一种培养鳞笠藤壶幼虫的简便快捷方法

摘要

本发明公开了一种培养鳞笠藤壶幼虫的简便快捷方法。待鳞笠藤壶的卵孵化为无节幼虫后，投放扁藻和金藻作为饵料进行培养。本发明的方法可提高鳞笠藤壶无节幼虫发育速度，缩短培养时间，简化实验步骤，从而为海洋基础生态学和环境毒理学研究提供便利，应用前景广泛。

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种培养鳞笠藤壶幼虫的简便快捷方法。

背景技术：

鳞笠藤壶(Tetraclita squamosa squamosa(Bruguière,1789))属节肢动物门甲壳动物亚门颚足纲鞘甲亚纲蔓足下纲围胸总目无柄目藤壶亚目笠藤壶总科笠藤壶科笠藤壶亚科笠藤壶属，广泛分布于我国东海和南海沿岸，栖息在潮间带和潮下带，常附着于岩石、码头或浮标上，成为海洋污损生物群落中的重要成员。

鳞笠藤壶的生活史是由浮游生活和固着生活两个阶段组成，其中从无节幼虫脱出卵膜至金星幼虫探索和选择适宜附着基质的时期为浮游生活阶段，而自金星幼虫选好附着基、附着变态后则开始营固着生活。

基于鳞笠藤壶在个体发育中经历复杂的形态变化过程及具备浮游和附着两种生活方式迥异的阶段，故其幼虫不仅是开展海洋基础生态学和环境毒理学研究的适宜对象，也是开展海洋污损生物附着机理和防除研究的理想实验材料。

目前，现有公开的技术显示，在20℃环境下以中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)、四爿藻(Tetraselmis sp.)和球等鞭金藻(Isochrysis galbana)混合藻为饵料，鳞笠藤壶无节幼虫需要至少14天的发育才能成为金星幼虫，而且培养过程需要持续充气、添加抗生素和每2天更换一次海水。如能促进幼虫发育，减少培养时间，简化培养步骤，不仅可缩短实验周期，提高工作效率，降低试验过程中潜在风险发生的概率，而且还可扩大以此幼虫为测试对象的研究内容和工作范围，从而使鳞笠藤壶幼虫能更好地成为相关科学研究和技术开发的理想实验对象。然而，迄今为止，国内外已有技术均未见这方面的报道。

发明内容：

本发明为了克服现有技术中的不足，提供一种促进幼虫发育、缩短培养时间的培养鳞笠藤壶幼虫的简便快捷方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种培养鳞笠藤壶幼虫的简便快捷方法，其是待鳞笠藤壶的卵孵化为无节幼虫后，投放扁藻和金藻作为饵料进行培养。

优选，所述的扁藻为亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)，所述的金藻为湛江叉鞭金藻(Dicrateria zhanjiangensis)。

优选，所述的投放扁藻和金藻是按照亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)和湛江叉鞭金藻(Dicrateria zhanjiangensis)的个数比例为1:1进行投放。

优选，所述的亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)的每次投放量为1.2×10⁵个细胞/mL，所述的湛江叉鞭金藻(Dicrateria>5个细胞/mL。

所述的培养是将无节幼虫置于有饵料的培养介质中在黑暗环境中培养，培养期间更换有饵料的培养介质并进行间歇性光照。

所述的培养期间更换有饵料的培养介质具体为在培养5天后更换一次有饵料的培养介质。

所述的培养期间饵料投放仅在幼虫培养开始和培养介质更换时进行。

所述的培养的培养温度优选为29～31℃。

所述的将无节幼虫置于有饵料的培养介质中在黑暗环境中培养的幼虫培养密度优选为1～2个/mL。

所述的进行间歇性光照具体为每天早晨或傍晚放到自然光下，光照0.5～1小时。具体光照时间的长短取决于作为饵料的微藻悬浮状况。

所述的培养介质优选为海水。

所述的海水优选为经过过滤、煮沸消毒的海水。

与现有技术相比，本发明具有以下显著效果：本发明为本技术领域提供了一种完全可行的简便快捷培养鳞笠藤壶金星幼虫的方法，可提高鳞笠藤壶无节幼虫发育速度，缩短培养时间，简化实验步骤，填充了这一技术领域中的空白，可为开展环境毒理学研究和筛选海洋污损生物防污剂提供所需幼虫培养技术和测试对象，满足基础研究和技术开发过程中涉及幼虫发育和附着测试等方面工作的需要。

本发明解决了鳞笠藤壶幼虫发育时间较长、培养方法较为繁琐、培养过程需要动用充气装置等问题，减少了外界因素影响干扰的机会，保证了试验工作可以在单一和可控的实验环境中顺利进行，在生态基础研究、环境毒理学、防污剂筛选和涂料测试等领域具有广阔的应用前景。

具体实施方式：

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，而不是对本发明的限制。本发明的实施例由于实验设备的性能所限，30℃恒温是在29～31℃波动，室温是在24～26℃波动，但均未超出上述范围。

实施例1

将藤壶幼虫培养所用器皿进行清洗、高温消毒和烘干；海水则需经过沙滤、煮沸消毒等步骤处理后，冷却至室温备用。

鳞笠藤壶成熟个体则采自大亚湾海域沿岸的礁石上，采集过程中尽可能挑选个体较大且外表完好无损的个体。解剖成体藤壶，采集其褐色的成熟受精卵块，放入装有150mL过滤消毒海水的200mL透明样品瓶中并带回实验室，于室温(约24～26℃)环境中静置过夜。待卵块大量孵化后，收集活泼健壮的无节幼虫按以下步骤进行培养：

(1)采用1000mL玻璃烧杯作为培养容器，在烧杯中添加适量过滤消毒海水和饵料(约为1000mL)，将活泼健壮的无节幼虫转移到烧杯中，幼虫培养密度约为2个/mL。

(2)将烧杯置于30℃恒温培养箱内，黑暗条件中培养，每天早晨(或傍晚)取出烧杯，放到自然光下，光照1小时，使沉底的饵料(微藻)上浮。

(3)幼虫培养分为三个组别，分别以亚心形扁藻(扁藻饵料组)、湛江叉鞭金藻(金藻饵料组)以及亚心形扁藻与湛江叉鞭金藻以个数比1:1比例混合的藻液为饵料(混合饵料组)，其中单一藻类饵料的投放量均约为2.4×10⁵个细胞/mL，而混合饵料的投放量则为亚心形扁藻和湛江叉鞭金藻分别为1.2×10⁵个细胞/mL，饵料的投放仅在实验开始和培养介质更换时进行。

(4)每种喂养方式各设三个平行样，每2天从各组别的烧杯中分别随机取出30只幼虫，用甲醛溶液杀死后在显微镜下观察其发育状况，并记录各期幼虫的数量。在培养5天后更换一次海水，并重新添加相应的饵料。

实验结果如表1所示，饵料采用亚心形扁藻与湛江叉鞭金藻混合方式喂养的幼虫发育速度明显快于单独采用亚心形扁藻(或湛江叉鞭金藻)喂养的组别，而且在培养10天后，即出现大量的金星幼虫。因此，采用饵料以扁藻与金藻按个数比1:1比例混合的方式培养鳞笠藤壶幼虫，效果最为理想，不仅幼虫发育速度明显提高，缩短培养时间，而且还能得到大量金星幼虫。

表1不同培养时间下各实验组的鳞笠藤壶各期幼虫百分比

实施例2

将藤壶幼虫培养所用器皿进行清洗、高温消毒和烘干；海水则需经过沙滤、煮沸消毒等步骤处理后，冷却至室温备用。

鳞笠藤壶成熟个体则采自大亚湾海域沿岸的礁石上，采集过程中尽可能挑选个体较大且外表完好无损的个体。解剖成体藤壶，采集其褐色的成熟受精卵块，放入装有150mL过滤消毒海水的200mL透明样品瓶中并带回实验室，于室温(约24～26℃)环境中静置，待无节幼虫大量孵化后，收集活泼健壮的个体按以下步骤进行培养：

(1)采用1000mL玻璃烧杯作为培养容器，在烧杯中添加适量过滤消毒海水和饵料(约为1000mL)，将活泼健壮的无节幼虫转移到烧杯中，幼虫培养密度约为1个/mL。

(2)以亚心形扁藻和湛江叉鞭金藻以个数比1:1比例混合的藻液为饵料，其中亚心形扁藻和湛江叉鞭金藻的投放量均为1.2×10⁵个细胞/mL，饵料的投放仅在实验开始和培养介质更换时进行。

(3)幼虫培养分为两个组别，其中A组将烧杯置于20℃恒温培养箱内，B组将烧杯置于30℃恒温培养箱内，黑暗条件中培养，每天早晨(或傍晚)取出烧杯，放到自然光下，光照0.5～1小时，使沉底的饵料上浮。

(4)每种培养方式各设三个平行样，每2天从各组别的烧杯中分别随机取出30只幼虫，用甲醛溶液杀死后在显微镜下观察其发育状况，并记录各期幼虫的数量。在培养5天后更换一次海水，并重新添加相应的饵料。

实验结果如表2所示，B组(培养温度为30℃)的幼虫发育速度明显快于A组(培养温度为20℃)，而且在培养10天后，即出现大量的金星幼虫。因此，采用30℃的温度培养鳞笠藤壶幼虫，效果最为理想，不仅幼虫发育速度明显高于20℃，缩短了培养时间，而且还能得到大量金星幼虫。

表2不同培养温度下各实验组的鳞笠藤壶各期幼虫百分比

实施例3

将藤壶幼虫培养所用器皿进行清洗、高温消毒和烘干；海水则需经过沙滤、煮沸消毒等步骤处理后，冷却至室温备用。

鳞笠藤壶成熟个体则采自大亚湾海域沿岸的礁石上，采集过程中尽可能挑选个体较大且外表完好无损的个体。解剖成体藤壶，采集其褐色的成熟受精卵块，放入装有150mL过滤消毒海水的200mL透明样品瓶中并带回实验室，于室温(约24～26℃)环境中静置，待无节幼虫大量孵化后，收集活泼健壮的个体按以下步骤进行培养：

(1)采用1000mL玻璃烧杯作为培养容器，在烧杯中添加适量过滤消毒海水和饵料(约为1000mL)，将活泼健壮的无节幼虫转移到烧杯中，幼虫培养密度约为2个/mL。

(2)将烧杯置于20℃恒温培养箱内，黑暗条件中培养，每天早晨(或傍晚)取出烧杯放到自然光下，光照1小时，使沉底的饵料(微藻)上浮。

(3)幼虫培养分为2个组别，其中A组以中肋骨条藻、亚心形扁藻和湛江叉鞭金藻以个数比1:1:1比例混合的藻液为饵料，即中肋骨条藻、亚心形扁藻和湛江叉鞭金藻的投放量均为0.8×10⁵个细胞/mL。B组以亚心形扁藻和湛江叉鞭金藻以个数比1:1比例混合的藻液为饵料，即亚心形扁藻和湛江叉鞭金藻的投放量均为1.2×10⁵个细胞/mL。饵料的投放仅在实验开始和培养介质更换时进行。

(4)每种喂养方式各设三个平行样，每2天从各组别的烧杯中分别随机取出30只幼虫，用甲醛溶液杀死后在显微镜下观察其发育状况，并记录各期幼虫的数量。在培养5天后更换一次海水，并重新添加相应的饵料。

如表3所示，A组的幼虫发育速度明显慢于B组。因此，在20℃的温度下，采用亚心形扁藻和湛江叉鞭金藻以个数比1:1比例混合的藻液为饵料培养鳞笠藤壶幼虫，效果好于以中肋骨条藻、亚心形扁藻和湛江叉鞭金藻以个数比1:1:1比例混合的藻液为饵料，幼虫发育速度有明显的提高，缩短了培养时间。

表3不同饵料时各实验组的鳞笠藤壶各期幼虫百分比