一种植物-微生物联合修复煤炭矿区土壤的方法

摘要

本发明属于土壤生物修复技术领域，具体涉及修复煤炭矿区土壤的方法。一种植物‑微生物联合修复煤炭矿区土壤的方法，该方法通过将三毛草种子暴晒、浸种、发芽，再将发芽后的草种播种于盛装有育苗基质的穴盘中出苗、育苗，其后施加由嗜酸氧化亚铁硫杆菌、云芝栓孔菌、副冠球囊霉组成的混合菌剂，待矿区污染土壤平整、改良、挖沟后将幼苗埋于沟中回土覆苗，经田间管理，生长90‑120天后收割。通过这一方法，经过一次或多次种植后，煤炭矿区土壤的理化指标可以显著改善，达到正常标准，为广大煤炭矿区的土壤治理提供了新的途径，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于土壤生物修复技术领域，具体涉及修复煤炭矿区土壤的方法。

背景技术

煤炭在我国的能源消费中一直有着较高的占比，虽然随着绿色发展理念以及2016年煤炭行业积极化解过剩产能等政策的推行，使得煤炭在一次能源消费占比中已连续五年呈下降趋势，从2010年的70.2%降至了2016年的62.3%，但是，在未来相当长时期内，我国仍是以煤炭为主的能源结构。在煤炭的开发利用过程中，不可避免地会对矿区生态安全产生破坏，具体表现在土壤的污染与损害、水体的污染与损害、大气污染、噪声污染、生物资源的损害、矿区生态环境的损害等方面，土壤的重金属污染就是其中一个主要的方面。煤矿区土壤中的重金属主要来源于3个方面：（1）煤矿开采过程中产生的粉尘迁移沉降，在风力作用下，使煤矿粉尘在煤矿周围土壤中被重新分布，通过淋溶渗滤进入到土壤中，增加了对周围土壤的污染；（2）煤矿开采产生的煤矸石中含有浓度较高的重金属，煤矸石堆放过程中在大气降水的冲刷和淋溶作用下随地表径流进入土壤中，或经风蚀以扬尘的形式悬浮于大气中，最终降落于矸石堆周围的土壤中；（3）对矿石及围岩有较高溶解性和侵蚀性的煤矿酸性废水可加剧矿石及围岩中重金属的溶解，并携带大量重金属等有害化学物质进入水体，污染灌溉土壤。对于我国的产煤大省，如山西省、陕西省、内蒙古自治区等地，煤矿周边地区的环境、土壤状况都受到了严重影响，土壤重金属含量高、种类多，土壤几乎丧失生产能力，有的土壤即使能够种植农作物，也由于重金属渗入而致使农作物中含有大量重金属成分，如果通过食物链进入人体，对于健康造成的危害是不可想象的，对周边居民的生命健康造成了极大的威胁。因此，煤炭矿区土壤的修复和治理势在必行。

现有的煤矿区土壤修复治理方法，主要有物理化学修复、生物修复，还包括处于研究阶段的粘土修复。物理化学修复主要是对土壤进行淋洗、化学固化或是电动修复等，这些技术不仅成本高，不宜大规模实行，而且会带来土壤活性的降低，虽然阻止了重金属污染的蔓延，但并未对土壤的恢复起到改善作用，因此应用也极少。而近年来，生物修复得到了研究者的青睐。生物修复技术主要是利用系统中的生物或微生物的代谢活动来改善土壤理化性质，提高土壤生物活性，从而使土壤生态环境部分或完全地恢复到原始状态的过程。具体到煤炭矿区土壤的修复来说，主要是通过将一些重金属吸收能力强的植物、微生物植于污染区内，使得重金属与土壤分离，从而减少污染、恢复土壤，此举虽有效果，但往往耗时较长。专利CN106607454A公开了一种煤矿塌陷区铬污染土壤修复方法，首先采用网格多点法进行土壤样品采集，然后对所采集的土壤样品的铬含量进行测定，并依据土壤铬含量测定结果将土壤划分等级，然后翻耕铬污染土壤表层的土壤，再根据所划分的土壤等级施撒对应用量的微生物菌剂和土壤改良颗粒，最后对铬污染土地进行灌溉，并保持土壤相对湿度达85％以上10～20天即可。并且在文献中指出这一方法修复效率高、成本低，无二次污染，因地制宜，能更加精准快速的修复煤矿塌陷区铬污染土壤，有效阻止铬在土壤中迁移，并且在土壤修复过程中长期为土壤提供营养元素，提高土壤的可利用价值。但是这种方法仅仅是采用了单一的微生物修复技术，修复效率没有经过实验验证，缺乏说服力。并且，这一方法仅针对土壤重金属污染物中的铬元素有效，其他主要重金属污染物，如铜、铅、汞、砷等仍然得不到有效处理，土壤污染状况无法得到彻底改善，也就限制了这一方法的实际应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种修复煤炭矿区土壤的方法，利用两种不同类型生物修复手段之间产生的协同作用，实现单一生物修复手段无法达到的修复效果，同时能够针对多种不同的重金属进行生物吸收，彻底改善土壤品质，提高煤炭矿区土壤的利用价值。

本发明所采用的技术方案是：一种植物-微生物联合修复煤炭矿区土壤的方法，按照如下步骤进行：

步骤一、按照质量百分比，将含水量12-15%的三毛草种子在质量百分比浓度为1%的石灰水中浸泡1-2小时后捞出均匀平铺，然后用湿润的棉纱布覆盖，保持温度20-30℃每天浇水2-4次，单次浇水量以棉纱布不能再容纳水为准，直至三毛草种子发芽；

步骤二、将发芽的三毛草种子植入装有育苗基质的育苗穴盘中，淹埋1.5-2cm，每个穴盘植入2-3粒，保持温度22-32℃，育苗基质相对湿度为65-85%，每天浇水2-3次，单次浇水量以穴盘底部开始渗出水为准，直至三毛草的苗株钻出地面；

步骤三、苗株钻出地面后，控制育苗穴盘温度为25-35℃，育苗基质相对湿度为60%-80%，每天浇水2-3次，单次浇水量以育苗穴盘底部开始渗出水为准，除白天接受太阳光正常照射外，每天3:30-5:30使用光照强度为2200-2300Lx的蓝色光进行补光处理，21:30-23:30使用光照强度为1800-2000Lx的绿色光进行补光处理，当苗株长至露出3厘米时，去除多余的苗株，每个育苗穴盘中保留一株苗株，对育苗穴盘里没有出苗的穴孔进行补苗，同时人工清理杂草；

步骤四、完成步骤三后，将混合菌稀释液施加于长有苗株的育苗穴盘中，施加量以育苗穴盘底部开始渗出混合菌稀释液为止，混合菌稀释液的配置过程为将嗜酸氧化亚铁硫杆菌、云芝栓孔菌、副冠球囊霉固体菌剂按照质量比(5-7):(2-3):(1-2)混合，得到混合菌剂，接着用蒸馏水将混合菌剂稀释100倍，得到混合菌稀释液；

步骤五、将施加过混合菌稀释液的苗株移植到经过预处理的矿区受污染的土壤中，生长过程不定期浇水确保土壤水分不低于田间持水量的50%，生长超过30厘米后，割去三毛草茎秆，检测土壤理化指标是否达标，如不达标，重复种植一次或者多次。

作为一种优选方式：步骤二中育苗基质的配置过程为，将质量比将田园土25-35份、腐殖质9-13份、炭化稻壳4-6份、鸡粪3-5份混合均匀，然后喷洒多菌灵进行消毒，多菌灵的喷洒量为每1立方米喷洒5升500倍液的多菌灵。

作为一种优选方式：步骤四中嗜酸氧化亚铁硫杆菌、云芝栓孔菌、副冠球囊霉固体菌剂按照质量比为5:3:1。

作为一种优选方式：步骤五中矿区受污染的土壤的预处理过程为，将矿区受污染的土壤进行平整，随后在土壤表面施加腐殖酸，厚度为2-3厘米，接着将土壤表层以下30厘米厚的土壤与腐殖酸通过翻耕混合均匀，20天后挖沟，沟深0.25米，行距0.6-0.8米。

作为一种优选方式：步骤五中的移植过程为，将施加过混合菌稀释液的苗株连同附土从育苗穴盘移植于沟中，回土覆盖厚度为10-20厘米，种植密度为每平米800-1200株。

本发明生物修复所涉及的植物、微生物品种的基本情况如下：

三毛草（Trisetumbifidum）别名蟹钩草，属禾本科，多年生草本植物，生长于海拔490-2500米的山坡路旁、林荫处及沟边湿草地。多见于我国甘肃、西藏、陕西、河南、江苏、安徽、浙江、福建、江西、湖北、湖南、四川、贵州、云南、广西、广东等省区。适宜在肥沃的壤土或沙壤土上生长，较能耐酸性土壤。早春萌发，生长较快，5月开花，6月结实，种籽成熟后易脱落，主要行种子繁殖。

嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillusferrooxins）为好氧化能自养微生物，以空气中的CO₂为碳源，靠氧化基质中的Fe²⁺为Fe³⁺和无机硫为硫酸根而获得能量。这一特性使其在细菌冶金、酸性废水处理、烟气脱硫和煤炭脱硫等领域具有潜在的应用价值。

云芝栓孔菌（Trametes>）属担子菌门木腐真菌，又称杂色云芝、彩绒革盖菌、杂色云芝、云芝蘑等。研究发现其含甾体类、三萜类、有机酸类、生物碱类、葡糖醇类、蛋白质类、糖类、糖肽类等化合物。该菌多用于保健品，在环保领域中仅在废水处理和治理土壤镍污染方面有所应用。

副冠球囊霉（Glomus>）属于丛枝菌根真菌的一种，孢子单生于土壤中，球形或半球形或不规则形，80～150×95～230um。桔黄至黄棕色。孢子壁两层，外壁为透明壁，厚度为1．5~3．5um，这层壁易随孢子成熟而脱落故不易观察到；黄色至棕色的内壁厚度可达4～6um，菌丝连点宽大，可达30～42um，典型的漏斗状，连孢菌丝与孢子连接处常由一个弯曲的隔分开，目前在用作植物菌肥方面有所研究和应用。

本发明修复煤炭矿区土壤的作用机制如下：

植物-微生物联合修复技术是利用植物与微生物构成的复合体系来共同降解污染物，清除环境污染物的一种污染处理技术。此方法利用土壤、微生物、植物的共存关系，充分发挥植物与微生物修复技术各自优势，弥补不足，进而提高土壤中污染物的植物修复效率，最终达到彻底修土壤的目的。将微生物与植物结合起来形成共生体，如菌根，可以减少植物根系对重金属的吸收，促进植物的快速定植，因此在矿区生态修复中非常必要。

丛枝菌根真菌作为一种普遍存在于陆生植物根际的有益共生微生物，能够与陆地上80%的植物形成共生体，可以在贫瘠条件下通过其庞大的菌丝网络来提高植物对矿质养分的吸收能力；极端环境下，通过营养改善增强植物的抗重金属性、抗旱能力、抗菌能力以及固碳能力，最终极大地改善土壤的微生境。

三毛草对于生长环境的适应性较强，能够耐受酸性土壤环境，当定植于煤炭矿区土壤后，其根系能够吸收土壤中的多种重金属，如铜、锌、铅、铬、汞等，且生长期仅为3个月左右，能够在短时期内重复生长、收割，提高土壤修复效率。混合菌剂中的副冠球囊霉不仅可以与植物形成共生体，提高植物吸收重金属的能力，还可以与嗜酸氧化亚铁硫杆菌和云芝栓孔菌共同形成稳定的微生态环境，分解土壤中的有机污染物。更为重要的是，施用三者组成的复合菌剂，能够比仅施用单一的丛枝菌根真菌进一步显著提高三毛草对于重金属的吸收效率和耐受能力，提高煤炭矿区污染土壤的修复效果，使得这一技术具备了实际推广应用的可行性。

本发明的有益效果为：

（1）本发明通过对多种生长期较短的草本植物进行田间试验，确定了三毛草作为修复植物，并且实现了预期的修复效果。三毛草在之前的研究中仅仅是作为畜牧饲草有些许应用，而将其应用于重金属土壤的修复尚属首次。

（2）本发明通过对多种已经应用于土壤修复的微生物进行筛选和配比，最终确定了嗜酸氧化亚铁硫杆菌、云芝栓孔菌、副冠球囊霉这一组合。三种菌在本发明的技术方案中起到了差异化的作用，并且相互配合，比起施用单一菌种更加具有协同增效的作用，上述微生物不仅能够有效促进三毛草的定植及提高三毛草根系吸收重金属离子的能力，还可以活化土壤中的重金属，提高生物有效性。

（3）本发明具体是通过先促进草种发芽，再利用育苗穴盘培育幼苗，最后将幼苗埋于矿区土壤生长的方式实现三毛草的定植，这一方式比起普通的在土壤中直接播撒草籽，能够大大提高三毛草的存活率。并且在育苗时通过优化育苗基质的配比、出苗后分时段分波长进行补光处理，促进了植物幼苗的生长发育，且提高了在煤炭矿区土壤定植后幼苗的耐受能力，幼苗定植后生长状况有了显著改善。

（4）本发明对煤炭矿区土壤施加腐殖酸进行反应，从而改善了土壤的理化性质，利于三毛草幼苗的定植和生长。合理的栽植密度及田间管理也对于最终修复效果的最大化有着不可忽略的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详述。

利用三毛草和混合菌剂进行煤炭矿区土壤修复：

（1）在气候温度高于10℃的条件下，将三毛草种子平铺于覆盖有塑料薄膜的地面，利用阳光进行暴晒，暴晒累计时间为24小时，随后采用浓度为1%的石灰水浸种，浸泡2小时后捞出草种，将草种均匀平铺于沙土上，采用润湿的棉纱布将其覆盖，保持温度25℃，每天浇水3次，单次浇水量以润湿棉纱布为准，直至草种发芽；

（2）按照田园土25份、腐殖质13份、炭化稻壳5份、鸡粪4份的配比配制成育苗基质，随后喷洒多菌灵进行消毒，喷洒量为每1立方米育苗基质喷洒5L 500倍液的多菌灵，随后将育苗基质盛装于育苗穴盘中，再将发芽后的草种播种于育苗穴盘中，控制育苗温度为28℃、基质相对湿度为80%，每天浇水3次，单次浇水量以穴盘底部渗出少许水为宜，直至出苗；

（3）出苗后，控制育苗温度为28℃、基质相对湿度为75%，每天浇水3次，单次浇水量以穴盘底部渗出少许水为宜，并且每天3:30-5:30使用光照强度为2200Lx的蓝色光进行补光处理、21:30-23:30使用光照强度为2000 Lx的绿色光进行补光处理，当幼苗株长至达3厘米时，去除穴孔中多余的幼苗，保证单个穴孔只保留一株幼苗，并且对育苗穴盘里没有出苗的穴孔进行补苗，同时人工清理杂草；

（4）酸氧化亚铁硫杆菌、云芝栓孔菌、副冠球囊霉的来源如下：嗜酸氧化亚铁硫杆菌购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3265；云芝栓孔菌购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12241；副冠球囊霉购买于中国丛枝菌根真菌种质资源库，保藏编号为BGC NM06A。

使用时，预先制备副冠球囊霉固体菌剂，以过筛的河沙为基质，经121℃下高压蒸汽灭菌后，自然状态下放置8天，然后装2 Kg放入盆中，接种100g副冠球囊霉原种，拌匀后加入基质重量25％的自来水，播种沙蒿种子，保持正常生长，五至六个月后即可得到被副冠球囊霉菌侵染的宿主植物和含有副冠球囊霉菌孢子、根外菌丝的基质；沙蒿地上部分剪去，剪碎根段，并与含有副冠球囊霉菌孢子、根外菌丝的基质混匀，即制得副冠球囊霉固体菌剂。

将酸氧化亚铁硫杆菌、云芝栓孔菌分别接入不同的摇瓶液体培养基中，于摇瓶振荡器中恒温培养，收集种子液，随后分别加入装有不同培养基的小型发酵罐中继续扩大培养，使活菌数的数量达到1×10⁸个/ml。酸氧化亚铁硫杆菌所用的培养基每1L中包括：FeSO₄·7H₂O44.7g，(NH₄)2SO₄3.0g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，KCl0.1g，Ca(NO₃)20.01g，培养基的pH值为2。云芝栓孔菌所用的培养基每1L中包括：KH₂PO₄>2HPO₄>4·7H₂O>2>4·7H₂O>4·7H₂O>4·5H₂O>

将经扩大培养后的嗜酸氧化亚铁硫杆菌、云芝栓孔菌分离得到菌体，与事先获得的副冠球囊霉固体菌剂按照质量比以嗜酸氧化亚铁硫杆菌：云芝栓孔菌：副冠球囊霉固体菌剂=5:3:1混合，得到混合菌剂，接着用蒸馏水将其稀释100倍，得到混合菌稀释液，将混合菌稀释液施加于长有幼苗的各穴孔中，单次施加量以穴盘底部渗出少许稀释液为宜；

（5）选择了位于山西省忻州市宁武县的某国有煤矿，圈定试验范围为煤矿开采区区域中心半径5公里内的废弃土地，将矿区受污染的土壤进行平整，随后在土壤表面施加腐殖酸（腐殖酸原粉购买自山西金沃腐殖酸科技有限公司，有效成分含量为：腐植酸≥50%，有机质≥80%，水份≤20% 水份≤25%）厚度为2.5厘米，接着将土壤表层以下30厘米厚的土壤与腐殖酸通过翻耕混合均匀，反应20天，随后按照0.7米的行距挖沟，沟深0.25米，将施加过混合菌稀释液的三毛草幼苗连同附土从育苗穴盘的穴孔中取出，埋于沟中，然后回土将种苗覆盖，回土覆盖厚度为15厘米，种植密度为每平米1000株；

（6）对种植的三毛草进行田间管理，根据土壤水分实际情况不定期浇水确保土壤水分不低于田间持水量的50%，三毛草经生长100天后，进行收割。

同时，按照完全相同的试验条件种植三毛草修复圈定试验范围内的受污染土地，区别仅在于在步骤（4）中用单一的副冠球囊霉替代混合菌剂，其他涉及到菌种扩大培养及施加菌剂的各项参数均不变，作为植物与单一菌剂修复对照例。

土壤重金属含量变化测定及三毛草收割后的重金属吸附能力测定：

土壤中的重金属含量测定采用如下方法：去除土壤样品中的碎石、植物残根等杂物，风干后过100目筛备用。采用HNO₃:HF:HClO₄(v:v=4:4:2)的混合酸液消解，用普析TAS-900原子吸收分光光度计测定铜、锌、铅、铬、汞、砷的含量。

收割后三毛草植物体中的重金属含量测定采用如下方法：将三毛草植株连同根系在105℃杀青30 min，随后于75℃烘干至恒重并粉碎，过100目筛。随后采用HClO₄:HNO₃（v:v=2:5）的混合酸液消解，用普析TAS-900原子吸收分光光度计测定铜、锌、铅、铬、汞、砷的含量。

利用上述测定方法，分别测定山西省忻州市宁武县的某国有煤矿试验范围内原始土壤中重金属铜、锌、铅、铬、汞、砷的含量（样品1），经三毛草修复一个周期之后的土壤中重金属铜、锌、铅、铬、汞、砷的含量（样品2），一个修复周期完成后所收割的三毛草中重金属铜、锌、铅、铬、汞、砷的含量（样品3），以及一个修复周期完成后所收割的植物与单一菌剂修复对照例三毛草中重金属铜、锌、铅、铬、汞、砷的含量（样品4），每组样品做三个平行，各项测试指标见表1-4。

表1 原始土壤中重金属铜、锌、铅、铬、汞、砷的含量（mg/Kg）

表2经三毛草修复一个周期之后的土壤中重金属铜、锌、铅、铬、汞、砷的含量（mg/Kg）

表3一个修复周期完成后所收割的三毛草中重金属铜、锌、铅、铬、汞、砷的含量（mg/Kg）

表4 一个修复周期完成后所收割的植物与单一菌剂修复对照例三毛草中重金属铜、锌、铅、铬、汞、砷的含量（mg/Kg）

从上述实验结果可以看出，三毛草作为煤炭矿区土壤修复植物，能够在一个生长周期内就使得土壤中超过国家土壤环境质量I级标准的铜、锌、铅、铬、汞、砷这几种重金属含量指标得到显著下降，除铅以外的其他几种重金属元素含量完全降低到标准最高限制值之下，获得了良好的修复效果。并且，比起仅施加副冠球囊霉稀释液的对照例而言，施加有混合菌稀释液的三毛草在其生长周期内对于铜、锌、铅、铬、汞、砷这几种重金属的吸收能力均有显著提高，混合菌稀释液对于三毛草的重金属吸收能力起到了不可忽视的作用，从而使得这一土壤生物修复方法更加具备推广实施的前景。

虽然在实施例中已经通过一般性说明、具体实施方式及试验对本发明做出了详尽的描述，但在不偏离本发明核心的基础上，仍可以做出的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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