一种动态pH响应链基于硼酸型金属有机络合物的制备方法

摘要

本发明属生物医药功能材料制备技术领域，一种动态pH响应链基于硼酸型金属有机络合物的制备方法。因此，本工作利用金属有机络合物引入硼酸基配体，而后通过金属有机络合物的多孔结构载上抗癌药物阿霉素(DOX)，然后在接上亲水型的生物链(PEG‑NHS‑PDA)作为动态响应链用来达到延缓释放及防止抗癌药物随意释放的目的。最后通过金属有机络合物识别癌细胞表面的唾液酸，并通过热疗作用来抑制癌细胞的生长。

说明书

技术领域

本发明属生物医药功能材料制备技术领域，涉及本发明涉及一种动态pH响应链基于硼酸型金属有机络合物的制备方法。

背景技术

随着对肿瘤细胞生物学和遗传学的认识不断了解,新的治疗方法和手段也不断涌现,癌症的治疗研究已经取得了相当大的进步,其中肿瘤的热疗成为了一个新的热点。热疗的优势体现在副作用小，效果明显，治疗周期短等优势。癌症治疗的最初想法主要依赖于输送抗肿瘤化疗药物。然而，药物在传输过程中通常会释放抗癌药物从而破坏正常细胞和组织，带来不必要的药物副作用。因此为了提高药物载体的利用效率，开发多功能型药物载体是十分必要的。

目前，经过研究发现，唾液酸(Sialic acid)存在于癌细胞表面的一种物质，通常在细胞表面唾液酸残留物的多少与各类癌症的状态有明显的关联。为此，研究学者通过在药物载体上修饰与癌细胞组织可以特异性受体相结合的配体,从而实现载体与特异性受体的亲和。从而可以达到借助靶向药物来抑制甚至灭杀肿瘤,提高生存质量,减轻药物积聚带来的副作用。由于唾液酸包含顺势二羟基结构，拟采用硼亲和作用力来实现靶向癌细胞。硼亲和作用是硼酸基配体可以与二羟基结构可以生成五元环结构在中性或者碱性条件下，同时在酸性条件下五元酯环结构发生解离。金属有机络合物最近引起了科研的高度关注，它具有较大的比表面积和化学稳定性及优良的热效应。它是由金属离子和有机配体结合而成，金属离子作为中心点，有机配体作为框架。目前金属有机络合物已经被大量用于光催化，环境污染物分离，生物分离等领域，但是在载药方面的报道很少。

发明内容

现对现有技术存在的问题，本发明利用金属有机络合物引入硼酸基配体，而后通过金属有机络合物的多孔结构载上抗癌药物阿霉素(DOX)，然后再接上聚乙二醇-多巴胺的生物链(PEG-NHS-PDA)作为动态响应链用来达到延缓释放及防止抗癌药物随意释放的目的。最后通过金属有机络合物识别癌细胞表面的唾液酸，并通过热疗作用来抑制癌细胞的生长。

本发明通过双重靶向作用制备磁性功能型硼酸基金属有机框架长期缓释药物载体。首先，合成聚多巴胺纳米颗粒，将盐酸多巴胺加入到乙醇和水的混合溶液中，并逐步滴加氨水溶液使混合溶液由黄色变为黑棕色，然后连续搅拌制备得到多巴胺聚合物颗粒.将制备得到的多巴胺聚合物颗粒作为载体，然后将3,5-二羧基苯基硼酸(BBDC)和1,3,5-均三苯甲酸(BTC)作为有机配体N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙醇作为溶剂和金属离子Zn²⁺作为连接点在多巴胺纳米颗粒表面长上聚合物。然后载上抗癌药物阿霉素，在碱性条件下泡上PEG-NHS-PDA溶液。最后在37℃真空干燥。最后，最终材料功能型硼酸基金属有机络合物药物载体(PDA@CP-DOX-PEG)用于识别并灭杀癌细胞的研究。

本发明采用的技术方案是：

动态pH响应链基于硼酸型金属有机络合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)首先将乙醇和蒸馏水混合，然后再加入盐酸多巴胺，并用磁子搅拌分散20-40min；得到的溶液在200-400rpm的恒定搅拌下，向其中缓慢加入氨水溶液(28％-30％)，溶液立即由黄色变为黑棕色并连续搅拌12-48小时，并用蒸馏水多次清洗，并在50-70℃条件下烘干12-48小时，从而制备得到聚多巴胺纳米颗粒(PDA)；

(2)将步骤(1)所制得PDA，六水合硝酸锌，无水乙醇，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)加入到聚四氟乙烯的反应斧当中，然后加入3,5-二羧基苯基硼酸BBDC和1,3,5-均三苯甲酸BTC，并在鼓风干燥箱内水热聚合反应，然后冷却到室温，用蒸馏水清洗多次，最后在真空50-70℃下烘干，制备得到prepared-PDA@CP(P-PDA@CP)；

(3)按照步骤(2)所述步骤，将P-PDA@CP与六水合硝酸锌，无水乙醇，DMF，BBDC，BTC再次进行水热聚合反应，清洗，烘干；该水热聚合反应重复3次；得到PDA@CP；

(4)将步骤(3)得到的PDA@CP加入到盐酸阿霉素(DOX)水溶液静置12-48小时，然后制备得到的PDA@CP-DOX用蒸馏水多次清洗。然后PDA@CP-DOX加入到聚乙二醇-多巴胺的生物链(PEG-NHS-PDA)的PBS缓冲溶液中(20mM,pH＝8.5)并机械搅拌12-48h，然后蒸馏水洗3遍。最后得到的PDA@CP-DOX-PEG在真空30-50℃下烘干12-48小时，得到的最终产物PDA@CP-DOX-PEG。

步骤(1)中，所述的乙醇，蒸馏水，盐酸多巴胺，氨水的比例为(20-30)mL:(20-30)mL:(0.4-0.6)g：(1-3)mL。

步骤(2)中，所述步骤(1)的PDA，六水合硝酸锌，BBDC,BTC,DMF,无水乙醇的比例为(80-120)mg:(40-60)mg:(7-9)mg:(7-9)mg:(10-15)mL:(10-15)mL。

步骤(2)中，所述水热聚合反应的温度为100-140℃，时间为6-24小时。

步骤(4)中，所述步骤(3)的PDA@CP，DOX,PEG-NHS-PDA,PBS的比例为(80-120)mg:(8-12)mg:(30-50)mg:(20-30)mL。

所述盐酸阿霉素水溶液的浓度为1.3mg/mL。

本发明所制备的动态pH响应链基于硼酸型金属有机络合物PDA@CP-DOX-PEG，用于识别癌细胞表面的唾液酸，并通过热疗作用来抑制癌细胞的生长的用途。

本发明的有益效果：

该产品通过制备一种动态pH响应链基于硼酸型金属有机络合物药物载体，属生物医药功能材料制备技术领域，通过制备金属有机络合物引入硼酸型有机配体，并修饰上一层PEG-NHS-PDA壳层具有近红外热响应性，生物兼容性能及优异的pH响应性能,可以有效的识别癌细胞表面的唾液酸，并且通过热疗作用抑制癌细胞生长。

附图说明

图1中a、b、c分别为实施例1中的PDA,PDA@CP和PDA@CP-DOX-PEG材料的TEM图像。

图2中a、b、c分别为实施例1中的PDA,PDA@CP和PDA@CP-DOX-PEG材料的动态光散射(DLS)谱图。

图3为实施例1中的PDA,PDA@CP和PDA@CP-DOX-PEG材料的XPS谱图。

图4为PDA,PDA@CP和PDA@CP-DOX-PEG材料的红外谱图。

图5为实验例1中的PDA@CP-DOX-PEG材料的在不同pH条件下的药物缓释曲线图。

图6为实验例1中的DOX,PDA@CP-DOX和PDA@CP-DOX-PEG材料在老鼠体内不同器官的荧光光学照片实物图。

图7为实验例1中的DOX,PDA@CP-DOX和PDA@CP-DOX-PEG材料的热疗的平均荧光强度谱图在老鼠体内不同器官。

具体实施方式

上述技术方案中所述的阿霉素吸附负载和长期缓释行为测试方法具体为：

(1)长期缓释阿霉素行为研究：

动态pH响应链基于硼酸型金属有机络合物药物载体释放阿霉素的释放动力学(10毫克)在20毫升不同pH值的缓冲溶液中测定(pH＝5.5，6.5，7.4)，37℃下恒温水浴中轻度抖动(120转/分)。在预定的时间间隔，收集0.1毫升的缓冲溶液并加入0.2毫升新鲜释放缓冲液。通过紫外-可见分光光度法在480nm检测药物含量测定药物的释放量，在0-0.03毫克每毫升浓度范围内的阿霉素的标准校正图来确定释放的DOX浓度。根据结果，计算累积阿霉素释放量：

其中M_t是阿霉素在时间t是的释放量,M是阿霉素总的释放量。

下面结合具体实施实例和说明书附图做进一步说明。

实施例1：

首先将20mL的乙醇和20mL的蒸馏水混合，然后再加入0.4g盐酸多巴胺，并用磁子搅拌分散20min；得到的溶液在200rpm的恒定搅拌下，向其中缓慢加入1mL的氨水溶液(28％-30％)，溶液立即由黄色变为黑棕色并连续搅拌12小时，并用蒸馏水多次清洗，并在50度条件下烘干12小时，从而制备得到聚多巴胺纳米颗粒(PDA)；然后将制备得的80mgPDA，40mg六水合硝酸锌，10mL的无水乙醇，10mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)加入到聚四氟乙烯的反应斧当中，然后加入7mg的BBDC和7mg的BTC，并在鼓风干燥箱内水热聚合6小时在100℃，然后冷却到室温，用蒸馏水清洗多次，最后在真空50摄氏度下烘干，然后重复上述步骤3次，制备得到PDA@CP。然后将得到的PDA@CP加入到8mg的盐酸阿霉素(DOX,1.3mg/mL)的溶液中静置12小时，然后制备得到的PDA@CP-DOX用蒸馏水多次清洗。然后80mg的PDA@CP-DOX和30mg的PEG-NHS-PDA加入到的20mL的PBS缓冲溶液中(20mM,pH＝8.5)并机械搅拌12h，然后蒸馏水洗3遍。最后得到的PDA@CP-DOX-PEG在真空30度下烘干12小时。

实施例2：

首先将25mL的乙醇和25mL的蒸馏水混合，然后再加入0.5g盐酸多巴胺，并用磁子搅拌分散30min；得到的溶液在300rpm的恒定搅拌下，向其中缓慢加入2mL的氨水溶液(28％-30％)，溶液立即由黄色变为黑棕色并连续搅拌24小时，并用蒸馏水多次清洗，并在60度条件下烘干24小时，从而制备得到聚多巴胺纳米颗粒(PDA)；然后将制备得的100mgPDA，50mg六水合硝酸锌，12.5mL的无水乙醇，12.5mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)加入到聚四氟乙烯的反应斧当中，然后加入8mg的BBDC和8mg的BTC，并在鼓风干燥箱内水热聚合12小时在120℃，然后冷却到室温，用蒸馏水清洗多次，最后在真空60摄氏度下烘干，然后重复上述步骤3次，制备得到PDA@CP。然后将得到的PDA@CP加入到10.5mg的盐酸阿霉素(DOX,1.3mg/mL)的溶液中静置24小时，然后制备得到的PDA@CP-DOX用蒸馏水多次清洗。然后取100mg的PDA@CP-DOX和40mg的PEG-NHS-PDA加入到的25mL的PBS缓冲溶液中(20mM,pH＝8.5)并机械搅拌24h，然后蒸馏水洗3遍。最后得到的PDA@CP-DOX-PEG在真空40度下烘干24小时。

实施例3：

首先将30mL的乙醇和30mL的蒸馏水混合，然后再加入0.6g盐酸多巴胺，并用磁子搅拌分散40min；得到的溶液在400rpm的恒定搅拌下，向其中缓慢加入3mL的氨水溶液(28％-30％)，溶液立即由黄色变为黑棕色并连续搅拌48小时，并用蒸馏水多次清洗，并在70度条件下烘干48小时，从而制备得到聚多巴胺纳米颗粒(PDA)；然后将制备得的120mgPDA，60mg六水合硝酸锌，15mL的无水乙醇，15mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)加入到聚四氟乙烯的反应斧当中，然后加入9mg的BBDC和9mg的BTC，并在鼓风干燥箱内水热聚合24小时在140℃，然后冷却到室温，用蒸馏水清洗多次，最后在真空60摄氏度下烘干，然后重复上述步骤3次，制备得到PDA@CP。然后将得到的PDA@CP加入到12mg的盐酸阿霉素(DOX,1.3mg/mL)的溶液中静置48小时，然后制备得到的PDA@CP-DOX用蒸馏水多次清洗。然后取120mg的PDA@CP-DOX和50mg的PEG-NHS-PDA加入到的30mL的PBS缓冲溶液中(0mM,pH＝8.5)并机械搅拌48h，然后蒸馏水洗3遍。最后得到的PDA@CP-DOX-PEG在真空50度下烘干48小时。

试验例1：释放及热疗性能研究

(1)动态pH响应链基于硼酸型金属有机络合物药物载体释放阿霉素的释放动力学(10毫克)在25毫升不同pH值的缓冲溶液中测定(pH＝5.4，6.5，7.4)，37℃下恒温水浴中轻度抖动(120转/分)。在预定的时间间隔，收集0.2毫升的缓冲溶液并加入0.1毫升新鲜释放缓冲液。通过紫外-可见分光光度法在480nm检测药物含量测定药物的释放量，在0-0.03毫克每毫升浓度范围内的阿霉素的标准校正图来确定释放的DOX浓度。根据结果，计算累积阿霉素释放量。

图5结果表明：阿霉素在动态pH响应链基于硼酸型金属有机络合物药物载体的释放随pH的降低而增大，而且呈现优良的长期释放能力。pH＝5.4的缓冲溶液中动态pH响应链基于硼酸型金属有机络合物药物载体在前2个小时只释放3.4％阿霉素，并且在1天后达到缓释平衡。

(2)在肿瘤到达时进行了成像实验80mm³左右。这些小鼠被静脉注射DOX、PDA@CP-DOX和PDA@CP-PEG-DOX。在24小时后，肿瘤部位以808nm激光照射到1.5W>-2，持续5分钟。温度变化和红外热图由红外热图记录成像相机。

图6结果表明：在4小时的时候，PDA@CP-DOX和PDA@CP-PEG-DOX两者在肝脏中都显示出较少的荧光，但是可以在肿瘤中显示出更多的荧光，这表明载药材料可以黏附到癌细胞表面。在24小时注射后，在肿瘤组织中增加的荧光信号检测到PDA@CP-DOX和PDA@CP-PEG-DOX,而DOX却不显示荧光。我们可以找到PDA@CP-PEG-DOX在检测期间表现出最多的聚集量在肿瘤内部比PDA@CP-DOX和DOX。

(3)通过尾巴注射药物及各类药物载体(DOX,PDA@CP-DOX和PDA@CP-PEG-DOX分别以5mg/Kg的老鼠尾部的剂量注射药物载体。在老鼠体内4和24小时作用后，用自动活体体内成像系统所成像机器对切除的心脏，肝脏，脾脏，肺，肾和肿瘤组织进行荧光强度测试。

图7结果表明：在4小时的时候，在各个组织器官的荧光强度没有明显的区别，当到达24小时的时候，在肿瘤组织中，PDA@CP-PEG-DOX可以有更高的荧光强度比其他对比材料。

由图1的图像可以观察到，对比PDA和PDA@CP，PDA@CP比PDA多了一个聚合层，说明金属有机络合物成功沉积到PDA表面，当引入分子PEG-NHS-PDA,可以发现PDA@CP-PEG-DOX比PDA@CP的表面变得更加粗糙，说明PDA@CP-PEG-DOX成功制备成功。

由图2的图像可以观察到，动态光散射(DLS)谱图可以发现，粒径变得越来越大，PDA、PDA@CP和PDA@CP-PEG-DOX的平均直径分别是197.4、222.3和242.0纳米。表明PEG-NHS-PDA成功聚集到PDA@CP的表面。

由图3的图像可以观察到，PDA,PDA@CP和PDA@CP-DOX-PEG材料的红外谱图。PDA的红外光谱纳米颗粒显示了两种典型的吲哚的峰值大约1624和1530cm^-1，表明了PDA的成功制备。在CP沉积之后，典型的C＝O拉伸振动羧酸(1737cm^-1)和B-O苯硼酸(1389cm^-1)出现在PDA@CP和PDA@CP-PEG纳米粒子的红外光谱中，表明了(BBDC)和BTC在成功引入到聚合物的制备当中去。

由图4的图像可以观察到，PDA,PDA@CP和PDA@CP-DOX-PEG材料的XPS谱图。在XPS光谱中我们可以很明显地找到B1s的典型峰值(189.2eV)和Zn2p(1021.9eV)在PDA@CP表面上，表明BBDC和BTC与锌离子协同反应。但是，B1s和Zn2p的峰值PDA@CP-PEG几乎消失了，表面表面有一层厚厚的聚合层PEG-NHS-PDA。