法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-04-10
授权
授权
2018-07-13
实质审查的生效 IPC(主分类):A01H4/00 申请日:20180119
实质审查的生效
2018-06-15
公开
公开
技术领域
本发明属于马铃薯脱毒苗快繁技术领域，特别涉及一种马铃薯脱毒苗开放式工厂化快繁的方法。
背景技术
马铃薯，原产于南美秘鲁，后在世界各地广为栽培。马铃薯在明末清初引入我国，在我国已有将近400年的栽培历史。马铃薯是全球重要的粮菜兼用作物，生长期短，适应性广，产量高，用途广，营养丰富，耐贮藏运输。但由于病毒的侵袭，马铃薯在栽培过程中普遍存在退化问题，导致马铃薯品质、产量直线下降。危害马铃薯的病毒非常多，马铃薯是无性繁殖作物，病毒在马铃薯块茎内积累代代相传，危害逐年严重，常规的繁殖方式对此无能为力。1955年，法国植物组培研究人员从已患病的马铃薯植株通过茎尖组培的方式获得了无病毒的植株，为植物脱毒开辟了一个全新的领域。20世纪60年代以后，植物组织培养技术发展迅速，植物脱毒技术的研究也得到了长足的发展，通过茎尖脱毒生产脱毒苗，继代扩繁建立良种繁育体系生产优良种薯，是目前马铃薯生产上主要的繁育技术。目前马铃薯脱毒苗快繁技术主要为：试管苗(组培苗)切段快繁技术、扦插苗快繁技术和脱毒种薯掰芽快繁技术。马铃薯脱毒试管苗(组培苗)切段快繁技术是马铃薯脱毒种薯繁育技术体系中一项重要的关键性技术，且在生产上广泛应用。但发展至今，马铃薯脱毒苗快繁技术在技术环节还存在不少问题。其中，组培生产中真细菌污染问题成为首要解决的难点问题。传统的试管苗(组培苗)切段快繁方式均是在严格无菌的封闭条件下进行的，对于环境要求较为严格和苛刻。在无菌环境对培养基、培养器皿高温灭菌，任何用于操作和处理试管苗(组培苗)的器皿都需要消毒，其操作过程都必须在无菌环境如超净工作台内进行来降低真细菌的污染的风险。
近年来，马铃薯组培生产上出现了开放式组织培养的新方法，但在生产上应用不普及，原因是开放组培需要在培养基中加入一定量的抑菌剂，出现培养基凝固不好，马铃薯组培茎段生根难，易出现弱苗、白化苗现象。对一些细菌抑制效果不理想。如果能够建立起不灭菌的脱毒苗快繁培养技术，并且不使用抑菌药剂，还能够将污染率降到0，马铃薯脱毒苗切段快繁技术将取得质的飞跃。因此，发明一种无需灭菌程序的开放式脱毒苗快繁技术非常重要。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种马铃薯脱毒苗开放式工厂化快繁的方法。
针对当前马铃薯脱毒苗切段培养育苗过程中组培室环境要求苛刻，需要在严格无菌条件下进行、操作程序烦琐、效率低、培养成本高、移栽成活率低、扦插苗结薯数量少等问题，对马铃薯脱毒苗快繁技术进行了系统的研究，发明了一种马铃薯开放式脱毒苗工厂化快繁新方法，使马铃薯脱毒苗快繁脱离严格无菌的操作环境，在自然、开放的有菌环境中进行操作，同时简化了快繁操作程序，比传统方法提高10倍以上的扩繁速度，大大提高了马铃薯脱毒苗的质量和成活率，生产成本是传统方法的1/6～1/7。
本发明的另一目的在于提供上述方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种马铃薯脱毒苗开放式工厂化快繁的方法，包括如下步骤：
(1)培养载体的准备：培养脱毒苗载体为无机不含碳源的蛭石；
(2)将步骤(1)的蛭石均匀铺到温室的离地苗床上；
(3)给步骤(2)苗床上喷水至蛭石成饱和水状态；
(4)取苗高10～14cm的马铃薯脱毒苗，去培养基、去根、集群；
(5)将步骤(4)得到的集群马铃薯脱毒苗，在开放的室内环境下，用灭菌医用剪刀直接剪成长1.0～3.0cm带腋芽的茎段；
(6)将步骤(5)得到的茎段放入灭菌的干净干燥的容器中；
(7)将步骤(6)盛在容器中的茎段均匀平铺到蛭石上；
(8)将步骤(7)脱毒苗茎段喷施100～200ppm吲哚丁酸1次；
(9)将步骤(8)脱毒苗茎段每60～120min喷水1次；
(10)将步骤(9)马铃薯脱毒苗培养5～7d，观察生根抬头后，在生根的茎段上撒少量的蛭石，继续培养；
(11)将步骤(10)马铃薯脱毒苗培养10～15d左右长至8～10cm、3～5片叶，即可连根拔起移入微型薯生产田进行微型薯生产。
为了更好的实现本发明的目的，还包括：
优选的，步骤(1)所述的蛭石为新蛭石，即经过高温烧制而成的未使用过的蛭石。
优选的，步骤(2)所述的离地苗床上蛭石的厚度为5～8cm。
优选的，步骤(2)所述的苗床与土地隔离；苗床为铁架的培养床、塑料网框或石棉瓦做的苗床。
优选的，步骤(2)所述的温室，温度保持在18～25℃，全日光光照，温室内清洁卫生；
优选的，步骤(4)马铃薯脱毒苗为已经在组培室培养20～25d，苗高10～14cm；
优选的，步骤(4)所述的脱毒苗从培养瓶中取出后，去掉根部的培养基，去掉根，然后将脱毒苗集群；
优选的，步骤(6)所述的灭菌为用75％酒精擦拭洗净干燥的容器内表面；
优选的，步骤(6)所述的容器为托盘、盆、箱等器皿；
所述的容器通过玻璃、陶瓷、塑料、金属等材质制成；
优选的，步骤(7)所述的茎段均匀平铺到蛭石上的密度为每平方米5000～10000个茎段。
优选的，步骤(9)所述的脱毒苗茎段的生根阶段保持室内湿度在80～90％，以肉眼可见茎段上有水滴为宜。
优选的，步骤(9)所述的喷水1次，每次5～15min。
优选的，步骤(10)所述的脱毒苗茎段的生根阶段，室内应遮阳，遮阳网60～80目，白天光照强度保持在200～1000LX。
优选的，步骤(10)培养脱毒苗的生根阶段培养湿度保持在80～90％。
优选的，步骤(11)所述的脱毒苗培养时每3～5d喷施1次营养液。
优选的，所述的营养液为去掉有机成分、蔗糖、肌醇的MS培养液。
优选的，步骤(11)所述的脱毒苗培养阶段，为全日光光照。
上述马铃薯脱毒苗开放式工厂化快繁的方法可用于规模化生产提供设施种植生产原原种、雾培或无土栽培生产原原种的马铃薯脱毒种苗育苗。
本发明的机理是：
利用马铃薯病原真细菌在无机环境无法生存的特点，解决了真细菌污染脱毒苗组织快繁的问题。本发明通过系统研究，筛选确定了简单且极易工厂化操作的开放式脱毒苗快繁技术。对于有效降低马铃薯脱毒苗工厂化快繁生产成本、提高繁殖效率、生产健壮优质脱毒苗为种植生产原原种、雾培或无土栽培生产原原种提供了重要的技术支撑。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明摆脱培养容器，采用离地苗床作为培养容器；无需培养基，摒弃高压灭菌培养基过程；不需要抑菌剂，避免抑菌剂对脱毒苗生长的影响；不借助超净工作台，直接在开放、有菌环境下扩繁脱毒组培苗；人均快繁剪切茎段速度是传统方式的10倍以上；繁殖系数为3～4倍；繁殖时间缩短为14～15d；在开放、有菌的温室内培养，马铃薯脱毒苗生长健壮；脱毒苗进入原原种(微型薯)生产后成活率可达100％，显著高于传统方式，工厂化快繁生产成本为传统的1/6～1/7，且结薯数量明显高于传统意义的脱毒苗。
(2)本发明对于工作人员和操作环境没有过高要求，不需要投资建设成本较高的组织培养室。
(3)育出脱毒苗根系发达，移栽时根系不易受损，移栽成活高。
(4)本发明生产的马铃薯脱毒苗成本为0.031元/株，是传统脱毒苗快繁生产成本的1/7，大大节省马铃薯脱毒苗快繁的人力成本、生产资料成本和电力成本。
(5)本发明使马铃薯脱毒苗快繁变得简单易于操作。
(6)本发明的方法是直接在开放、有菌环境下快繁马铃薯脱毒苗，生产出的马铃薯脱毒苗粗壮、带根，可以直接移栽进入温室或网棚生产微型薯，是一种可以极大提高工厂化快繁马铃薯脱毒苗的速度、摆脱脱毒苗污染、提高脱毒苗质量、增加微型薯结薯数量、大幅度降低脱毒苗生产成本的行之有效的新方法。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
图2是本发明方法的平铺茎段示意图。
图3是本发明方法的生根抬头的茎段示意图。
图4是本发明方法生产的马铃薯脱毒苗示意图。
图5是本发明方法生产的马铃薯原原种示意图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的工艺流程图，如图1所示。本发明方法的平铺茎段示意图，如图2所示。本发明方法的生根抬头的茎段示意图，如图3所示。本发明方法生产的马铃薯脱毒苗，如图4所示。本发明方法生产的马铃薯原原种示意图，如图5所示。
实施例1
(一)材料：
2015年3月24日选择荷兰十五马铃薯脱毒组培苗2万株，株高为10～14cm；准备培养载体，培养载体为经高温加工过的新蛭石20袋；准备洁净的温室1间，温室为内蒙古呼和浩特舍必崖智能温室，培养期间智能温室温度为白天20～25℃，夜晚18～22℃，湿度为80～90％。
(二)方法：
(1)苗床上先铺满一层园艺地布；
(2)再将培养载体蛭石均匀铺到温室的离地苗床上，厚度5～8cm。
(3)将培养载体蛭石喷水呈饱和水状态，手指按压见水，肉眼不见水为宜。
(4)取10～14cm高的马铃薯组培脱毒苗，去培养基、去根、集群；
(5)3月24日在开放的室内环境下，用灭菌医用剪刀直接将集群的马铃薯脱毒苗剪成长1.0～3.0cm带腋芽的茎段，一般1株组培苗可以获得3～5个茎段；
(6)将剪好的茎段放入干净干燥的容器中；
(7)将容器端入温室内，将茎段均匀撒到培养载体蛭石上；
(8)再将脱毒苗茎段喷施100～200ppm吲哚丁酸1次；
(9)3月24日，脱毒苗茎段在温室中开始培养，白天每60～120min喷水1次，1次5～10分钟，夜晚不喷水，以肉眼可见茎段上有露珠为宜，同时温室采用60％的60～80目遮阳网遮阳；
(10)马铃薯脱毒苗茎段培养5～7d，观察生根抬头后，在生根的茎段上撒少量的蛭石，每隔2～3h喷水一次，一次5～10分钟，夜晚不喷水，去掉遮阳网，全日光照继续培养；
(11)脱毒苗茎段生根后，每隔3～5d喷施1次营养液；
(12)4月15日将马铃薯脱毒苗茎段长至8～10cm，出现3～5片叶的脱毒苗连根拔起移入原原种生产的温室进行原原种生产；
(14)4月16日开始在温室内进行常规原原种生产，本方法生产的马铃薯脱毒苗8万株，种植1.3亩，种植密度：90株/m2；同时温室内种植普通组培生产的马铃薯组培苗2万株，种植密度：90株/m2；
(15)6月30日收获荷兰十五原原种。
(三)调查
3月30日调查两种方法生产的马铃薯脱毒苗8万株的生产成本，包括人工成本、生产资料成本、水电费，人均扩繁速度等。
4月20日调查两种方法育苗的移栽成活数量、根长度、根数量；
6月30日收获调查原原种的单株结薯数量及平均单粒重。
9月11日针对收获的微型薯薯块随机取样，采用RT-PCR方法检测薯块病毒病携带情况。
(四)结果
3月30日调查马铃薯脱毒苗8万株生产成本结果详见下表：
4月20日调查脱毒苗生长情况详见下表：
6月30日调查脱毒苗结薯情况详见下表：
9月11日检测本法法生产微型薯薯块病毒病携带结果详见下表：
*(—为不携带该病毒；+为携带该病毒)
实施例2
(一)准备工作：
2016年4月3日准备洁净的温室1间，温室为内蒙古呼和浩特舍必崖村厚墙日光温室；准备康尼贝克马铃薯脱毒成苗组培苗10万株；准备培养载体，培养载体为经高温加工过的新蛭石100袋；培养期间温室温度白天保持在21～25℃，夜晚18～21℃，湿度为80～90％。
(二)方法：
(1)离地苗床上先铺满一层园艺地布；
(2)再将培养载体蛭石均匀铺到温室的离地苗床上，厚度5～8cm。
(3)将培养载体蛭石喷水呈饱和水状态，手指按压见水，肉眼不见水为宜。
(4)取培养好的马铃薯组培脱毒苗，去培养基、去根、集群；
(5)4月3日在干净整洁的室内，用75％的酒精棉球擦拭剪刀后，在直接将集群的马铃薯脱毒苗剪成长1.0～3.0cm带腋芽的茎段，每株可以获得3～5个茎段；
(6)容器用75％的酒精棉球擦拭后晾干，再将剪好的茎段放入干燥的容器当中；
(7)将容器端入温室内，将茎段均匀撒到培养载体蛭石上；
(8)再将脱毒苗茎段喷施100～200ppm吲哚丁酸1次；
(9)4月3日，脱毒苗茎段在温室中开始培养，白天每60～120min喷水1次，1次5～10分钟，夜晚不喷水，以肉眼可见茎段上有露珠为宜，同时温室采用60％的60～80目遮阳网遮阳；
(10)4月11日，马铃薯脱毒苗茎段培养8d，观察生根抬头后，去掉遮阳网。在生根的茎段上撒少量的蛭石，早8：00后每隔2-3h喷水一次，一次5-10分钟，全日光照继续培养；
(11)4月15日脱毒苗茎段生根后，每隔4d喷施1次营养液；
(12)4月25日将马铃薯脱毒苗茎段长至8～10cm，出现3～5片叶的脱毒苗连根拔起移入原原种生产的温室进行原原种生产；
(13)4月15日开始在温室内进行常规原原种生产，本方法生产的马铃薯脱毒苗40万株，种植10个温室，种植密度：90株/m2；同时1个温室内种植普通组培生产的马铃薯组培苗2万株，种植密度：90株/m2；
(14)7月8日收获康尼贝克原原种。
(三)调查
4月15日调查两种方法生产的马铃薯脱毒苗40万株的生产成本，包括人工成本、生产资料成本、水电费，人均扩繁速度等。
4月30日调查两种方法育苗的移栽成活数量、根长度、根数量；
7月8日收获时调查原原种的单株结薯数量及平均单粒重。
10月21日针对收获的微型薯薯块随机取样，采用RT-PCR方法检测薯块病毒病携带情况。
(四)结果
2016年4月15日调查马铃薯脱毒苗40万株生产成本结果详见下表：
2016年4月30日调查脱毒苗生长情况详见下表：
2016年7月8日调查脱毒苗结薯情况详见下表：
2016年10月21日检测本法生产微型薯薯块病毒病携带结果详见下表：
*(—为不携带该病毒；+为携带该病毒)
实施例3
(一)准备工作：
2017年3月初准备洁净的温室1间，温室为内蒙古呼和浩特清水河宏河镇乌兰不浪日光温室；准备离地苗床；准备夏坡蒂马铃薯脱毒成苗组培苗20万株；准备培养载体，载体为经高温加工过的新蛭石200袋；培养期间温室温度白天保持在21～25℃，夜晚18～21℃，湿度为80～90％。
(二)方法：
(1)离地苗床上先铺满一层园艺地布；
(2)再将培养载体蛭石均匀铺到温室的离地苗床上，厚度5～8cm。
(3)将培养载体蛭石喷水呈饱和水状态，手指按压见水，肉眼不见水为标准。
(4)取培养好的马铃薯组培脱毒苗，去培养基、去根、集群；
(5)3月22日在干净整洁的室内，用75％的酒精棉球擦拭剪刀后，再直接将集群的马铃薯脱毒苗剪成长1.0～3.0cm带腋芽的茎段，每株可以获得3～5个茎段；
(6)容器用75％的酒精棉球擦拭后晾干，再将剪好的茎段放入干燥的容器当中；
(7)将容器端入温室内，将茎段均匀撒到培养载体蛭石上；
(8)再将脱毒苗茎段喷施100～200ppm吲哚丁酸1次；
(9)3月23日，脱毒苗茎段在温室中开始培养，8:00～17:30每120min喷水1次，1次10分钟，夜晚不喷水，以肉眼可见茎段上有露珠为标准，同时温室采用60％的60～80目遮阳网遮阳；
(10)4月1日，观察生根抬头后，去掉遮阳网。在生根的茎段上撒少量的蛭石，早8：00后每隔2～3h喷水一次，一次15分钟，全日光照继续培养；
(11)4月3日脱毒苗茎段生根后，每隔4d喷施1次营养液；
(12)4月13日将马铃薯脱毒苗茎段长至8～10cm，出现3～5片叶的脱毒苗连根拔起移入原原种生产的温室进行原原种生产；
(13)4月14日开始在温室内进行常规原原种生产，本方法生产的马铃薯脱毒苗80万株，种植20个温室，种植密度：90株/m2；同时1个温室内种植普通组培生产的马铃薯组培苗2万株，种植密度：90株/m2；
(14)7月2日开始收获夏坡蒂原原种。
(三)调查
4月13日调查两种方法生产的马铃薯脱毒苗80万株的生产成本，包括人工成本、生产资料成本、水电费，人均扩繁速度等。
4月23日调查两种方法育苗的移栽成活数量、根长度、根数量；
7月2日收获时调查原原种的单株结薯数量及平均单粒重。
9月23日针对收获的微型薯薯块随机取样，采用RT-PCR方法检测薯块病毒病携带情况。
(四)结果
2017年4月13日调查马铃薯脱毒苗80万株生产成本结果详见下表：
2017年4月23日调查脱毒苗生长情况详见下表：
2017年7月2日调查脱毒苗结薯情况详见下表：
2017年9月23日检测本法生产微型薯薯块病毒病携带结果详见下表：
*(—为不携带该病毒；+为携带该病毒)
根据实施例1～3的结果可知，利用本发明的方法无需培养基，在不利于马铃薯致病细菌、真菌、病毒生存的无机环境条件下，使马铃薯组培苗脱毒快繁过程完全脱离严格无菌的操作环境，尤其是不需要配置培养基、不需要为培养基添加药剂抑制真细菌生长，不需要高压灭菌，完全意义可在开放的带菌环境中进行马铃薯脱毒苗工厂化快繁的新方法，从根本上简化了马铃薯脱毒苗培育环节，提高了育苗工作效率，彻底解决了真细菌污染问题，大大降低了马铃薯脱毒苗组织培养育苗生产成本和组培车间的建设成本，同时育成的马铃薯脱毒苗苗壮、成活率100％，进入微型薯生产环节结薯数量大大提高，一般在4～18颗/株，产量大大高于普通组培苗及扦插苗生产的微型薯。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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