降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株及其筛选和应用

摘要

本发明公开了一种降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株及其筛选和应用。该菌株分类命名为阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)DT，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC 14949。处理方法包括以香豆素为唯一碳源的培养基进行菌株筛选和分离及16S rDNA鉴定；同时探究该菌发酵培养液对黄曲霉毒素B1的降解作用。通过挑取固体培养基上阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)单菌落接种于50mL生长培养基中，30‑40℃的条件下摇床振荡12‑24h，将其发酵培养液与浓度为2μg/mL黄曲霉毒素B1于暗处反应3‑4d，可达到82.98％的降解率。本发明筛选的阿耶波多氏芽孢杆菌对黄曲霉毒素B1有明显的降解作用，且具有高效节能、环境友好等特点，可应用于相关黄曲霉毒素脱毒剂的制备。

说明书

技术领域

本发明属于新菌种筛选技术及微生物技术领域，特别涉及一株能降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素是到目前为止所发现的毒性最大的真菌毒素，其基本结构是双呋喃环和香豆素。它主要由黄曲霉、寄生曲霉等曲霉生成的次级杂环代谢产物。黄曲霉毒素是剧毒物质，具有极强的致癌性，长期摄入毒素在肝脏蓄积可引起肝癌，并引发其他器官如肾、肺、胃肠等癌变，在所有黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最强，已被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)归为I级人类致癌物。黄曲霉毒素主要存在于霉变的花生、谷物、果仁和大米中。据联合国粮农组织(FAO)统计，全世界每年谷物产量的25％受到霉菌毒素不同程度的污染，特别是黄曲霉毒素的污染，其中AFBl污染最为严重为玉米，其次为稻谷和小麦。世界卫生组织(WHO)规定食品中黄曲霉毒素最高允许浓度为15μg/kg，我国在食品中真菌毒素限量GB 2761-2017中，对黄曲霉毒素B1分别在花生、玉米、大米、植物油、豆类、发酵食品以及乳制品中的限量制定了明确规定。

降低或除去食品和饲料中的黄曲霉毒素的方法主要集中在物理和化学方式。物理方法主要有光照、超声波和超高温等，但这些过程可能会受到温度、时间等因素的影响，造成食品中营养物质的破坏和损失。化学方法是添加一些物质来降解或破坏黄曲霉毒素，如添加氧化剂，铵解法和氢氧化钠法等，但这些化学物质可能会残留在食品中并且很难去除，因此常规的物理和化学方法去除食品中的黄曲霉毒素存在效果不稳定、营养成分损失大、饲料适口性差、难以规模化生产等缺点，较难广泛用于生产实践。因此，需要来建立一种安全、高效、环保的控制黄曲霉毒素污染的方法来弥补物理和化学去毒方法存在的诸多应用缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于降解和去除黄曲霉毒素B1的菌株和应用方法，来克服和替代现有脱毒技术的缺点与不足，本发明为去除黄曲霉毒素提供一种新型简单易行、高效节能、特异性强的微生物处理方法，具有广阔的应用前景。

本发明以香豆素为唯一碳源的培养法对降解黄曲霉毒素B1菌株进行了筛选。

香豆素作为唯一碳源培养法：称取土壤样品加入到装有无菌生理盐水的三角瓶中，磁力搅拌振荡均匀制成悬液，将悬液转入离心管，并在3000-4000g下离心，取上清液用无菌生理盐水稀释，吸取适量稀释液涂布于香豆素固体培养基上，30-37℃下培养6-7d，待培养皿中长出菌落后，挑取单个菌落在香豆素固体培养基上进行反复分离划线，并连续三代培养获得遗传稳定性的菌株，即为所述降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株。

作为优选，所述香豆素固体培养基组分为：香豆素1g/L、KH₂PO₄>2·2H₂O>3·6H₂O>3>4·7H₂O>4)₂SO₄0.5g/L，琼脂15-20g/L，余量为蒸馏水。

本发明还公开了一种降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株的发酵培养液，其制备方法如下：将本发明筛选的所述菌株接种到LB液体培养基或营养肉汤培养基中，培养18-24h后，获得发酵培养液。

作为优选，所述LB液体培养基的组分为：8-10g/L蛋白胨，5-8g/L酵母粉，10-15g/L氯化钠，pH 6.8-7.0。

作为优选，营养肉汤培养基组分为8-10g/L蛋白胨，3-5g/L牛肉膏，5-8g/L氯化钠，pH 7.0-7.2。

所述菌株的接种量为1-2％(V/V)。

本发明还公开了一种降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株的发酵上清液，制备方法为将所述发酵培养液经9000g离心5-10min，得到发酵上清液。

本发明还公开了一种降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株的菌体干粉，制备方法为将所述发酵培养液离心，沉淀经12-24h冷冻干燥获得菌体干粉。

本发明还公开了一种所述菌株用于降解食品或饲料中黄曲霉毒素B1的应用，其特征在于，将所述菌株接种到LB液体培养基或营养肉汤培养基中，培养18-24h后，获得发酵培养液，或再将发酵培养液离心获得发酵上清液；或将发酵培养液离心后的沉淀干燥获得菌体干粉；将发酵培养液、发酵上清液或菌体干粉中的一种或多种加入到含有黄曲霉毒素的食品、饲料或含毒素农产品中，1mL发酵培养液稀释10-30倍用于1-3kg农产品，混合均匀，在30-40℃暗处连续反应3-4d。

通过上述方法，本发明筛选出一株微生物菌株，通过革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌，同时根据宝日医生物细菌基因组DNA提取试剂盒(TakaraBacteria Genomic DNAExtraction Kit)步骤和PCR方法提取并扩增该菌株的基因组DNA，通过测定16S rDNA的序列来进行菌种鉴定。将该菌种的所测得到的序列在GenBank数据库中进行BLAST对比分析，在比对匹配度最高的结果中发现与阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)的16SrDNA序列有100％的同源性。可确定菌种为阿耶波多氏芽孢杆菌，命名为BacillusaryabhattaiDT。该菌株的生物保藏信息为：中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院)，菌种保藏号CGMCC 14949。

本发明的菌株能以香豆素作为唯一碳源。本发明筛选分离出的降解黄曲霉毒素B1的菌株DT能使2μg/mL的黄曲霉毒素B1在3天内的降解率达到82.98％，对黄曲霉毒素的降解能力优于现有商品化物理和化学方法，具有效率高、特异性强、对饲料农副产品和环境无污染等特点和优势。

附图说明

图1本发明菌株DT的平板培养性状；

图2本发明菌株DT的革兰氏染色结果；

图3本发明菌株DT在不同反应时间中对黄曲霉毒素B1降解效果，其中纵坐标代表黄曲霉毒素B1降解率，横坐标代表作用时间；

图4本发明菌株DT的16S rDNA序列Neighbor-Joining系统发育树。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，但下述的实施例不用来限制本发明的保护范围。

实例1：本发明所述降解黄曲霉毒素的微生物菌株的快速筛选

1.实施步骤

从浙江省杭州市浙江大学园林研究所的果蔬园区随机采集多份土样于自封袋中，并注明采集名称、地点、时间等信息。将采集的土壤样品称5g于50mL的0.85％无菌生理盐水中，磁力搅拌振荡均匀制成土壤悬液。将土壤悬液转入已灭菌的离心管中3000-4000g下离心3-5min，取土壤悬液上层清液1mL，用浓度梯度稀释法进行逐级稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，吸取200μL均匀涂布于以香豆素作为唯一碳源的固体培养基[成分：香豆素1g/L、KH₂PO₄>2·2H₂O>3·6H₂O>3>4·7H₂O0.25g/L、(NH₄)₂SO₄>

2.实施结果分析

通过以香豆素为唯一碳源的培养基筛到的菌株形态呈圆形，不具有光泽，表面干燥略皱褶，边缘粗糙，颜色偏白不透明，不易被接种环挑起(图1)，经革兰氏染色为紫色，为革兰氏阳性菌(图2)。经查阅文献知，黄曲霉毒素B1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，基本结构为一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)。因此在上述实例操作中，选择以黄曲霉毒素B1的部分结构如香豆素为唯一碳源的固体培养基进行筛选，可以针对性地筛选降解黄曲霉毒素B1的菌株，而且还具有效率高，成本低等优势，之后再使用黄曲霉毒素B1进行验证，从而实现快速、安全和高效筛选。

实施例2：本发明所述微生物菌株对黄曲霉毒素B1的降解能力测定

1.实施步骤

将选取的单菌落接种到装有已灭菌50mL LB液体培养基(成分：8-10g/L蛋白胨，5-8g/L酵母粉，10-15g/L氯化钠)的250mL三角瓶中，放置于恒温摇床中，以37℃，180rpm条件下培养18-24h后，取900μL发酵培养液于灭菌的2mL的离心管中，加入100μLAFBl毒素混合均匀后，使其终浓度为2μg/mL，并放置在37℃的培养箱中暗处培养3-4d。对照组为含相同浓度AFBl的无菌液体培养基，分别在反应进行到0h、6h、12h、24h、48h和96h进行黄曲霉毒素B1的提取和检测。

黄曲霉毒素B1的提取：将上述反应混合液后，加入1mL的二氯甲烷并在涡旋振荡仪上萃取3次，每次30s，充分震荡，静置5min待出现明显的分层后，合并收集每次下层的二氯甲烷装于5mL离心管中，于室温下氮气缓慢吹干，用0.5mL甲醇溶解残留物。小心吸取上清液，适当稀释至测量范围以内，以0.22μm的有机系微孔滤膜过滤，作为HPLC上样样品。

黄曲霉毒素B1的检测：采用高效液相色谱(HPLC)法来测定反应后黄曲霉毒素B1的含量。黄曲霉毒素B1标品处理：称取黄曲霉毒素B1标准品粉末，用甲醇溶解配成1mg/mL母液，分别取250μL、100μL、20μL、10μL、2μL、0.5μL母液加甲醇至l mL(浓度分别为250μg/mL、100μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、2μg/mL、0.5μg/mL)。

流动相处理：各流动相(甲醇、乙腈、超纯水)分别进行抽滤并脱气处理30min。

液相色谱条件：以60％的超纯水、30％的乙腈和10％的甲醇为流动相；流速1mL/min；检测波长362nm，使用Promosil C18色谱柱4.6mm×250mm/5μm，柱温为30℃；出峰时间约为10-12min。根据峰面积对比标准曲线得到黄曲霉毒素B1含量，并结合对照组，计算黄曲霉毒素B1的降解率，计算公式如下：

降解率％＝(1-处理后AFBI峰面积/对照中AFBl的峰面积)×100％

2.实施结果分析

图3为本发明所述菌株在不同时间段内对黄曲霉毒素B1降解效果。通过与对照组相比，在原培养液中所添加的黄曲霉毒素B1的含量显著下降，同时，本发明所述菌株在随着反应的时间的推进，其黄曲霉毒素B1的降解率也逐渐升高。在起初的12h内，本发明所述菌株对黄曲霉毒素B1的降解率呈线性递增，在12h达到62.04％，随后的24h和48h中，黄曲霉毒素B1的降解率增加逐渐变慢，可能是由于黄曲霉毒素B1对该菌株具有一定的抑制作用，加上菌株本身的自身的代谢废物的积累，从而导致该菌株对黄曲霉B1的降解变慢，到了72h和96h，黄曲霉毒素B1的降解率趋于稳定，保持在82.98％。

实施例3：本发明所述微生物菌株的鉴定

1.实施步骤

根据宝日医生物细菌基因组DNA提取试剂盒(TakaraBacteria Genomic DNAExtraction Kit)步骤提取本发明所述菌株的总DNA，以通用引物27F和1492R扩增该菌的16S rDNA基因，回收扩增产物后进行测序，通过测定16S rDNA的序列来进行菌种鉴定。获得的序列结果在NCBI进行Blast比对，从GenBank的数据库中获得与该菌株16S rDNA同源的公认标准序列数据，使用MEGA软件计算序列相似性并采用领位相连算法(Neighbor-Joining)作系统发育分析。

2.实施结果分析

本发明所述菌株经16S rDNA全序列测定鉴定，其序列如SEQ ID NO:1所示：

SEQ ID NO:1：

ggccgggggggcgtgctatacatgcagtcgagcgaactgattagaagcttgcttctatgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcctgtaagactgggataacttcgggaaaccgaagctaataccggataggatcttctccttcatgggagatgattgaaagatggtttcggctatcacttacagatgggcccgcggtgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtacgagagtaactgctcgtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagagaaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttttggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaactctagagatagagcgttccccttcgggggacagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaaagggctgcaagaccgcgaggtcaagccaatcccataaaaccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggagtaaccgtaaggagctagccgcctaaggtgacaggggg

该菌株的16S rDNA在NCBI使用Blast比对，发现是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)并与其相似菌株16S rDNA序列构建16S rDNA系统发育树如图4所示，与阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)的同源性最高，可确定本发明所述菌株为阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)，并命名为Bacillus aryabhattaiDT。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行适当改变和修饰，这些改变和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌属菌株及其筛选和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1457

<212> DNA

<213> 阿耶波多氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)

<400> 2

ggccgggggg gcgtgctata catgcagtcg agcgaactga ttagaagctt gcttctatga 60

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