentosa)时，所述的不定芽诱导培养基优选为：以1/2MS培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加6-BA 0.5mg、NAA 0.01mg和蔗糖30g；所述的不定芽增殖培养基优选为：以1/2MS培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加6-BA 0.5mg、NAA 0.05mg、水解酪蛋白10mg和蔗糖30g；所述的诱导不定根培养基优选为：以1/2MS培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加IBA 1.0mg、NAA 0.2mg和蔗糖20g；

当木本植物为海南蒲桃(Syzygium cumini(L.)Skeels)时，所述的不定芽诱导培养基优选为：以WPM培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加6-BA 1.5mg、NAA 0.1mg和蔗糖30g；所述的不定芽增殖培养基优选为：以MS培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加6-BA 0.5mg、NAA 0.2mg和蔗糖30g；所述的诱导不定根培养基优选为：以WPM培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加IBA 2.0mg、NAA 0.2mg和蔗糖20g；

当木本植物为檀香(Santalum album L.)时，所述的不定芽诱导培养基优选为：以MS培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加6-BA 2.5mg、NAA 0.1mg和蔗糖30g；所述的不定芽增殖培养基优选为：以MS培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加6-BA 0.5mg、NAA 0.2mg和蔗糖30g；所述的诱导不定根培养基优选为：以1/2MS培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加IBA 5.0mg、NAA 2.0mg和蔗糖20g。

所述的木本植物优选为海南槐(Sophora tomentosa)、海南蒲桃(Syzygiumcumini(L.)Skeels)或檀香(Santalum album L.)。

步骤c所述的种植基质优选为蛭石。

所述的消毒处理具体为：将剪去叶片的外植体在体积分数70％的酒精中浸泡30秒，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒5～10分钟，无菌水冲洗4～5次。

本发明提供一种关于木本植物成年树的组织培养快速繁殖种苗技术的外植体采集关键环节解决办法，即是通过剥皮伤害处理结合吊瓶输液方法来促发木本植物成年树于树主干基部萌发出大量的幼态芽以利于其较容易完成其组织培养快速繁殖种苗的技术，综合利用伤害刺激和细胞分裂素对木本植物成年树促发幼态萌芽作用，为性状优良的成年树优选单株的组织培养快速繁殖种苗提供足够的外植体材料，且该幼态芽较为容易完成其的不定芽诱导、增殖、不定根的诱导等过程，从而高效地通过组织培养快速生产出优质的种苗，解决通常取的生理年龄较大的嫩芽为外植体时而导致的增殖和生根率不高的问题。采取该幼态芽为外植体，较易有效完成其增殖、生根过程，增殖和生根效果更好，十分利于木本植物成年树优良单株的组织培养快速繁殖种苗，应用前景广阔。

附图说明：

图1是对木本植物进行剥皮的示意图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

1.材料：此实施例的实验材料为从海南省文昌市引进种植于华南植物园展览区内的海南槐(Sophora tomentosa)。

海南槐又名岭南槐树，是苏木科(Caesalpiniaceae)槐属(Sophora)多年生灌木或小乔木，为海南特有野生观赏类植物和饲料用植物。海南槐具有较强的抗逆性和耐盐碱性，为海南乡土树种，具有很高的经济效益和社会效益、生态效益。

2.成年树优良单株筛选

通过实地调查与中国科学院华南植物园展览区内种植成年树海南槐，针对其株形、生长速度、抗逆性、适应性等生理生态指标以及观赏性等品质指标，运用方差分析、主成分分析等方法进行比较评价，筛选出具有适应性强、根系发达、主根深、抗风力强、耐旱、树冠优美、花朵艳丽、花期长等优点的优良单株。

3.剥皮伤害处理和吊瓶输液处理

在4-5月份，当气温回升、海南槐树开始进入旺盛生长期，此时利用锋利的手术刀于筛选出来的树胸径8厘米以上、树皮周长24厘米以上的海南槐树树主干离地面20厘米处进行剥皮伤害处理，由此位置往上进行剥皮，剥皮时保留韧皮部，剥皮宽度为10厘米，剥皮长度为50厘米，将割口处的韧皮部修整平滑，切割韧皮部及形成层(图1)。同时利用大树输液袋(1000毫升容量)将500毫升浓度为400mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)溶液通过插植于剥皮位置的韧皮部里的输液针输入到剥皮位置的韧皮部，输液速度为0.05mL/min。

4.剥皮和吊瓶输液处理后优良单株的施肥管理

对海南槐优良单株进行剥皮和吊瓶输液处理后将优良单株的周边杂草进行铲除，然后灌施氮磷钾1:1:1复合肥(美国进口花多多1号复合肥)1500倍稀释液3升，以后每隔10天灌施1次，其他按常规管理，使得优良单株生长能够获得充足光照、温度、湿度、气体等条件。

5.幼态芽的发生和外植体的获得

海南槐优良单株经剥皮和吊瓶输液处理两个月后于主干切口位置下方萌发出10个以上的幼态芽。当幼态芽长至3-5厘米高、3-5个节位时，利用锋利的手术刀片切下2-3个节位的顶芽为外植体。留下的1-2个节位的茎段很快萌发出芽来供不间断的优良单株的组织培养快速繁殖种苗所需要的幼态芽的外植体材料。

6.组织培养快速繁殖种苗

将外植体在自来水下冲洗干净后剪去叶片，在体积分数70％酒精中浸泡30秒，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒5分钟，无菌水冲洗4～5次，切取高1～2厘米带节的顶芽，接种到不定芽诱导培养基ST1，培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，诱导获得不定芽，外植体消毒成功率为70％以上。诱导出来的不定芽接种至不定芽增殖培养基ST2，培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，增殖获得大量不定芽，增殖倍数为3.8；不定芽生根采用一步生根法，切下高2-3厘米的单个不定芽插植至诱导不定根培养基ST3，培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，培养30天后可获得出根苗，生根率90％以上。不定芽诱导培养基ST1：以1/2MS培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加6-BA 0.5mg、NAA 0.01mg和蔗糖30g，pH6.0；不定芽增殖培养基ST2：以1/2MS培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加6-BA 0.5mg、NAA 0.05mg、水解酪蛋白10mg和蔗糖30g，pH5.8；诱导不定根培养基ST3：以1/2MS培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加IBA 1.0mg、NAA 0.2mg和蔗糖20g，pH5.8。

实施例2：

1.材料：此实施例的实验材料为从海南省文昌市引进种植于华南植物园展览区内的海南蒲桃(Syzygium cumini(L.)Skeels)。

海南蒲桃，别名：乌墨、乌楣，桃金娘科、蒲桃属常绿乔木，属南亚热带长日照阳性树种，喜光、喜水、喜深厚肥沃土壤，干湿季生长明显，能耐-5℃低温，垂直分布在海拔50～800m之间，适应性强，对土壤要求不严，无论酸性土或石灰岩土都能生长。根系发达，主根深，抗风力强，耐火，萌芽力强，速生。常见于平地次生林及荒地上。产台湾、福建、广东、广西、云南等省区。分布于中南半岛、马来西亚、印度、印度尼西亚、澳大利亚等地。树干通直，速生快长，周年常绿，树姿优美。花期长，白花满树，花浓香，花形美丽，洁净素雅；挂果期长，果实累累，果形美，果色鲜。为优良的庭院绿阴树和行道树种，也可作营造混交林树种。

2.成年树优良单株筛选

通过实地调查与中国科学院华南植物园展览区内种植成年树海南蒲桃，针对其株形、生长速度、抗逆性、适应性等生理生态指标以及材质等品质指标，运用方差分析、主成分分析等方法进行比较评价，筛选出具有适应性强、根系发达、主根深、抗风力强、耐火、耐旱、树干通直、树冠优美、花朵清香木材、材质好、结构细致、有光泽、耐腐等优点的优良单株。

3.剥皮伤害处理和吊瓶输液处理

在4-5月份，当气温回升、海南蒲桃树开始进入旺盛生长期，此时利用锋利的手术刀于筛选出来的树胸径8厘米以上、树皮周长24厘米以上的成年海南蒲桃树主干离地面40厘米处进行剥皮伤害处理，由此位置往上进行剥皮，剥皮时保留韧皮部，剥皮宽度为10厘米，剥皮长度为100厘米，将割口处的韧皮部修整平滑，切割韧皮部及形成层。同时利用大树输液袋(1000毫升容量)将600毫升浓度为400mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)溶液通过插植于剥皮位置的韧皮部里的输液针输入到剥皮位置的韧皮部，输液速度为0.05mL/min。

4.剥皮和吊瓶输液处理后优良单株的施肥管理

对海南蒲桃优良单株进行剥皮和吊瓶输液处理后将优良单株的周边杂草进行铲除，然后灌施氮磷钾1:1:1复合肥(美国进口花多多1号复合肥)1500倍稀释液2升，以后每隔10天灌施1次，其他按常规管理，使得优良单株生长能够获得充足光照、温度、湿度、气体等条件。

5.幼态芽的发生和外植体的获得

海南蒲桃优良单株经剥皮和吊瓶输液处理两个月后于主干切口位置下方萌发出20个以上的幼态芽。当幼态芽长至3-5厘米高、3-5个节位时，利用锋利的手术刀片切下2-3个节位的顶芽为外植体。留下的1-2个节位的茎段很快萌发出芽来供不间断的海南蒲桃优良单株的组织培养快速繁殖种苗所需要的幼态芽的外植体材料。

6.组织培养快速繁殖种苗

将外植体在自来水下冲洗干净后剪去叶片，在体积分数70％酒精中浸泡30秒，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒10分钟，无菌水冲洗4～5次，切取高1～2厘米带节的顶芽，接种到不定芽诱导培养基SY1，培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，诱导获得不定芽，外植体消毒成功率为80％以上。诱导出来的不定芽接种至不定芽增殖培养基SY2，培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，增殖获得大量不定芽，增殖倍数为4.3；不定芽生根采用一步生根法，切下高2-3厘米的单个不定芽插植至诱导不定根培养基SY3，培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，培养30天后可获得出根苗，生根率95％以上。不定芽诱导培养基SY1：以WPM培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加6-BA 1.5mg、NAA 0.1mg和蔗糖30g，pH5.8；不定芽增殖培养基SY2：以MS培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加6-BA 0.5mg、NAA 0.2mg和蔗糖30g，pH5.8；诱导不定根培养基SY3：以WPM培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加IBA2.0mg、NAA 0.2mg和蔗糖20g，pH5.8。

实施例3：

1.材料：中国科学院华南植物园合作企业推广种植的檀香种植试验基地中的檀香(Santalum album L.)优良单株。

檀香(Santalum album L.)为檀香科(Santalaceae)檀香属(Santalum)半寄生常绿乔木，为名贵、珍稀植物，主要分布于印度，印度尼西亚，澳大利亚及太平洋的一些群岛。人类利用它已有数千年的历史，因其木材可用于雕刻和提炼檀香油而格外出名，素有“绿色黄金”之称。檀香木是提取檀香油的原材料，它含有α和β檀香醇等成分，其主要用于化妆品、香料、药材和高级工艺雕刻品等的原料；它含有的抗菌和抗肿瘤成分，作为传统中药，可用于安神、洁净空气以及治疗一些顽固疾病。

多年来，人们一直希望能够以人工栽培方式发展檀香木产业，实现较高的经济回报。国内外研究人员已经对檀香的组培快繁进行大量的研究。檀香种子实生苗出现分离，需要筛选出生长势强，结香期短，心材比例、含有率高优秀单株。由此可见，培育檀香新品系是提高其经济价值的有效途径之一。目前，我国在檀香属种源筛选、杂交育种、优良品系的创新等方面仍较空白，如不及时进行种质资源和技术创新，势必制约我国檀香产业的发展，无法摆脱完全依赖进口的被动局面。因此，在我国发展檀香产业和寻找其它经济有效的方法以提高檀香的经济效益势在必行。

2.成年树优良单株筛选

通过实地调查与中国科学院华南植物园合作的企业于东莞推广种植成年树檀香，针对其株形、生长速度、抗逆性、适应性等生理生态指标以及心材比例、含油量等品质指标，运用方差分析、主成分分析等方法进行比较评价，筛选出一株生长速度快、树形笔直、适应性和抗逆性强、檀香精油率大于3.0％的优良单株。

3.剥皮伤害处理和吊瓶输液处理

在4-5月份，当气温回升、檀香树开始进入旺盛生长期，此时利用锋利的手术刀于筛选出来的树胸径8厘米以上、树皮周长24厘米以上的成年檀香树树主干离地面30厘米处进行剥皮伤害处理，由此位置往上进行剥皮，剥皮时保留韧皮部，剥皮宽度为6厘米，剥皮长度为90厘米，将割口处的韧皮部修整平滑，切割韧皮部及形成层。同时利用大树输液袋(1000毫升容量)将800毫升浓度为500mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)溶液通过插植于剥皮位置的韧皮部里的输液针输入到剥皮位置的韧皮部，输液速度为0.1mL/min。

4.剥皮和吊瓶输液处理后优良单株的施肥管理

对檀香树优良单株进行剥皮和吊瓶输液处理后将优良单株的周边杂草进行铲除，然后灌施氮磷钾1:1:1复合肥(美国进口花多多1号复合肥)1500倍稀释液3升，以后每隔10天灌施1次，其他按常规管理，使得优良单株生长能够获得充足光照、温度、湿度、气体等条件。

5.幼态萌芽的发生和外植体的获得

檀香树优良单株经剥皮和吊瓶输液处理两个月后于主干切口位置下方萌发出10个以上的幼态芽，当幼态芽长至3-5厘米高、3-5个节位时，利用锋利的手术刀片切下2-3个节位的顶芽为外植体。留下的1-2个节位的茎段很快萌发出芽来供不间断的檀香树优良单株的组织培养快速繁殖种苗所需要的幼态芽的外植体材料。

6.组织培养快速繁殖种苗

将外植体在自来水下冲洗干净后剪去叶片，在体积分数70％酒精中浸泡30秒，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒10分钟，无菌水冲洗4～5次，切取高1～2厘米带节的顶芽，接种到不定芽诱导培养基S1，培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，诱导获得不定芽，外植体消毒成功率为75％以上。诱导出来的不定芽接种至不定芽增殖培养基S2，培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，增殖获得大量不定芽，增殖倍数为3.55；不定芽生根采用两步生根法，切下高2-3厘米的单个不定芽插植至诱导不定根培养S3，培养温度为(28±2)℃，光照度2000～3000lx，光照时间12h/d，培养15-20天后再将无根苗插植至玻璃温室中蛭石基质中，保持温度25℃-30℃，湿度80％-90％，培养20天后可获得出根苗，生根率90％以上。不定芽诱导培养基S1：以MS培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加6-BA 2.5mg、NAA 0.1mg和蔗糖30g，pH5.8；不定芽增殖培养基S2：以MS培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加6-BA 0.5mg、NAA 0.2mg和蔗糖30g，pH5.8；诱导不定根培养S3：以1/2MS培养基为基础培养基，每升基础培养基中添加IBA5.0mg、NAA 2.0mg和蔗糖20g，pH5.8。