动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物的应用

摘要

本发明涉及分子生物医疗技术领域，具体涉及动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物的应用，所述分子标记物为PR11‑387H17.6，其核酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的目的就是针对目前临床上，动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的检测缺乏高灵敏度和高特异性的诊断指标，由此提供了动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物RP11‑387H17.6，对寻找高灵敏度和高特异性的动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物，并研制相应的辅助诊断试剂或试剂盒，具有重大意义。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物医疗技术领域，具体涉及动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物的应用。

背景技术

长链非编码RNA(LncRNA)是真核细胞中一类转录本长度超过200nt的非编码RNA分子，无或很少有蛋白编码功能，在哺乳动物基因组普遍被转录。LncRNA曾经被认为是转录过程中的副产物，不具有生物学功能。目前越来越多的研究证实LncRNA具有复杂的生物学功能,参与了基因组印记、转录控制、转录后调控、蛋白功能调节等信号转导过程中的重要环节，并与人类疾病的发生有密切的关系。

LncRNA在细胞质、细胞核、细胞器均有分布，但主要存在细胞核内。哺乳动物全基因组4％-9％最终转录成LncRNA。LncRNA是一类物种内序列进化保守，且组织特异性远强于蛋白质编码RNA的分子。近年来研究表明，LncRNA与动脉粥样硬化密切相关。文献报道ANRIL能够促进血管平滑肌细胞增殖和动脉粥样斑块形成。Leung等发现了一种与血管紧张素II相关的lncRNA(lnc-Ang362)，用siRNA敲除lnc-Ang362可以抑制血管平滑肌细胞的增殖，该机制可能是通过对miRNA-221和miRNA-222的负调控使其生成减少，从而抑制血管平滑肌细胞的增殖。Wu等发现lncRNA-p21作为抑癌基因p53的转录靶点，可以反馈性地增强p53的转录活性，进而调控血管平滑肌细胞增殖、凋亡和动脉粥样硬化进程，这提示lncRNA-21可能作为动脉粥样硬化和相关心血管疾病的治疗靶点。Chen等发现一个长链非编码单核细胞源性RNAlnc-MC，它可以通过与miR-199a-5p相互作用而调控人单核细胞/巨噬细胞的分化，为研究动脉粥样硬化提供了一条新思路。这些科学发现说明LncRNA的表达水平与动脉粥样硬化密切相关。

肾动脉狭窄是多种原因导致的一种肾血管性疾病。肾动脉狭窄主要发病原因包括动脉粥样硬化、纤维肌发育不良和大动脉炎。70％由动脉粥样硬化所致，多见于多种心血管危险因素的老年人，肾动脉狭窄在普通高血压人群中患病率为1-5％，社区筛选结果显示在65岁以上人群中发病率高于7％，而在一些高危人群中患病率可达40％以上，且常合并外周血管疾病或冠状动脉疾病。肾动脉狭窄是引起继发性高血压、缺血性肾病和(或)肾功能不全的重要原因之一。肾动脉狭窄的患者若肾脏血流灌注不能得到及时恢复，肾实质将会发生不可逆的损害。如果未予以适当治疗，病情往往进入终末期肾病。

肾动脉狭窄发病隐匿，临床表现不典型。目前用于诊断肾动脉狭窄方法包括多普勒超声、计算机体层摄影血管造影(CTA)和肾动脉造影等方法。双侧肾动脉多普勒超声容易受主观经验、肠内积气等因素干扰。CTA由于需要使用含碘对比剂，在肾功能受损的患者中应用受限。肾动脉造影对患者来说价格昂贵，增加患者经济负担，并且术中应用对比剂，在肾功能受损的患者中谨慎应用。目前尚无资料显示在肾动脉狭窄患者中有特异性标记物，因此寻找能用于诊断肾动脉狭窄的标记物具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的就是针对目前临床上，动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的检测缺乏高灵敏度和高特异性的诊断指标，由此提供了动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物RP11-387H17.6。本发现对寻找高灵敏度和高特异性的动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物，并研制相应的辅助诊断试剂或试剂盒，具有重大意义。

本发明的第二个目的是提供所述的动脉粥样硬化性肾动脉狭窄临床诊断分子标记物在制备诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的试剂或试剂盒中的应用。

为实现上述目的，专利申请人采用LncPath^TM表达谱芯片技术初步筛选出动脉粥样硬化肾动脉狭窄组和非肾动脉狭窄组差异表达LncRNAs，并在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄组和非肾动脉狭窄组外周血中验证，经PCR方法检测发现，与非肾动脉狭窄组外周血白细胞比较，动脉粥样硬化性肾动脉狭窄患者中LncPR11-387H17.6表达水平显著升高，差异具有统计学意义。

动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物RP11-387H17.6所述的分子标记物在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄为高表达。

所述长链非编码RNA PR11-387H17.6的核酸序列如SEQ ID No.1所示：

Cccaagggctttggaactgcgggattgggacacgtgacttccctggtcattcaccttgaagtggacacgggctggggtgagagaggggaaactgccccatcttctcatcttagaaccatgcagcgttaatgctggaagggaccttggagtcgattccaaccccgtgaactgggccagggaaggaagtgccttgcccaaggtcatgagagggcatttcatcatgttgcccaggctgatctcaaactcctgggcttgtgtccgaaactggtgagtgcttggtctcactgacttcaagaaggaagccgcggaccctcgcagtgagtgttacagctcttaaggtggtgcatctggagtttgttccttctgatgttcagatgtgttcgcagtttcttccttctggtgggttcgtggtctcgctggctgaggagtgaagctgcagaccttcgcggtgagtgttatagctcttaaggcagcgcggccggagttgttcattcctcccggtgggctcgtggtcttagtggcttcaggagtgaagctgcagaccttcgtggtgagtgttacagctcataaaagcagtgtggacccaaaaagcgagcagtagcaagatttatcgcaaacagcaaaagaacaaagctgccatattgtggatggggacctgtgcccgttgccactgctggctcgggcagcctgcttttattctcttatctggccccacccacatcctgctgattggtagagccgagtggtctgttttgacagggcgctgattggtgcgtttacaatc

所述的分子标记物在制备诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄试剂或试剂盒的用途，所述的诊断动脉粥样硬化性肾动脉狭窄试剂盒，所述的试剂盒用于检测RP11-387H17.6的基因表达水平的寡聚核苷酸片段。

所述试剂盒包括扩增LncRNAs标记物LncPR11-387H17.6的引物，所述扩增LncPR11-387H17.6所使用的特异性引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物序列为SEQ ID No.2(5’-CGCAAACAGCAAAAGAACAA-3’)，下游引物序列为SEQ ID No.3(5’-GGCTCTACCAATCAGCAGGA-3’)。

LncPR11-387H17.6的检测方法为荧光定量PCR法。

优选的，所述试剂盒的组分包括：

1)血液中总RNA提取试剂：Trizol、氯仿、异丙醇和75％乙醇等。

2)反转录试剂：5X gDNA Eraser Buffer,gDNA Eraser,total RNA,RNase FreedH₂O。

3)定量PCR试剂：PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs组成的SYBR Green聚合酶链式反应体系，引物和RNase Free dH₂O。

本发明的有益效果为：本发明提供的长链非编码RNA PR11-387H17.6可用作动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物，达到动脉粥样硬化性肾动脉狭窄无创诊断的用途。长链非编码RNA调控机制是动脉粥样硬化发病机理研究中的一个新领域，LncPR11-387H17.6在肾动脉狭窄外周血白细胞均有高表达，且在非肾动脉狭窄和健康志愿者外周血白细胞中的表达水平显著低于肾动脉狭窄外周血白细胞，差异具有统计学意义，提示LncPR11-387H17.6作为动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物的可行性及临床应用价值。

附图说明

图1显示为LncPath^TM>

图2为分子标记物在训练样本(18例肾动脉狭窄，18例非肾动脉狭窄和18例健康志愿者外周血白细胞中)的表达水平图，其中A为LncRNAsRP11-387H17.6、B为BC080653、C为RP1-32B1.4、D为GHRLOS、E为RP5-1068H6.3和F为XLOC_009769。

图3为分子标记物在训练样本(18例肾动脉狭窄，18例非肾动脉狭窄和18例健康志愿者外周血白细胞中)的ROC曲线图，其中A为LncRNAsRP11-387H17.6、B为BC080653、C为RP1-32B1.4、D为GHRLOS、E为RP5-1068H6.3和F为XLOC_009769。

图4为RP11-387H17.6在验证样本(99例肾动脉狭窄，49例非肾动脉狭窄和50例健康志愿者外周血白细胞)的表达及ROC曲线图。

具体实施方式

实施例1(人肾动脉组织中特异性表达的lncRNA筛选与鉴定)

用“LncPath^TM>

实施例2

1.样品来源：

收集2015年1月至2016年10月在沈阳军区总医院行冠状动脉造影及肾动脉造影患者外周血，随机选取18例肾动脉狭窄，18例非肾动脉狭窄作为训练样本；99例肾动脉狭窄，49例非肾动脉狭窄作为验证样本。并从体检中心抽取18例健康志愿者外周血作为训练样本，50例健康志愿者外周血作为验证样本。抽取不同个体的外周血,收集于EDTA抗凝管中,先经4℃,3000g离心10分钟,去除血浆,加入红细胞裂解液5ml，摇匀、静置20分钟后，4℃,3000g离心10分钟，弃去除细胞碎片,上述步骤重复2次，最后取下层白细胞于无酶离心管中,加入1mlTriol,在此,一80℃冻存备用。

2.RNA提取：RNA抽提的具体步骤如下：

1)细胞中加Trizol 1ml后，室温放置5min，使其充分裂解。

2)12,000g，离心5min，弃沉淀。

3)按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。

4)4℃12,000g离心15min。

5)吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面。

6)按0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。

7)4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。

8)按1ml 75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。

9)4℃12,000g离心5min，尽量弃上清。

10)室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。

11)可用50ul H₂O融解RNA。注:H₂O均须用DEPC处理并高压。

3.检测外周血白细胞RNA的质量：利用Nanodrop 2000检测RNA的含量，经OD值定量测定，以便计算目标lncRNA反转录时所需要的RNA溶液的体积；经定性检测排除已降解的和DNA污染较严重的RNA样本，以保证后续实验的特异性。具体检测方法如下：

总RNA定量：在紫外分光光度计上测定260nm和280nm的OD值，并得出A260/A280，当其数值在1.8～2.0之间说明总RNA的纯度较好；当小于2.0说明有残余的盐离子和小分子杂质的污染，当大于2.0则说明可能总RNA的降解：

4.RNA逆转录：

1)去除基因组DNA的反应，使用PrimeScript^TMRT>

表1去除DNA的反应混合体系

试剂使用量5×gDNA Eraser Buffer2μlgDNA Eraser1μlTotal RNA1μgRNase Free H₂Oup to 10μl

2)使用PrimeScript^TM>

表2反转录扩增体系

试剂使用量5×PrimeScript Buffer 24μlPrimeScript RT Enzyme Mix I1μlRT Primer Mix1μlRNase Free dH2O4μlReaction solution from step110μl

5、荧光定量PCR：

1)引物设计

采用在线引物设计软件，基因序列参照RP11-387H17.6、BC080653、RP1-32B1.4、GHRLOS、RP5-1068H6.3和XLOC_009769，内参选GAPDH，引物设计后由上海生工公司合成。具体引物序列如表3所示：

表3引物序列

2)Real-Time PCR具体操作过程：

反应体系：用SYBR premix Ex Taq^TMII试剂盒(TakaRa，货号cat.#RR820A)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。阶段1：预变性，Reps:1，95℃，30s；阶段2：循环反应，Reps:40：95℃，5s；60℃，31s；阶段3：熔解曲线，Reps:1：95℃，15s；60℃，60s；95℃，15s；

表4 Real-Time PCR反应体系

组分加入量2×mix10μl上游引物(10μM)0.8μl下游引物(10μM)0.8μl模板2μlROX Reference Dye(50X)0.4μldH₂O6μl

Real-time PCR的结果分析：

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，基线平而无上扬，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式用上述方法可测得的样品外周血白细胞中目标LncRNA和参照GAPDH的ct值。以GAPDG为参照,求得其在外周血白细胞的相对含量,以PCR检测中经典的2-^△ct的方式表示外周血白细胞中的LncPR11-387H17.6的表达量(△ct为目标lncRNA与参照GAPDH的ct值之差)。

统计学分析

采用统计学软件SPSS 22.0，统计学显著性差异定义为P＜0.05。应用Mann–Whitney U检验比较LncRNAs在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄、非肾动脉狭窄及健康志愿者的表达差异水平。本实施例中用这些数据绘制ROC曲线。ROC曲线全称为受试者工作特征曲线(receiver operator characteristiccurve)，又称为接收者操作特性曲线，主要用于临床生化诊断试验。ROC曲线是反映真阳性率(灵敏度，又称敏感性，sensitivity)和假阳性率(1-特异性，specificity)连续变量的综合指标，是用构图法揭示灵敏度和特异性的相互关系。它通过设定一系列不同的分界值(阈值或临界值，cut-off value，是划分诊断试验结果正常与异常的界值)作为连续变量，从而计算出一系列灵敏度和特异性，再以灵敏度为纵坐标、1-特异性为横坐标绘制的曲线，曲线下面积(AUC)越大，诊断准确性越高。在ROC曲线上，最靠近坐标图左上方的点为灵敏度和特异性均较高的临界值。ROC曲线AUC值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。

实施例4外周血中白细胞lncRNA的表达分布

作为一个良好的疾病诊断标记物,首要的前提是在肾动脉狭窄人群中高表达，在健康人群外周血中检测不到或者相对稳定存在。因此本发明首先通过芯片的方法检测4例肾动脉狭窄患者和非肾动脉狭窄患者的肾动脉组织，其中大约有1150多种lncRNA在肾动脉狭窄组织中可被lncRNA芯片检测到,根据差异倍数＞3倍，P<0.05,筛查出RP11-387H17.6、BC080653、RP1-32B1.4、GHRLOS、RP5-1068H6.3和XLOC_009769在肾动脉狭窄患者中含量较高,且相对稳定，结果如图2所示。

实施例5

同时本发明通过更为精确的方法(real-time PCR)-重点检测了-lncRP11-387H17.6、BC080653、RP1-32B1.4、GHRLOS、RP5-1068H6.3和XLOC_009769在训练样本，18例肾动脉狭窄患者，18例非肾动脉狭窄患者和18例健康志愿者外周血白细胞中的表达水平，结果RP11-387H17.6在肾动脉狭窄组表达差异最显著。各表达水平结果如图3所示。继续收集99位肾动脉狭窄患者，49例非肾动脉狭窄患者，50例健康志愿者作为验证样本。通过外周血白细胞中的RNA的抽提，real-time PCR的方法对外周血白细胞中目标LncRP11-387H17.6分别作了检测，结果如图4所示。RP11-387H17.6在肾动脉狭窄中水平明显高于非肾动脉狭窄和健康志愿者外周血白细胞水平。

实施例6 RP11-387H17.6作为肾动脉狭窄的诊断的ROC评价。

根据所得数据进行分析,RP11-387H17.6、BC080653、RP1-32B1.4、GHRLOS、RP5-1068H6.3和XLOC_009769的AUC面积分别为：0.826,0.756,0.770,0.725,0.755，0.534。其中RP11-387H17.6能最好的区分肾动脉狭窄和非肾动脉狭窄，诊断准确性较高。再次从验证样本验证RP11-387H17.6,AUC面积为0.733，敏感性52.5％，特异性84.8％。

实施例7试剂盒的制备

基于实施例2得到的引物组，组装本发明所述用于动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的诊断试剂盒，所述试剂盒包括特异扩增RP11-387H17.6、BC080653、RP1-32B1.4、GHRLOS、RP5-1068H6.3和XLOC_009769中一个或多个基因的引物组如表3所示，具体为：

试剂盒1包括特异性扩增RP11-387H17.6的引物对，其中上游引物序列为SEQ IDNo.2(5’-CGCAAACAGCAAAAGAACAA-3’)，下游引物序列为SEQ ID No.3(5’-GGCTCTACCAATCAGCAGGA-3’)。

特异扩增管家基因(GAPDH)的引物对如表3所示；还包括SYBR Green聚合酶链式反应体系，如PCR缓冲液、SYBR Green荧光染料、dNTPs。

通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定反应体系如表4所示。

本发明的技术关键点：

通过qRT-PCR检测，发现在动脉粥样硬化性肾动脉狭窄的外周血白细胞中，LncRP11-387H17.6的表达水平显著高于非肾动脉狭窄和健康志愿者组，提示LncRP11-387H17.6作为动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物的可行性及临床应用价值。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军沈阳军区总医院

<120> 动脉粥样硬化性肾动脉狭窄诊断分子标记物的应用

<130> 15

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 784

<212> DNA

<213> 序列

<400> 1

cccaagggct ttggaactgc gggattggga cacgtgactt ccctggtcat tcaccttgaa 60

gtggacacgg gctggggtga gagaggggaa actgccccat cttctcatct tagaaccatg 120

cagcgttaat gctggaaggg accttggagt cgattccaac cccgtgaact gggccaggga 180

aggaagtgcc ttgcccaagg tcatgagagg gcatttcatc atgttgccca ggctgatctc 240

aaactcctgg gcttgtgtcc gaaactggtg agtgcttggt ctcactgact tcaagaagga 300

agccgcggac cctcgcagtg agtgttacag ctcttaaggt ggtgcatctg gagtttgttc 360

cttctgatgt tcagatgtgt tcgcagtttc ttccttctgg tgggttcgtg gtctcgctgg 420

ctgaggagtg aagctgcaga ccttcgcggt gagtgttata gctcttaagg cagcgcggcc 480

ggagttgttc attcctcccg gtgggctcgt ggtcttagtg gcttcaggag tgaagctgca 540

gaccttcgtg gtgagtgtta cagctcataa aagcagtgtg gacccaaaaa gcgagcagta 600

gcaagattta tcgcaaacag caaaagaaca aagctgccat attgtggatg gggacctgtg 660

cccgttgcca ctgctggctc gggcagcctg cttttattct cttatctggc cccacccaca 720

tcctgctgat tggtagagcc gagtggtctg ttttgacagg gcgctgattg gtgcgtttac 780

aatc 784

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<212> DNA

<213> 引物

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cgcaaacagc aaaagaacaa 20

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<212> DNA

<213> 引物

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ggctctacca atcagcagga 20

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<212> DNA

<213> 引物

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catctgccct tggttgactt 20

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<212> DNA

<213> 引物

<400> 5

cctggctact cccctgttct 20

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<212> DNA

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taaagagggg tctggctctg 20

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ccagctactt gacaggctga g 21

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<212> DNA

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cctggatctc ttgacgtggt t 21

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<400> 10

tgatgaatca gttggatggt g 21

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<212> DNA

<213> 引物

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aggagggctg agtgcaagt 19

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<212> DNA

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