白藜芦醇作为嘧霉胺的协同增效剂在防治葡萄灰霉病中的应用

摘要

本发明公开了白藜芦醇作为嘧霉胺的协同增效剂在防治葡萄灰霉病中的应用。防治葡萄灰霉病时，采用白藜芦醇和嘧霉胺的甲醇水溶液，其中，白藜芦醇的浓度为5～1000mg/L，嘧霉胺的浓度为0.3～88mg/L；具体表现为抑制葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的菌丝生长和/或孢子萌发。本发明采用的白藜芦醇作为一种常见的植物提取物，绿色安全，有益于人体健康，其作为苯氨基嘧啶类杀菌剂嘧霉胺的协同增效剂，极大地降低了嘧霉胺的使用量，且对葡萄灰霉病具有显著防效。

说明书

技术领域

本发明涉及一种白藜芦醇作为嘧霉胺的协同增效剂在防治葡萄灰霉病中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

葡萄是一种常见的水果，具有重要的营养价值，与人民群众的日常生活饮食密切相关。由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引发的葡萄灰霉病主要危害葡萄的花穗及果实，引发大量的落花、落果及果实腐烂，严重影响了葡萄的产量及质量。

目前，在生产上主要是采用嘧霉胺、醚菌胺和嘧菌环胺等苯氨基嘧啶类杀菌剂防治葡萄灰霉病。但是随着化学药剂的广泛使用，灰霉病菌的抗药性逐年增加；且随之增加的农药使用量对人身安全、自然环境等均造成了严重的威胁，因此，筛选新型低毒或无毒的化学农药的协同增效剂将是解决病原菌抗药性增长及农药使用量增大等问题的有效途径。

白藜芦醇是一种广泛存在于葡萄、花生等植物体内的酚类化合物，因其具有抗氧化性能且对多种人体疾病颇具防效而备受人们的重视。作为一种安全有效的植物提取物，白藜芦醇在植物病害防治上的应用受到日益重视，但是尚未有相关研究报道其作为化学农药嘧霉胺的协同增效剂在葡萄灰霉病防治上的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种防治葡萄灰霉病害的制剂：酚类化合物白藜芦醇和嘧霉胺的混合物，即白藜芦醇和嘧霉胺联合使用，白藜芦醇作为嘧霉胺的协同增效剂，能够显著提高嘧霉胺的防治效果。

本发明首先提供了一种防治葡萄灰霉病的制剂，其活性成分为白藜芦醇和苯氨基嘧啶类杀菌剂。

所述苯氨基嘧啶类杀菌剂优选为嘧霉胺。

所述制剂优选为甲醇溶液的形式。

所述甲醇溶液中，所述白藜芦醇的浓度可为5～1000mg/L，所述嘧霉胺的浓度可为0.3～88mg/L；

当所述制剂用于离体抑制灰霉病菌时，所述白藜芦醇的浓度可为5～160mg/L，当所述制剂用于活体(葡萄)抑制灰霉病菌时，所述白藜芦醇的浓度可为500～1000mg/L。

本发明还提供了白藜芦醇在防治葡萄灰霉病中的应用；

具体应用中，所述白藜芦醇与苯氨基嘧啶类杀菌剂联合使用；

具体应用中，将所述白藜芦醇和所述嘧霉胺的甲醇溶液接种至灰霉菌侵染前或侵染后的果实中；

所述甲醇溶液中，所述白藜芦醇的浓度可为500～1000mg/L，所述嘧霉胺的浓度可为0.3～88mg/L；

所述甲醇溶液的接种量可为5～10μL。

所述应用表现为抑制葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的菌丝生长和/或孢子萌发。

本发明通过离体及活体接种试验首次证明了白藜芦醇对葡萄灰霉病的防效，以及对苯氨基嘧啶类杀菌剂嘧霉胺在灰霉病菌抗性菌株的防治方面具有协同增效的作用。

本发明采用的白藜芦醇作为一种常见的植物提取物，绿色安全，有益于人体健康。其作为苯氨基嘧啶类杀菌剂嘧霉胺的协同增效剂，极大地降低了嘧霉胺的使用量，且对葡萄灰霉病具有显著防效。

附图说明

图1为白藜芦醇和嘧霉胺协同作用下对灰霉病菌孢子萌发的影响。

图2为白藜芦醇和嘧霉胺协同作用下对葡萄灰霉病的防效效果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的供试病原菌：供试葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea均分离至发病的葡萄果实，保存于马铃薯葡萄糖固体培养基(PDA)上。

下述实施例中所用的白藜芦醇试剂购自Sigma-Aldrich公司，纯度大于98％。

实施例1、白藜芦醇和嘧霉胺对灰霉病菌抗性菌株的最小抑菌浓度(MIC)

(1)分别将白藜芦醇和嘧霉胺溶解于甲醇中配制得到母液。

(2)加入不同体积母液至PDA培养基中使其达到预期的终浓度，同时保证各浓度处理下加入的甲醇体积一致，以加入等体积(0.8％，v/v)的甲醇作为对照。

(3)倒平板，在PDA平板中央接入直径为5mm的菌饼，于22℃的黑暗条件下培养。

(4)培养72h后测定菌落直径。

实验结果如表1所示：

表1白藜芦醇和嘧霉胺对灰霉病菌的最小抑菌浓度(MIC)

注：HR和MR分别代表高抗和中抗菌株。

实验结果表明：白藜芦醇和嘧霉胺混合使用后能够显著降低两种化合物的最小抑菌浓度(MIC)。

实施例2、白藜芦醇对嘧霉胺抑菌活性的协同增效作用

(1)参照LA模型对待测的两种药剂间的互作效果进行评估，以分级抑菌浓度指数(FICI)来表示。

(2)FICI＝FIC_白+FIC_嘧＝MIC_{白混合使用}/MIC_{白单独使用}+MIC_{嘧混合使用}/MIC_{嘧单独使用}；

(3)当FICI≤0.5时二者之间为协同增效作用，当0.5＜FICI≤4.0时二者之间为无关作用，当FICI＞4.0时二者之间为拮抗作用。

实验结果如表2所示：

表2白藜芦醇和嘧霉胺对灰霉病菌抑制作用的互作效果

注：HR和MR分别代表高抗和中抗菌株。

实验结果表明：白藜芦醇和嘧霉胺混合使用对灰霉病菌BGM、TGM、GMR和GBW抑制作用的互作效果均为协同增效作用，对灰霉病菌SGB抑制作用的互作效果为无关作用。

实施例3、白藜芦醇和嘧霉胺协同作用下对灰霉病菌孢子萌发的影响

(1)将葡萄灰霉病菌TGM于PDA培养基上培养5d，然后在平板中加入50％马铃薯葡萄糖培养液冲洗和振荡，配制孢子悬浮液(浓度为3×10⁴个/mL)。

(2)分别用白藜芦醇(40mg/L)、嘧霉胺(0.3125mg/L)及其组合处理灰霉病菌孢子悬浮液，以相同体积的甲醇处理作为试验对照。

(3)在22℃下培养不同时间(0、6、12、18和24h)后，测定各处理下孢子的萌发率。

试验结果如图1所示。

试验结果表明：随着培养时间的延长，各处理条件下的孢子的萌发率呈上升趋势，但是白藜芦醇和嘧霉胺混合处理下的孢子萌发率均低于对照和药剂单独使用下的萌发率，表明这两个药剂的混合使用后其协同增效作用能够显著抑制灰霉病菌孢子的萌发。

实施例4、白藜芦醇和嘧霉胺协同作用下对葡萄灰霉病的防效

供试材料：供试葡萄品种“无核红提”，购自市场。

将单粒葡萄果实人工分离，留有果蒂，选取大小、形状、成熟度一致的健康果粒于2％的次氯酸钠溶液中消毒2min，然后用无菌水冲洗2次，晾干后分组处理。

(1)用无菌接种针在果实赤道位置刺出一个深度2mm，直径为1.5mm的伤口。

(2)然后在每个果实的伤口处分别接入5μL白藜芦醇(1g/L)、嘧霉胺(50mg/L)和二者的混合液(1g/L白藜芦醇+50mg/L嘧霉胺)，以接入等体积的甲醇作为对照。

(3)于室温下自然晾干果实。

(4)将葡萄灰霉病菌于PDA培养基上培养5d后用无菌水冲洗，配制得到孢子悬浮液(浓度为6×10⁴个/mL)。

(5)再在伤口处接入5μL的灰霉病菌孢子悬浮液。

(6)将各浓度处理的果实分别置于塑料保鲜盒中，喷雾保湿，置于22℃贮藏。

(7)贮藏4d和7d后，观察并记录果实的发病率及病斑直径。

实验结果如表3和图2(7天后的照片)所示：

表3白藜芦醇和嘧霉胺对灰霉病菌的抑制效果

实验结果表明：白藜芦醇、嘧霉胺及其混合使用后均能显著降低葡萄果实灰霉病的发病率，但二者混合使用后对灰霉病的防效显著高于其单独使用的防效。接种结果表明这两个药剂的混合使用后其协同增效作用能够显著降低葡萄果实灰霉病的发生。