液相色谱串联质谱测定血清中维生素A和E的方法

摘要

本发明属于维生素检测技术领域，具体公开了一种液相色谱串联质谱测定血清中维生素A和E的方法。本发明对每种待测物均采用两种离子对进行监测，一种用于定量监测，一种用于定性监测，以增加检测特异性，避免复杂血液成分中的潜在干扰。不仅如此，本发明通过在溶液中加入一种抗氧化剂，使操作过程中不需避光即可完成，方便操作实行。

说明书

技术领域

本发明属于维生素检测技术领域，具体地说，涉及液相色谱串联质谱测定血清中维生素A和E的方法。

背景技术

维生素是维持生命活动必须的一类有机物质，通过调节机体代谢维持人体健康。大多数维生素，机体不能合成或合成量不足，不能满足机体的需要，必须通过食物获得，少数维生素可通过自身合成获得，但当机体处于疾病状态或者受到生活方式的影响亦可导致缺乏。维生素A和维生素E都属于脂溶性维生素，是人体必需的营养素。维生素A(vitaminA)又称视黄醇，是一个具有脂环的不饱和一元醇，具有维持视觉、维护上皮组织细胞、促进免疫球蛋白合成、维持骨骼生长发育、抑制肿瘤等重要生理功能。

维生素E(Vitamin E)是最主要的抗氧化剂之一，其水解产物为生育酚。维生素E溶于脂肪和乙醇等有机溶剂中，不溶于水，对热、酸稳定，对碱不稳定，对氧敏感，对热不敏感，但油炸时维生素E活性明显降低。维生素E苯环上的酚羟基被乙酰化，酯水解为酚羟基后为生育酚。生育酚能促进性激素分泌，使男子精子活力和数量增加；使女子雌性激素浓度增高，提高生育能力，预防流产，还可用于防治男性不育症、烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面。近来还发现维生素E可抑制眼睛晶状体内的过氧化脂反应，使末梢血管扩张，改善血液循环，预防近视眼发生和发展。维生素E包括生育酚和三烯生育酚两类共8种化合物，即α、β、γ、δ-生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚，α-生育酚是自然界中分布最广泛含量最丰富活性最高的维生素E形式，其通过清除过氧化物来保护不饱和脂肪酸，并且在癌症、心血管疾病、白内障、老年性黄斑变性等疾病中起到重要的抗氧化剂作用。维生素E临床检测中主要为检测α-生育酚。

对于血清中维生素A和E的测定，已报道的测定方法多是基于液相色谱，关注焦点在于维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)。也有关于γ-生育酚以及β-生育酚的液相色谱定量方法，但是目前认为临床最有意义的仍为视黄醇(维生素A)和α-生育酚(维生素E)。维生素A和E目前主要的技术及文献多是采用液相色谱进行分离测定(B.L.Lee,A.L.New,C.N.Ong,Clin.Chem.49 2003，2056–2066；)，也被报道可通过微乳球电泳色谱来分离(M.Bustamante-Rangel,M.M.Delagado-Zamarreno,A.Sanchez-Perez,R.Carabias-Martinez,J.Chromatogr.A 1125 2006，270–273.)。但是由于维生素E存在多种亚型，分离需要时间较长(B.L.Lee,A.L.New,C.N.Ong,Clin.Chem.492003，2056–2066.)，且色谱法检测主要是依赖于色谱柱对不同待测物的保留时间不同而进行分离，依靠不同的紫外吸收波长进行检测，不是对待测分子直接检测，特异性较低，临床样本成分复杂，可能存在与待测物色谱保留时间及紫外吸收均相同的物质，而对检测成分产生干扰。

液相色谱串联质谱技术是一门新兴的技术，其具有色谱的分离能力，以及质谱的特异性鉴定能力，在小分子物质测定中具有极大的优势，被认为是小分子检测的参考方法(如目前的维生素D，血糖，肌酐等小分子检测的参考方法)。

CN106442754A公开了一种同时检测血液中维生素A和维生素E含量的方法，包括以下步骤：(一)将全血样本离心，取上清液得血清或血浆，备用；(二)标准溶液的标定；(三)样品前处理；(四)取步骤(三)中上清液样品80μL放入自动进样瓶中经液相色谱法或液相色谱串联质谱进行分析，同时定量检测血液中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的含量。

然而，该技术方案中，采用液相色谱法进行分析，需依赖于色谱柱对不同待测物的保留时间不同而进行分离，依靠不同的紫外吸收波长进行检测，不是对待测分子直接检测，特异性较低，而临床样本成分复杂，可能存在与待测物色谱保留时间及紫外吸收均相同的物质，而对检测成分产生干扰；而采用液相色谱串联质谱进行分析，对维生素A和E仅使用了一种离子对进行监测，但在自然界中可能存在着两种母离子及子离子均相同的类似物干扰，由于测定的是患者血清，不同患者血清成分不同，所服用的药物也不同，成分复杂，因此，使用单一的离子对进行监测可能造成对待测物的误判。

不仅如此，维生素A和E在空气和光照下容易被氧化，所述方法中也表明，在标准物配制整个过程均需避光，而在操作中完全避光基本不可能实现，操作难度大。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种液相色谱串联质谱测定血清中维生素A和E的方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种液相色谱串联质谱测定血清中维生素A和E的方法，包括：

(1)通过样本制备液提取血清样本中的维生素A和维生素E，将提取后的样本通过色谱仪取样进入色谱质谱系统，通过色谱柱的初步分离，进入质谱中，再根据质谱中产生不同的质荷比检测样本中是否含有维生素A和维生素E，实现血清中维生素A和E的定性检测；

(2)采用稳定同位素标记的视黄醇-d6和α-生育酚-d6作为内标，通过制备一系列不同浓度的标准品溶液，检测信号强度，以标准品溶液的浓度作为横坐标，以标准品溶液信号强度与内标信号强度的比值作为纵坐标，制作标准曲线；

(3)检测待测样本的信号强度，将其与内标信号强度的比值代入上述标准曲线进行计算，得到待测样本中检测目标的浓度，实现对血清中维生素A和E的定量检测。

样本的信号强度与样本中维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)的浓度呈正比。

进一步地，在上述定性检测中，也采用稳定同位素标记的视黄醇-d6和α-生育酚-d6作为内标。本发明所采用的内标与维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)具有相似的理化性质，可抵消在样本处理中的不准确因素，以及色谱质谱中的信号抑制或增强。

其中，针对通过样本制备液提取血清样本中的维生素A和维生素E的具体操作方法，进行示例性说明如下：

取50μL血清样本或标准品至5mL玻璃管，加入20μL同位素内标，混合震荡，加入200μL甲醇溶液，加入100μL硫酸锌溶液，加入1mL正己烷，混合震荡，取上清液800μL，氮气吹干，加入300μL复溶液，等待上机测试，进样体积：10μL。

其中，所述甲醇溶液为含有10mg-50mg/L 2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)的的甲醇溶液，优选为含有30mg/L的BHT；

所述正己烷为色谱级别的正己烷；

所述硫酸锌溶液的浓度为0.05M-0.5M，优选为0.2M；

所述同位素内标包括：视黄醇-d6溶液：浓度为0.2-1μg/mL，优选为0.8μg/mL；α-生育酚-d6溶液：浓度为0.5-20μg/mL，优选为15μg/mL；

所述复溶液为由甲醇与水以1:1～10:1的体积比混合后的混合物，优选为以8:1的体积比混合。

进一步地，所述色谱柱的初步分离中，所使用的仪器分析液中含有：流动相A：含有0.01％-0.1％甲酸的甲醇溶液，优选为使用0.02％甲酸的甲醇溶液；流动相B：含有0.01％-0.1％甲酸的水溶液，优选为使用0.02％甲酸的水溶液。

液相色谱流动相A和流动相B按如下梯度进行设置：

进一步地，进入质谱后，选择多离子监测反应模式，正离子模式，电喷雾电离，离子源温度300-600℃，优选为550℃，GS1：30-80，优选为65，GS2：30-80，优选为60，具体监测的离子对以及碰撞能量(CE)、去簇电压(DP)如下：

进一步地，当进行定量测定时，所述标准品溶液的制备方法如下：

使用Cerilliant准确定值的标准溶液作为标准品溶液的母液，将维生素A的母液和维生素E的母液同时加入A级定容瓶准确定容作为储存液，此时，储存液中维生素A的浓度为6.22μg/mL，维生素E的浓度为47.1μg/mL；经一系列稀释使维生素A的浓度分别为6.22，3.11，1.56，0.78，0.39，0.19，0.10，0.05μg/mL；维生素E的浓度分别为47.1，23.6，11.78，5.89，2.94，1.47，0.74，0.37μg/mL。

第二方面，本发明一种用于液相色谱串联质谱测定血清中维生素A和E的试剂盒，包括样本制备液、标准品溶液、和仪器分析液：

其中，所述样本制备液包括甲醇溶液，正己烷，硫酸锌溶液，同位素内标，复溶液：所述甲醇溶液为含有10mg-50mg/L 2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)的的甲醇溶液，优选为含有30mg/L的BHT；所述正己烷为色谱级别的正己烷；所述硫酸锌溶液的浓度为0.05M-0.5M，优选为0.2M；所述同位素内标包括：视黄醇-d6溶液：浓度为0.2-1μg/mL，优选为0.8μg/mL；α-生育酚-d6溶液：浓度为0.5-20μg/mL，优选为15μg/mL；所述复溶液为由甲醇与水以1:1～10:1的体积比混合后的混合物，优选为以8:1的体积比混合；

其中，所述标准品溶液的制备方法如下：

使用Cerilliant准确定值的标准溶液作为标准品溶液的母液，将维生素A的母液和维生素E的母液同时加入A级定容瓶准确定容作为储存液，此时，储存液中维生素A的浓度为6.22μg/mL，维生素E的浓度为47.1μg/mL；经一系列稀释使维生素A的浓度分别为6.22，3.11，1.56，0.78，0.39，0.19，0.10，0.05μg/mL；维生素E的浓度分别为47.1，23.6，11.78，5.89，2.94，1.47，0.74，0.37μg/mL；

其中，所述仪器分析液包括：

流动相A：含有0.01％-0.1％甲酸的甲醇溶液，优选为使用0.02％甲酸的甲醇溶液；流动相B：含有0.01％-0.1％甲酸的水溶液，优选为使用0.02％甲酸的水溶液。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选为条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明对每种待测物均采用两种离子对进行监测，一种用于定量监测，一种用于定性监测，以增加检测特异性，避免复杂血液成分中的潜在干扰。不仅如此，本发明通过在溶液中加入一种抗氧化剂，使操作过程中不需避光即可完成，方便操作实行。

附图说明

图1为实施例1中液相色谱串联质谱检测得到的离子谱图。

图2为实施例1中利用不同浓度的标准品溶液与同位素内标的信号强度制作的标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1.配制试剂，包括样本制备液、标准品溶液、和仪器分析液，分别如下：

1.1样本制备液含有：甲醇溶液，正己烷，硫酸锌溶液，同位素内标，复溶液。

(1)甲醇溶液：含有30mg/L 2,6-二叔丁基对甲苯酚(BHT)的甲醇溶液。

(2)正己烷：色谱级别的正己烷。

(3)硫酸锌溶液：硫酸锌浓度为0.2M的水溶液。

(4)同位素内标：

视黄醇-d6溶液：浓度为0.8μg/L；

α-生育酚-d6溶液：浓度为15μg/L。

(5)复溶液：甲醇：水＝8:1。

1.2标准品溶液：使用Cerilliant准确定值的标准溶液作为标准品溶液的母液，将维生素A的母液和维生素E的母液混合、采用定容瓶准确定容，经一系列稀释使维生素A的浓度为6.22，3.11，1.56，0.78，0.39，0.19，0.10，0.05mg/L；维生素E的浓度为47.1，23.6，11.78，5.89，2.94，1.47，0.74，0.37mg/L。

1.3仪器分析液中含有：

流动相A：含有0.02％甲酸的甲醇溶液；

流动相B：含有0.02％甲酸的水溶液。

2.样本制备：取50μL待测血清样本或标准品溶液至5mL玻璃管，加入20μL同位素内标，混合震荡，加入200μL甲醇溶液，加入100μL硫酸锌溶液，加入1mL正己烷，混合震荡，取上清液800μL，氮气吹干，加入300μL复溶液，等待上机测试，进样体积：10μL。

3.检测：

液相色谱流动相A和流动相B按如下梯度进行设置：

质谱选择多离子监测反应模式，正离子模式，电喷雾电离，离子源温度300-600℃，优选为550℃，GS1：30-80，优选为65，GS2：30-80，优选为60，具体监测的离子对以及碰撞能量(CE)、去簇电压(DP)等见下表：

4.检测效果：利用本发明所述方法及配套试剂所检测得到的典型谱图如图1所示。

由图1可以看出，维生素A(视黄醇)、维生素A同位素内标、维生素E(α-生育酚)、以及维生素E同位素内标通过不同的离子对进行监测，互不干扰，峰行良好，且维生素A(视黄醇)和维生素E(α-生育酚)均使用了两对离子对同时进行监测，保证检测的特异性。

5.检测不同浓度标准品溶液的信号强度和同位素内标的信号强度，以标准品溶液的浓度作为横坐标，以标准品溶液信号强度与内标信号强度的比值作为纵坐标，制作标准曲线，如图2所示。

由图2可以看出，样品浓度与其在质谱中的响应信号强度呈直线线性关系，本发明所配制的试剂线性良好，可保证检测结果的准确。

当检测到血清样本中存在维生素A和/或维生素E，并需对其进行定量测定时，可通过检测血清样本的质谱信号强度，将其与同位素内标信号强度的比值代入上述标准曲线中进行计算，得到血清样本中维生素A和/或维生素E的浓度。

6.试剂的准确性评价：

将利用本发明所述试剂与方法对有证标准物质NIST3668的测定结果与美国国家标准与技术研究院的有证标准物质NIST3668比较，偏差％均可控制在10％以内。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：

流动相A：含有0.1％甲酸的甲醇溶液，流动相B：含有0.1％甲酸的水溶液。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：

质谱选择多离子监测反应模式，正离子模式，电喷雾电离，离子源温度300℃，GS1：80，GS2：80。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：

质谱选择多离子监测反应模式，正离子模式，电喷雾电离，离子源温度600℃，GS1：30，GS2：30。

对实施例2-4进行与实施例1相同的定性实验和定量实验，均可得到高特异性定性结果，以及一次线性的标准曲线。

应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。