用于测定转肽酶A活性的多肽探针对、测定转肽酶A活性的方法及二者的应用

摘要

本发明提供了一种用于测定转肽酶A活性的多肽探针对、测定转肽酶A活性的方法及二者的应用，涉及生物检测技术领域，本发明提供的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对，包括具有反应区、互补区和染料结合区的第一多肽探针和第二多肽探针，具有特异性强、准确度好、灵敏度高的优点，无需进行修饰或标记处理，就能够达到测定转肽酶A活性的目的。本发明提供的测定转肽酶A活性的方法，包括将上述的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对与待测样本于转肽反应缓冲液中混合并孵育，再用双砷染料来标记孵育后的反应产物，通过孵育后的反应产物与双砷染料结合形成复合物的荧光水平来判定转肽酶A的活性，操作简单、方便。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种用于测定转肽酶A活性的多肽探针对、测定转肽酶A活性的方法及二者的应用。

背景技术

细菌表面蛋白在病原菌的感染过程(如粘附、免疫逃逸、生物膜形成) 中发挥重要作用，是决定病原菌感染严重性不可缺少的致病因素(Nat.Rev. Microbiol.,2014,12,49-62)。在革兰氏阳性细菌中，表面蛋白正确锚定到细胞壁需要转肽酶所催化的转肽反应。通常，表面蛋白以前体的形式被合成出来，前体蛋白的N端包含有一个分泌信号肽，C端包含有一个LPXTG(X 代表任意一种氨基酸)结构域，一个疏水区以及一个带正电荷残基的末端。 N端的信号肽会指引前体蛋白通过分泌途径运送至细胞外，在分泌过程中， N端的信号肽会被切除，C端的疏水区和正电荷尾部会将表面蛋白前体保留在胞膜内。随后，结合在细胞膜上的转肽酶会切割LPXTG氨基酸序列中苏氨酸和甘氨酸之间的共价键，形成一个硫酯酶中间体，硫酯酶中间体会被 II型类脂上游离的氨基亲核攻击，将表面蛋白共价结合到肽聚糖的交连桥上，脂连接的表面蛋白进一步通过转糖苷作用和转肽作用整合到细胞壁上。通过这一作用方式，转肽酶将20多种毒力因子蛋白锚定到细菌细胞壁上。转肽酶基因的缺失或转肽酶活性的丧失会导致多种表面蛋白不能定位到细菌表面，并且会降低细菌的感染能力和粘附能力。但是转肽酶并不是细菌生存与生长所必需的，抑制转肽酶的活性不会对病原菌带来生存压力从而产生耐药性，因此转肽酶成为抗感染新药研发的理想药物靶标。

当前，有多种方式来对转肽酶活性进行测定，其中最常用的是荧光淬灭活性检测法，该方法需要在LPXTG基序的一端修饰一个荧光基团，在另一端修饰一个淬灭基团，荧光基团和淬灭基团之间由于发生荧光共振能量转移因而会淬灭荧光基团的信号，转肽酶对底物的切割作用会将淬灭基团和荧光基团分离开来，从而恢复荧光基团的荧光特性。对于荧光淬灭活性检测法，主要存在两个问题：一是需要对底物进行标记，二是只能测定转肽酶的切割活性，而不能测定其转肽能力。此外，纤连蛋白结合法、HPLC-MS 检测法、基于酵母表面展示的荧光测定法也被用来测定转肽酶的活性，纤连蛋白结合法具有操作繁琐、检测特异性不好等缺点，HPLC-MS检测法需要昂贵的仪器和专业的操作，基于酵母表面展示的荧光测定法虽然可以来高通量筛选靶向转肽酶的抑制剂，但是检测灵敏度有限。这极大限制了“非抗生素类”药物的研发进程。

因此，迫切需要开发一些简单、高效、灵敏的方法来测定转肽酶的活性，加速非抗生素类抗感染新药的研发。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种用于测定转肽酶A活性的多肽探针对，以缓解现有技术中存在的用于测定转肽酶A活性的多肽探针均需要进行标记、制备繁琐、灵敏度有限的技术问题。

本发明的第二个目的在于提供一种测定转肽酶A活性的方法，以缓解现有技术中存在的测定转肽酶A活性的方法操作繁琐、灵敏度较低、需要专业技术人员才能实现的技术问题。

本发明的第三个目的在于提供上述的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对或测定转肽酶A活性的方法在测定革兰氏阳性菌潜在致病能力中的应用。

本发明提供了一种用于测定转肽酶A活性的多肽探针对，所述多肽探针对包括第一多肽探针和第二多肽探针；

所述第一多肽探针和第二多肽探针分别包括反应区、互补区和染料结合区；

所述反应区用于参与转肽酶A介导的转肽反应，使所述第一多肽探针和第二多肽探针结合为嵌合多肽；所述互补区用于使所述嵌合多肽自组装成发夹结构；所述染料结合区用于结合染料。

进一步地，所述互补区为可形成发夹结构的多肽片段。

进一步地，所述第一多肽探针的反应区的氨基酸序列为LPXTGX，所述第一多肽探针的互补区的氨基酸序列为PSQPTYPG，所述第一多肽探针的染料结合区的氨基酸序列为CC；

其中，所述第一多肽探针的反应区的氨基酸序列LPXTGX中的X为除半胱氨酸外的任意一种氨基酸；

优选地，所述第一多肽探针的反应区的氨基酸序列为LPATGG。

进一步地，所述第二多肽探针的反应区的氨基酸序列为GG，所述第二多肽探针的互补区的氨基酸序列为VEDLIRFYDNLQQYLNV，所述第二多肽探针的染料结合区的氨基酸序列为CC。

进一步地，所述第一多肽探针具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述第二多肽探针具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

进一步地，所述染料为双砷染料；

优选地，所述双砷染料为FlAsH-EDT₂、ReAsH-EDT₂、F2FlAsH或>

本发明还提供了一种测定转肽酶A活性的方法，包括：

将上述的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对与待测样本于转肽反应缓冲液中混合并孵育，得到反应产物，通过所述反应产物与双砷染料结合形成复合物的荧光水平来判定转肽酶A的活性。

进一步地，所述转肽反应缓冲液中包含还原剂，所述还原剂优选为二硫键还原剂，更优选为DTT。

进一步地，所述转肽反应缓冲液包括：Tris·HCl 40-60mmol/L、NaCl 120-180mmol/L、CaCl₂>

优选地，所述转肽反应缓冲液由如下组分组成：Tris·HCl 45-55mmol/L、 NaCl130-170mmol/L、CaCl₂>

另外，本发明还提供了上述的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对或测定转肽酶A活性的方法在测定革兰氏阳性菌的潜在致病能力中的应用。

本发明提供的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对，包括具有反应区、互补区和染料结合区的第一多肽探针和第二多肽探针。本发明提供的多肽探针对的反应区，能够特异性参与转肽酶A介导的转肽反应，保证了多肽探针对具有特异性强、准确度好、灵敏度高的优点。转肽酶A介导的转肽反应会使第一多肽探针和第二多肽探针形成一个新的嵌合多肽，而互补区能够使新形成的嵌合多肽通过分子内互补发生自身回折，形成特定的空间构象，该空间构象能够结合染料使染料发出荧光，未连接的第一多肽探针和第二多肽探针则无法结合染料使染料发出荧光，从而使本发明提供的多肽探针对能够达到测定转肽酶A活性的目的，操作简单，节约人力物力。并且，应用多肽分子作为检测探针，与测定靶标转肽酶A之间具有较好的生物相容性。

本发明提供的测定转肽酶A活性的方法，包括将上述的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对与待测样本于转肽反应缓冲液中混合并孵育，得到反应产物，通过所述反应产物与双砷染料结合形成复合物的荧光水平来判定转肽酶A的活性。由于双砷染料只有在与嵌合多肽结合的情况下才会发出荧光，不会与第一多肽探针和第二多肽探针结合发出荧光，因此本发明提供的测定转肽酶A活性的方法在整个检测过程中无需分离或清洗的步骤，操作简单、方便，无需昂贵的仪器或专业技术人员进行操作。

应用本发明提供的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对或测定转肽酶 A活性的方法可测定革兰氏阳性菌的潜在致病能力，灵敏度高、特异性强，且操作简单。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1A为本发明实施例2提供的转肽酶A催化aPP-N和aPP-C形成 CC-aPP-CC的质谱学分析结果图；

图1B为本发明实施例2提供的双砷染料FlAsH-EDT₂同aPP-N和aPP-C>P-CC结合后所形成复合物的荧光发射结果图；

图2A为本发明实施例3提供的转肽酶A、T4DNA连接酶和泛素连接酶催化aPP-N和aPP-C形成的反应产物同双砷染料结合产生荧光信号的成像结果图；

图2B为本发明实施例3提供的不同浓度的转肽酶A与其催化aPP-N 和aPP-C形成CC-aPP-CC同双砷染料结合所产生荧光信号之间的结果图；

图3A为本发明实施例4提供的姜黄素的分子结构式；

图3B为本发明实施例4提供的姜黄素浓度同转肽酶A活性抑制率之间的结果图；

图4A为本发明实施例5提供的金黄色葡萄球菌裂解液作用于多肽探针对导致荧光信号增强的结果图；

图4B为本发明实施例5提供的多肽探针对定量测定姜黄素对金黄色葡萄球菌内转肽酶A活性的抑制的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的一个方面，提供了一种用于测定转肽酶A活性的多肽探针对，包括第一多肽探针和第二多肽探针；

第一多肽探针和第二多肽探针均包含用于参与转肽酶A介导的转肽反应，使第一多肽探针和第二多肽探针结合为嵌合多肽的反应区、用于使嵌合多肽自身回折的互补区和用于结合染料的染料结合区。

本发明提供的多肽探针对的反应区，能够特异性参与转肽酶A介导的转肽反应，保证了多肽探针对具有特异性强、准确度好的优点。转肽酶A 介导的转肽反应会使第一多肽探针和第二多肽探针形成一个新的嵌合多肽，而互补区能够使新形成的嵌合多肽通过分子内互补发生自身回折，形成特定的空间构象，该结构能够结合染料，由于染料的荧光水平极度依赖于嵌合多肽通过分子内互补所形成的特定的空间构象，从而使本发明提供的多肽探针对无需进行修饰或标记处理，通过与染料结合产生荧光来测定转肽酶A的活性，操作简单，节约人力物力。相反，在缺少转肽酶A的情况下，第一多肽探针和第二多肽探针无法形成上述特定的空间构象，因此无法结合染料，进一步说明了本发明提供的多肽探针对具有较高的特异性。并且，应用多肽分子作为检测探针，与测定靶标之间具有较好的生物相容性。

在一个优选的实施方式中，互补区为可形成发夹结构的多肽片段。

发夹结构是RNA和多肽通过分子内互补或相互作用在一级结构基础上形成的一种类似发夹样的结构。可形成发夹结构的多肽片段，能够使得第一多肽探针和第二多肽探针结合得到的嵌合多肽中的染料结合区相互靠近，从而形成特定的空间构象，用来结合染料。优选的可形成发夹结构的多肽片段的序列为：PSQPTYPG和VEDLIRFYDNLQQYLNV。

在另一个优选的实施方式中，互补区为色氨酸拉链。

色氨酸拉链是一段包含多个色氨酸残基的短肽，这个短肽会自发形成β发夹结构。色氨酸残基不连续地分布于发夹结构的两侧，链内色氨酸-色氨酸对之间的疏水相互作用会极大地稳定β发夹结构。选择色氨酸拉链作为互补区，能够使得第一多肽探针和第二多肽探针结合得到的嵌合多肽中的染料结合区相互靠近，形成十分稳定的发夹结构来结合染料。优选的色氨酸拉链互补对序列为：GKKWTWTW和WTWTWQEG。

在一个优选的实施方式中，第一多肽探针的反应区的氨基酸序列为LPXTGX，染料结合区的氨基酸序列为CC，互补区的氨基酸序列为 PSQPTYPG。

其中，第一多肽探针的反应区的氨基酸序列LPXTGX中的X可为除半胱氨酸外的任意一种氨基酸，例如可以为，但不限于A、G、T、L等。

优选地，第一多肽探针的反应区的氨基酸序列为LPATGG。

在一个优选的实施方式中，第二多肽探针的反应区的氨基酸序列为 GG，染料结合区的氨基酸序列为CC，互补区的氨基酸序列为 VEDLIRFYDNLQQYLNV。

第一多肽探针的互补区PSQPTYPG片段和第二多肽探针的互补区VEDLIRFYDNLQQYLNV片段在形成新的嵌合多肽后会相互结合，从而使得两个半胱氨酸-半胱氨酸二联子在空间上相临近，形成特定的构象来结合染料。

在一个优选的实施方式中，第一多肽探针的氨基酸序列为： CCPSQPTYPGLPATGG(SEQ ID NO.1)，第二多肽探针的氨基酸序列为： GGVEDLIRFYDNLQQYLNVCC(SEQ ID NO.2)，第一多肽探针和第二多肽探针相互结合所形成的嵌合多肽的氨基酸序列为CCPSQPTYPGLPATGGVEDLIRFYDNLQQYLNVCC(SEQ ID NO.3)。

在一个优选的实施方式中，染料为双砷染料。

双砷染料-四半胱氨酸标签体系可对细胞内蛋白进行特异性荧光标记，该体系由四半胱氨酸标签和双砷染料两部分构成。其中，四半胱氨酸标签是一个包含有四个半胱氨酸残基的六肽或十二肽，可以被双砷染料特异性标记。四半胱氨酸标签中的半胱氨酸-半胱氨酸二联子可以被脯氨酸-甘氨酸二肽直接连接起来，形成线性四半胱氨酸标签。此外，半胱氨酸-半胱氨酸二联子还可以被添加到多肽的末端或嵌入蛋白质内部，通过多肽和蛋白的折叠、结合让它们在空间上相临近，形成特定的能与双砷染料结合的构象。在该标记系统中，四半胱氨酸标签的空间结构会对所形成复合物的稳定性和量子产率产生影响。在本发明的一个实施方式中，第一多肽探针的互补区PSQPTYPG片段和第二多肽探针的互补区VEDLIRFYDNLQQYLNV片段在转肽酶A介导的转肽反应形成新的嵌合多肽后会相互结合，从而使得两个半胱氨酸-半胱氨酸二联子在空间上相临近，进而与双砷染料结合产生极强的荧光。相反，在缺少转肽酶A作用的情况下，两个半胱氨酸-半胱氨酸二联子无法形成特定的构象来结合双砷染料，双砷染料因此不会发光。利用双砷染料-四半胱氨酸标签复合物的荧光水平极度依赖于四半胱氨酸标签空间构象这一特性，通过测定反应前后荧光水平的变化，可以定量测定转肽酶A的活性，特异性强，灵敏度高，且测定结果准确可靠。

优选地，染料为FlAsH-EDT₂、ReAsH-EDT₂、F2FlAsH或F4FlAsH。

FlAsH-EDT₂、ReAsH-EDT2、F2FlAsH和F4FlAsH为具有不同激发和发射波长的双砷染料，因此有多种方式来测定转肽酶的活性，检测方式灵活。

在本发明的第二方面，还提供了一种测定转肽酶A活性的方法，包括：

将上述的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对与待测样本于转肽反应缓冲液中混合并孵育，得到反应产物，通过反应产物与双砷染料结合所产生荧光信号的强弱判定转肽酶A的活性。

利用本发明提供的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对对转肽酶A活性进行检测，由于转肽酶A介导的转肽反应会使多肽探针对的第一多肽探针和第二多肽探针形成一个新的嵌合多肽，该嵌合多肽通过分子内互补发生自身回折，从而形成特定的能够结合染料的空间构象。并且，染料-多肽复合物的荧光水平依赖于嵌合多肽形成的特定的空间构象的数量，即嵌合多肽形成的越多，复合物的荧光水平就越高。而嵌合多肽的形成又依赖于转肽酶A介导的转肽反应，因此，通过反应产物的荧光水平能够判定转肽酶A的活性，且荧光信号越强，转肽酶A的活性越高，相反，荧光强度越弱，转肽酶A的活性越低。

由于本发明中双砷染料只有在与嵌合多肽结合的情况下才会发出荧光，不会与第一多肽探针和第二多肽探针结合发出荧光，因此本发明提供的测定转肽酶A活性的方法在整个检测过程中无需分离或清洗的步骤，操作简单、方便，亦无需昂贵的仪器或专业技术人员进行操作。

在一个优选的实施方式中，转肽反应缓冲液中包含还原剂。

还原剂，是指自由基及活性氧的清除剂、阻断剂及修复剂等物质的总称。在转肽反应缓冲液中加入还原剂，可以确保多肽探针对中半胱氨酸残基中-SH处于还原状态，不形成二硫键，从而能与双砷染料相结合。

优选为二硫键还原剂，更优选为DTT。

DTT为二硫苏糖醇，是二硫键还原剂中的一种，可以保持半胱氨酸残基中-SH处于还原态。避免形成二硫键，从而使嵌合多肽能与双砷染料相结合。

在一个优选的实施方式中，转肽反应缓冲液包括：Tris·HCl 40-60 mmol/L、NaCl120-180mmol/L、CaCl₂>

其中，Tris·HCl例如可以为，但不限于40mmol/L、45mmol/L、50 mmol/L、55mmol/L或60mmol/L。NaCl例如可以为，但不限于120mmol/L、 130mmol/L、140mmol/L、150mmol/L、160mmol/L、170mmol/L或180 mmol/L。CaCl₂例如可以为，但不限于1mmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4>

优选地，转肽反应缓冲液由如下组分组成：Tris·HCl 45-55mmol/L、NaCl 130-170mmol/L、CaCl₂>

优选地，转肽反应缓冲液包括：Tris·HCl 50mmol/L、NaCl 150mmol/L、 CaCl₂5mmol/L和DTT>

通过选取特定的组分和配比，制备得到的转肽反应缓冲液能提供合适的pH环境以及盐离子浓度来保证转肽酶A的催化活性，并同时保证多肽探针中半胱氨酸残基中-SH处于还原状态。

在本发明的第三方面，提供了上述的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对或测定转肽酶A活性的方法在测定革兰氏阳性菌潜在致病能力中的应用。

革兰氏阳性菌是能够用革兰氏染色染成深蓝或紫色的细菌，它们细胞壁中含有较大量的肽聚糖。其中，转肽酶能够将多种毒力因子蛋白锚定到革兰氏阳性细菌细胞壁上。转肽酶基因缺失或转肽酶活性的丧失会导致多种表面蛋白不能定位在细菌表面，进而会降低细菌的感染能力和粘附能力。因此，通过对转肽酶A活性的测定能够反映革兰氏阳性菌的潜在致病能力，灵敏度高、特异性强，且操作简单，节约成本。

典型的革兰氏阳性菌例如可以为，但不限于变形链球菌、酿脓链球菌、猪链球菌、肺炎链球菌、格氏链球菌、肠球菌或单核细胞增生李斯特氏菌。

为了进一步了解本发明提供的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对的设计方法、工作原理和有益效果，下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明。

实施例1用于测定转肽酶A活性的多肽探针对的设计

本实施例提供了一种用于测定转肽酶A活性的多肽探针对，包括第一多肽探针和第二多肽探针，将所设计的两条多肽探针分别命名为aPP-N和aPP-C，其中aPP-N的氨基酸序列为：CCPSQPTYPGLPATGG(SEQ ID NO.1)，aPP-C的氨基酸序列为：GGVEDLIRFYDNLQQYLNVCC(SEQID NO.2)。每个探针都包含有三个不同的功能区：其中LPATGG和GG将参与转肽酶A介导的转肽反应；CC是与双砷染料结合的部位，用来读取转肽酶 A的活性；PSQPTYPG和VEDLIRFYDNLQQYLNV会相互结合从而使得两个半胱氨酸-半胱氨酸二联子在空间上相临近。转肽酶A介导的转肽反应会形成一个新的嵌合多肽，其氨基酸序列为：CCPSQPTYPGLPATGGVEDLIRFYDNLQQYLNVCC(SEQ ID NO.3)，命名为CC-aPP-CC。对于所形成的嵌合多肽，PSQPTYPG和VEDLIRFYDNLQQYLNV之间的相互结合会使得两个半胱氨酸-半胱氨酸二联子在空间上相互接近，进而与双砷染料结合产生极强的荧光；相反，在缺少转肽酶A作用的情况下，两个半胱氨酸-半胱氨酸二联子无法形成特定的构象来结合双砷染料，双砷染料因此不会发光。利用双砷染料-四半胱氨酸标签复合物的量子产率和荧光水平极度依赖于四半胱氨酸标签空间构象这一特性，通过测定反应前后荧光水平的变化，可以定量测定转肽酶A 的活性，进而测定革兰氏阳性菌的潜在致病能力。

实施例2用于测定转肽酶A活性的多肽探针对的性能测定

为了测定转肽酶A能否催化本发明实施例1提供的aPP-N和aPP-C形成CC-aPP-CC，本实施例添加10微摩尔每升的aPP-N、40微摩尔每升的a PP-C以及0.1微克的转肽酶A到20微升的转肽反应缓冲液(50mM Tris· HCl，pH 7.5，150mM NaCl，5mM CaCl₂和1mM>P-CC，其序列为CCPSQPTYPGLPATGGVEDLIRPYDNLQQPL>2与aPP-N和aPP-C的混合物、>P-CC之间的结合情况，结果如图1B所示。双砷染料可以与CC-aPP-CC结合产生很强的荧光信号；相反，双砷染料与aPP-N/>P-CC之间则只能产生一些背景信号和比较微弱的荧光信号，这表明CC-aPP-CC能自组装形成特定的构象来结合双砷染料。

实施例3用于测定转肽酶A活性的多肽探针对在体外定量测定转肽酶 A的活性

本实施例通过实验进一步验证aPP-N和aPP-C能够特异性测定转肽酶 A的活性。本实施例在转肽反应缓冲液中测定了转肽酶A、T4DNA连接酶和泛素连接酶对aPP-N和aPP-C的连接作用。具体实验操作为：将10微摩尔每升的aPP-N和10微摩尔每升的aPP-C分别与0.1微克的转肽酶A、0.1 微克的T4DNA连接酶和0.1微克的泛素连接酶在37度孵育两小时，随后将反应混合物加入到80微升包含0.4微摩尔每升FlAsH-EDT₂的双砷染料标记缓冲液(100mMTris·Cl，pH>

实施例4用于测定转肽酶A活性的多肽探针对测定姜黄素对转肽酶A 活性的抑制

本实施例利用多肽探针对来测定姜黄素对转肽酶A活性的抑制作用。姜黄素是存在于姜黄中的一种多酚类化合物，其分子结构式如图3A所示。将转肽酶A与不同浓度的姜黄素在室温孵育10分钟，然后再与aPP-N和 aPP-C的混合物相孵育并测定所形成产物的荧光信号，结果如图3B所示。从结果图中可以看出，姜黄素会抑制转肽酶A的活性，转肽酶A的活性会随着姜黄素浓度的增加而逐渐降低，计算出的半抑制浓度为13.4微克每毫升，与文献中报道的13.8±0.7微克每毫升相一致，说明应用本发明提供的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对能够可靠、准确地测定转肽酶A的活性，进而可以测定小分子抑制剂对转肽酶A的抑制作用。

实施例5用于测定转肽酶A活性的多肽探针对测定金黄色葡萄球菌内转肽酶A的活性

为确认本发明提供的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对能否测定革兰氏阳性菌内转肽酶A的活性，本实施例以金黄色葡萄球菌为例，将本发明提供的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对与金黄色葡萄球菌的裂解液相孵育，并测定了孵育前后的荧光水平。如图4A所示，金黄色葡萄球菌裂解液可以导致荧光增加，表明细菌内的转肽酶A可以促使aPP-N同aPP-C 之间发生转肽反应。进一步，本实施例分别应用浓度为0μg/mL、1μg/mL、 3μg/mL和5μg/mL的姜黄素来处理金黄色葡萄球菌，并测定了被姜黄素处理的金黄色葡萄球菌内转肽酶的活性。如图4B所示，随着姜黄素浓度的逐渐增加，金黄色葡萄球菌内转肽酶A的活性逐渐降低，因此本发明提供的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对可以有效测定金黄色葡萄球菌内转肽酶A的活性。

综上所述，本发明提供的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对，能够特异性参与转肽酶A介导的转肽反应，保证了多肽探针对具有特异性强、准确度好、灵敏度高的优点。第一多肽探针和第二多肽探针经转肽酶A介导的转肽反应形成的新的嵌合多肽，其互补区能够通过分子内相互作用发生自身回折，形成特定的空间构象来结合双砷染料并发出荧光，而未连接的第一多肽探针和第二多肽探针则不会同双砷染料结合，从而使本发明提供的多肽探针对能够测定转肽酶A的活性，操作简单，节约人力物力。并且，应用多肽分子作为检测探针，与测定靶标转肽酶A之间具有较好的生物相容性。

本发明提供的测定转肽酶A活性的方法，双砷染料只与多肽探针对连接后所形成的嵌合多肽结合产生荧光，与未连接的多肽探针对之间不会产生荧光，因此本发明提供的测定转肽酶A活性的方法在整个检测过程中无需分离或清洗的步骤，操作简单、方便，亦无需昂贵的仪器或专业技术人员进行操作。

应用本发明提供的用于测定转肽酶A活性的多肽探针对或测定转肽酶 A活性的方法来测定革兰氏阳性菌的潜在致病能力，灵敏度高、特异性强、检测结果准确，且操作简单。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院深圳先进技术研究院

<120> 用于测定转肽酶A活性的多肽探针对、测定转肽酶A活性的方法及二者的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Cys Pro Ser Gln Pro Thr Tyr Pro Gly Leu Pro Ala Thr Gly Gly

1 5 1015

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Gly Val Glu Asp Leu Ile Arg Phe Tyr Asp Asn Leu Gln Gln Tyr

1 5 1015

Leu Asn Val Cys Cys

20